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UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN CRISTÓBAL

DE HUAMANGA
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
ESCUELA PROFESIONAL DE BIOLOGÍA

PROYECTO DE TESIS
Bromelina en cáscara de Annanas comosus “piña” con relación a la
madurez del fruto. Ayacucho, 2018.

PRESENTADO POR:
HUAMANÍ NÚÑEZ, Luis

Ayacucho – Perú
2018
I. GENERALIDADES
1. TÍTULO

Bromelina en cáscara de Annanas comosus “piña” con relación a la madurez del fruto.
Ayacucho, 2018.

2. PERSONAL INVESTIGADOR
2.1. Autor

HUAMANÍ NÚÑEZ, Luis estudiante de serie 500 de la Especialidad de Biotecnología


de la Escuela Profesional de Biología, Facultad de Ciencias Biológicas de la
Universidad Nacional de San Cristóbal de Huamanga.

2.2. Asesora

Blga. Sonia PALOMINO FELICES, Docente Asociada a dedicación exclusiva, adscrita


al Departamento Académico de Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional de San
Cristóbal de Huamanga.

3. TIPO DE INVESTIGACIÓN
Básica Descriptiva
4. RÉGIMEN DE INVESTIGACIÓN
Libre.
5. CRONOGRAMA DE TRABAJO
5.1. Tiempo de duración
04 meses
5.2. Fecha de inicio
Agosto 2018
5.3. Fecha probable de termino
Noviembre del 2018
5.4. Cronograma de actividades.

Meses/Año 2018
Actividades Oct. Nov. Dic. Ene.
Revisión bibliográfica x x x x
Implementación del proyecto x x x x
Recolección de la muestra de “Piña” x x
Identificación y estudio taxonómico Annanas x x
comosus”Piña”
Extracción y purificación de enzimas x x x
Unidad de Digestión de Gelatina (GDU) x x
Análisis e interpretación de datos x x
Redacción del informe final x
Exposición del informe final x

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6. RECURSOS DISPONIBLES
6.1. Recursos humanos
 Biólogos.
 Estudiantes de la EP de Biología
6.2. Recursos materiales
6.2.1. Materiales biológicos
 Annanas comosus “piña”
6.2.2. Materiales de laboratorio
 Una centrifuga de 10 000 rpm
 Micropipeta de 10 µL
 Micropipeta de 50 µL
 Micropipeta de 100 µL
 Micropipeta de 1 000 µL
 Incubadoras
 Tubos Falcon de 15 mL
 Tubos de PCR de 5 mL
 Matraz de 1000 mL
 Picetas
 Tela para filtrar
 Espectrofotómetro
 Baño María
 Autoclave
 Balanza analítica
 Embudo de filtración
 Gradillas
 estufa
 Refrigeradora
 Tubos de prueba
 Pipetas graduadas de 1 mL
 Pipetas graduadas de 2 mL
 Pipetas graduadas de 5 mL
 Pipetas graduadas de 10 mL
 Probetas de 50 mL
 Probetas de 100 mL
 Vasos de precipitado de 50 ml
 Vasos de precipitado de 100 ml
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6.2.3. Drogas y reactivos.
 Tampón de fosfato de sodio de 0,03 M de PH 7
 EDTA de 5 mM
 Etanol 70 %
 Albúmina de suero bovino (BSA) de 10 mg/mL
 Ácido clorhídrico (HCl) de 0,1 N y 0,2 N
 Cloruro de sodio (NaCl)
 Peróxido de hidrógeno de 30%
 Formaldehido de 37% de PH 9
 Hidróxido de sodio de 0,1 N
 Ácido acético
 Gelatina
 Sulfato de cobre pentahidratado
 Tartrato de sodio y potasio
 Yoduro de potasio
6.2.4. Otros
 Mortero y pilón
 Espátula pequeña
 Papel de filtro
 Cámara fotográfica
 Material de limpieza
7. PRESUPUESTO
2.3.15.12. Materiales de escritorio s/ 80,00
2.3.18.21. Equipos y Materiales de laboratorio s/ 22 000,00
2.3.15.31. Materiales de limpieza s/ 100,00
2.3.199.199. Materias primas s/ 2 000,00
2.3.199.199. Material fotográfico s/ 900,00
2.3.15.21. Frutos de piña s/ 540,00
2.3.27.1199. Otros servicios s/ 500,00
2.3.27.1199. Viáticos y Equipajes s/ 500,00
2.3.22.44. Impresión s/ 250,00
2.3.27.1199. Otros gastos s/ 180,00
Total s/ 27 050,00
8. FINANCIAMIENTO
UNSCH s/ 20 000, 00
Autofinanciado s/ 7 050, 00

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II. PLAN DE INVESTIGACIÓN
1. PROBLEMA CIENTÍFICO
1.1. Enunciado del problema.

¿Cuál será la concentración de bromelina activa obtenida de la cáscara de Annanas


comosus “piña” en relación al grado de madurez del fruto?

1.2. Definición y delimitación del problema.

El desarrollo de diversas técnicas de extracción y purificación de la bromelina son


conocidas en la actualidad por estudios realizados en los países productores de piña
como Brasil, India, China y otros; la piña hasta la fecha sería considerada como la
mejor fuente de la bromelina, este grupo de proteasas se ha demostrado para ser
absorbido en el tracto gastrointestinal y ser segura para los seres humanos.1

La bromelina fue aprobada en 1993 por el grupo de expertos de la Comisión Alemana


E para Fármacos y Dispositivos Médicos con el fin de tratar protuberancias e
inflamaciones de la nariz y senos paranasales debidas a lesiones y cirugías. No
obstante, aún faltan trabajos que confirmen su eficacia. Siendo la bromelina una
enzima proteolítica y ampliamente utilizado en alimentos, cosméticos y productos
farmacéuticos. Dentro de sus aplicaciones médicas, se ha informado de que la
bromelina tiene la capacidad de inhibir tanto la agregación plaquetaria y la proliferación
de diferentes células tumorales, además de su actividad antiinflamatoria,
antitrombótica, actividades antiedemateous y fibrinolíticos.2, 3 y 4

Hasta el momento en Europa se comercializa de dos formas: como aditivo para


ablandar carnes y como suplemento dietético. En el departamento de Ayacucho se
utiliza de manera empírica como saborizantes en preparados de alimentos (dietas
diarias), a pesar de todo, tanto en los mercados de Huamanga como en los mercados
de los distritos aledaños se desperdicia gran cantidad de cáscaras de Annanas
comosus “piña”, es por esta razón que se realizará el presente estudio respecto de la
extracción de bromelina en el departamento de Ayacucho.

Con el presente trabajo de investigación se busca dar el valor agregado a los residuos
de piña desperdiciados en Huamanga, extrayendo la bromelina activa. Para
comprobar si la bromelina activa se encuentra en mayor concentración en cáscaras de
annanas comosus “piña” pre-maduras, maduras o en pos-maduras, se extraerá de los
frutos provenientes del distrito de Pichari de la Provincia de Convención-Cusco.

5
2. MARCO TEÓRICO
2.1. Antecedentes del estudio.

2.1.1. Proteínas vegetales

El nombre de la proteína proviene del griego protos que significa “primero” o “más
importante”. Miranda y col en el 2012 en el manual de biología molecular resume,
que las proteínas son macromoléculas más abundantes de las células vivas, se
producen miles de diferentes clases y una gran variedad, mostrando una diversidad en
cuanto su función biológica, se almacenan en unidades denominadas genes en el
ácido desoxirribonucleico y se transcriben para formar diversos tipos de ácido
ribonucleico, y los ribosomas traducen el mensaje formando proteínas.5

Las proteínas vegetales según Salvador y col en el 2012 se hallan principalmente en


semillas de leguminosas, cereales, oleaginosas y en baja proporción en hojas verdes;
las plantas dependen de factores genéticos, climáticos y ecológicos; para producir
enzimas, hormonas, antibióticos y otros tipos de sustancias con actividades biológicas
distintas. La descripción del genoma de algunas plantas, permitió hallar más de 25,000
proteínas vegetales, tales como proteínas de bajo peso molecular ricas en inhibición
de alfa amilasa y albúminas 2S; así mismo cisteína-proteasa C1, que incluye a
enzimas como la papaína y la proteína alergénica de kiwi.6

Estudios realizados por Ramli y col en 2018 afirmaron, que las proteínas de annana
comosus “piña” perteneciente a la categoría de las frutas frescas, están formadas por
aminoácidos como ácido aspártico, ácido glutámico, alanina, arginina, cistina,
fenilalanina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, prolina, serina,
tirosina, treonina, triptofano y valina; mediante enlaces covalente constituyen
glicoproteínas del grupo cisteína–proteasa, llamados también endopeptidasas,
pudiendo ser C1A y C1B clasificado según la nomenclatura enzimática, forman una
cantidad de 0,44 g proteina por cada 100 g de muestra.7

2.1.2. Enzimas de origen vegetal

Todas las enzimas son proteínas pero no todas las proteínas son enzimas. Bolton en
el 2017; las enzimas vegetales como proteasas, lipasa, celulasa, carbohidrasa,
quimopapaína, papaína, bromelina, amilasa, sacarosa y maltasa; producidas por las
plantas, son proteínas y aminoácidos; cumplen diversos funciones en el desarrollo de
los vegetales tales como la germinación, resistencia a enfermedades, crecimiento de
la planta y la modificación de la pared celular; según Ramli y col en el 2018 la
bromelina de piña pertenecen al grupo de las endopeptidasas, las llamadas bromelina

6
del tallo, del fruto, ananaina y comasina; estas dos últimas representan apenas el 5% y
el 1% de las proteínas totales del extracto crudo del tallo respectivamente.7 y 8

Estudios realizados por Gallardo en el 2014 mostraron, que la piña contiene altos
niveles de una enzima llamada bromelina, lo cual es una enzima proteasa, lo que
significa que cataliza las proteínas apropiadas. En tanto Novaes y col en el 2016
afirman sobre el aislamiento y comercialización de esta enzima por empresas
herbarias, a partir de las diversas porciones no comestibles de annanas comosus
“piña”, estas compañías venden las enzimas en forma de pastillas en las tiendas de
alimentos orgánicos como anti-inflamatorio para los enfermos de artritis, ablandadoras
de carne.9 y 10

2.1.3. Actividad catalítica de la enzima

Abanto y col en el 2011 en un trabajo de investigación sobre obtención de bromelina


a partir de desechos industriales de annanas comosus “piña” en Trujillo-perú resume,
que Una enzima [E] para actuar sobre un sustrato [S] forma un complejo (E – S)
obteniendo como resultado (E – P); en tal proceso casi todas las reacciones que
tienen importancia desde un punto de vista biológico transcurren muy despacio si no
interviene un catalizador apropiado, tales catalizadores biológicos son las enzimas.11

Ramli y col en 2018 como se indicó en la página anterior la bromelina pertenece al


grupo de las endopeptidasas, las llamadas bromelina del tallo, del fruto, ananaina y
comasina; para Zela Moraya en el 2012, estas enzimas proteolítica encontrada en la
piña, tiene una afinidad hacia las cadenas polipetídicas perteneciente al grupo de
proteasas de cisteína, proteasas sulfhidrílicas o tiolproteasas, con un rango de pH
óptimo de 5 a 8 que varía con el sustrato y baja tolerancia térmica; asi mismo
Chinchilla Reyes en 2014 y Alvarado Paiz en el 2012 mencionan de bromelina
procedente de la fruta, con código numérico (EC 3.4.22.33); tiene aminoácidos
alrededor del centro activo Asn-Glx-Asn-Pro-Cys-Ala-Cys la cual presenta afinidad
hacia los aminoácidos Bz-Phe-Val-Arg-|-NHMe, que difieren respecto la bromelina del
tallo (EC 3.4.22.32) - (Z-Arg-Arg-|-NHMe).7, 12 , 13 y 14

Las características principales del mecanismo catalítico de bromelina investigado por


Matagne y col en el 2017 indicaron la formación de un intermediario covalente, la acil-
enzima, resultante del ataque nucleofílico que involucra a un residuo de cisteína,
histidina y asparagina formando lo que se conoce como una triada. El grupo tiol de la
cisteína actúa como nucleófilo, el mismo que se encuentra estabilizado a través de la
formación de un par iónico con el grupo vecino inmidazol de la histidina, siendo
entonces el nucleófilo atacante el par iónico tiolato-imidazol.15

7
Brullo Adriana en el 2003 sostiene sobre la unión (E-S) el ión imidazol ayuda a la
protonación del residuo del aminoácido resultante como producto, haciendo más fácil
la acilación, ahora el sustrato tiene un grupo carboxi terminal el cual se liberara del
complejo (E-P) por medio de una molécula de agua, produciendo la disociación de la
enzima y los nuevos compuestos. Coello y col en el 2013 resumen el papel de la
asparagina en la catálisis será redireccionar al imidazol de modo de colocarlo en
posición óptima para cada una de las distintas etapas del mecanismo catalítico.16 y 17

Por otro lado Clavijo y col en el 2012, llega a concluir que la caseína resultó ser un
sustrato por el cual la bromelina presenta gran afinidad. El enzima se comporta de
buena manera actuando a temperatura ambiente y pH 6. La velocidad máxima de
reacción alcanzada fue de 9,83e-4 para una concentración de enzima de 4,5e-5 M, y
concentraciones de sustrato (caseína) mayores de 1,6e-3M, condiciones de
concentración bajo las que el enzima se encuentra saturada, ya que la concentración
de sustrato es mucho mayor que la concentración de enzima.18

2.2. Bromelina de Annanas comosus “piña”

Vicente y col en el 2016, Ketnawa y col en el 2009 así mismo López y col en el
1996 Afirmaron que la bromelina es el nombre de la enzima proteolítica que se
encuentra en la planta de Ananas comosus “piña” principalmente, está presente en el
tallo y el fruto de la misma. La enzima extraída del tallo se llama bromelina del tallo con
el código numérico (EC 3.4.22.32, anteriormente EC 3.4.22.4) es la proteinasa más
abundante en las preparaciones de bromelina derivadas de los tallos de piña. La
bromelina del fruto clasificada con el código numérico EC 3.4.22.33, anteriormente EC
3.4.22.4 y 3.4.22.5) y ananain (EC 3.4.22.31), están presentes en cantidades menores
con respecto al tallo.1, 19 y 20

Estudio realizado por Hebbar y col en el 2008 indicó que la bromelina también está
presente en los desechos de la piña, como el núcleo, la cáscara, la corona y las hojas
en cantidades relativamente más pequeñas en comparación con los del tallo. Pero la
actividad de bromelina en los extractos crudos de desechos variaba y aumentaba la
actividad en extractos de núcleo y corona.21

Así mismo en las definiciones de, Hebbar y col en 2008, Salvador en el 2006,
Coelho y col en el 2014 Concuerdan que la bromelina es una glucoproteína que
contiene manosa, xilosa, fucosa y N-acetil-D-glucosamina, con un peso molecular
33,000 Da y pH óptimo de 5 a 8. Piñero en el 2009, wan y col en el 2015 Indicaron
con mayor exactitud que la bromelina es una mezcla de endopeptidasas de cisteína y

8
se compone principalmente de bromelina del tallo (80%), fruta (10%) y la ananaína
(5%), en la que el tallo de la piña es rica.2, 3, 21, 22 y 23

Cabe destacar investigaciones realizadas por Gallardo y col en el 2008 en México.


Indica que la Bromelina actúa sobre otras proteínas, como la caseina, hemoglobina,
gelatina15. Por otro lado Hernandez y Col en el 2003 que el pH de actividad óptima
es bastante amplio (de 4.5 a 9.5), pero su óptimo está generalmente entre 6 y 7.5. El
producto de bromelina aislado es muy activo y estable, con una fracción proteolítica
mayoritaria de masa molar de 24 500 Da, pH óptimo cercano a 7 frente a hemoglobina
y buena estabilidad en un rango de pH de 3 a 9 y temperaturas de hasta 50ºC.24 y 25
Quinde F y col en el 2013 Concluyeron, que la actividad proteolítica, de las enzimas
vegetales de tipo proteasa mejora el rendimiento en la producción de alimentos, con
un control exacto del producto final y una disminución de los residuos. Destacando el
rendimiento de la bromelina semipurificada obtenida en la etapa de secado, es de
0,018 g de extracto seco/g extracto semipurificado y el rendimiento final de todo el
proceso indica que para obtener 1 Kg de bromelina se necesita 19,24 Kg de corazón
de piña.26
Kulpreet y col en el 2011 Indica sobre el empleo de la bromelina en la industria
farmacéutica en el tratamiento de trastornos digestivos, inflamaciones, infecciones,
contra la celulitis, y el cáncer. Para demostrar la actividad antitumoral de bromelina
Hernandez y Col en 2003 estudiaron preparado de bromelina semipurificado por
cromatografía de intercambio iónico en carboximetil celulosa-52, para realizar un
estudio toxicológico y farmacológico del producto como antitumoral. Frente al
adenocarcinoma mamario-755 se demostró por primera vez en el mundo la actividad
antitumoral de la bromelina.25 y 27
En el campo de la industria de los alimentos Ketnawa y col en el 2011 afirma sobre la
utilización de bromelina como ablandador de carnes, fabricación de quesos,
preparación de alimentos infantiles, suplementos dietéticos, pre tratamiento soya,
tratamiento de pescados y otros productos marinos como la producción de salsa de
ostras; fabricación de galletas, sustituto de los sulfitos empleados para impedir el
pardeamiento de los jugos de frutos y del vino blanco, para la clarificación de la
cerveza, tratamiento del cuero, en la industria textil tratamiento de lana y seda.28
2.3. Aspectos botánicos

2.3.1. Ananas comosus “piña”

La piña pertenece a la familia Bromeliaceae, es una planta herbácea, perenne y


monocotiledónea. Crecen de 1 a 1,5 metros de extensión, está formada por una roseta
de hojas duras, lanceoladas y más o menos espinosas, organizadas alrededor de un

9
tallo que constituye el eje de la planta. La inflorescencia contiene entre cien y
doscientas flores colocadas en forma espiral, fusionadas al eje central. La floración se
prolonga entre treinta y sesenta días aproximadamente; el fruto maduro se obtiene
ciento treinta y cinco días después de haber emergido la flor.29, 30 y 31

La piña ha obtenido un incremento en el mercados de las frutas debido a la demanda


de consumo por alimentos saludables, es por ello que la piña es la fruta tropical de
mayor demanda en el mundo, por su agradable sabor y alto contenido de fibra, pero,
sobre todo porque es una fuente importante de vitaminas C, B1, B6, ácido fólico y
minerales como el potasio. Se la conoce por ser una fruta diurética que contribuye a la
eliminación de toxinas por medio de la orina y que previene el estreñimiento porque
contiene gran cantidad de fibra.32

La Piña una planta con elevado porcentaje de agua, apenas grasa, baja en calorías y
rico en bromelaína, una enzima proteolítica digestiva que actúa como sustitutivo de los
jugos gástricos, mejora la digestión y destruye los parásitos intestinales es también
utilizada en la industria alimenticia, como ablandador de carnes. Gracias a esta enzima
se ejerce una acción normalizadora sobre la secreción y superficie alterada de las
mucosas inflamadas, por lo que se la emplea en los males de la garganta y la boca.4,
21, 27, 31 y 32

2.3.2. Origen de Ananas comosus “piña”

La piña de nombre científico Ananas comosus L. tiene como origen a América del Sur
ya que no se conoce con certeza el país de procedencia pero por su domesticación se
cree que puede ser de una zona entre Brasil y Uruguay, de donde se propago a otro
países del continente y posteriormente a Europa y Asia. La piña era aparentemente
domesticada por los indígenas y llevada por ellos a través de Centro y Sudamérica a
México y las Indias Occidentales, expandiéndose más con la llegada de los europeos
a España e Inglaterra; los últimos 100 años, la piña se ha convertido en uno de los
principales cultivos frutícolas comerciales de los trópicos.32 y 33

2.3.3. Taxonomía de Ananas comosus “piña” Merr., 1917.31

Reino : Plantae
División : Magnoliophita
Clase : Liliopsida
Subclase : Commelinidae
Orden : Poales
Familia : Bromeliaceae

10
Subfamilia : Bromelioideae
Género : Ananas
Especie : A. comosus
Nombre vulgar : “piña”
Nombres populares: “Pineapple”, “Ananas”, “Nanas”, “Piña”.

2.3.4. Descripción botánica de Ananas comosus “piña”

Planta de la familia Bromeliácea, forma un Raíz muy superficial, generalmente las


raíces se localizan en los primeros 15 cm del horizonte del suelo; dos sistemas de
raíces están comúnmente asociados con el crecimiento de la piña, las raíces del suelo
y las axilares; las raíces del suelo proporcionan las raíces adventicias del tallo, tiene
una extensión lateral de 1-2 m y penetra a profundidades de más de 80 cm. 31, 33 y 34

El tallo tiene de 20-30cm de largo, es angosto en la base y más ancho en la punta; la


base es curva en los esquejes, pero en otros propagulos es recta. La región apical del
tallo comprende el meristemo terminal con su cúpula de tejidos no diferenciados y con
tejidos merístematicos especializados, insertados entre lo alto del cilindro central y la
corteza en formación y que dan nacimiento al tejido vascular.34

Las hojas son largas y angostas, arregladas en espiral sobre un tallo corto, formando
una “roseta” se forman de 70-80 hojas y presentan una yema en la axila de cada una;
algunas yemas crecen formando brotes o hijuelos todas las demás permanecen
latentes. Los brotes se encuentran entre las hojas, un vástago o hijuelo parece brotar
del suelo y posee raíces.35

La inflorescencia contiene 100 ó 200 flores individuales dispuestas entre sí, donde
cada flor dará origen a un fruto pequeño. Las flores son de color rosa y tres pétalos
que crecen en las axilas de unas brácteas apuntadas, siendo numerosas y se agrupan
en inflorescencias en espiga de unos 30 cm. de longitud y de tallo engrosado. Las
flores dan fruto sin necesidad de fecundación, en el ovario hipógino se desarrollan
unos frutos en forma de baya, que conjuntamente con el eje de la inflorescencia y las
brácteas, dan lugar a una infrutescencia carnosa (sincarpico).34 y 36

El fruto tiene forma cilíndrica, globosa; llega a pesar hasta cuatro kilos, mide en
promedio unos 30 cm. de altura, con un diámetro de 15 cm, con peso alrededor de los
2 Kg. El color de su pulpa es amarillo o blanco, que madura su fruto a los 18 ó 22
meses después de plantada. Cada planta produce una sola fruta compuesta sobre su
vástago central.36

11
2.3.5. Composición química Ananas comosus “piña”
La piña presenta una variación muy grande en su composición química, de acuerdo
con la época en la que se produce; si se cultiva en verano con temperaturas elevadas,
presentaran mayor azúcar y menor acidez, comparadas con frutas fuera de época;
presenta un 66% de sacarosa y un 34% de azúcares reductores como glucosa y
fructuosa, con una acidez de 0.79 a 1.11%. Estudios también afirman que los
Principios activos se duplican en las últimas semanas de maduración, por lo que los
frutos recolectados prematuramente resultan ácidos y pobres en nutrientes. Si ha sido
bien madurada contiene alrededor del 11 % de hidratos de carbono.17, 26 y 35

En cuanto a minerales, destacan en cantidad el potasio, magnesio, cobre y


manganeso; por otro lado las vitaminas más abundantes de la piña son la vitamina C
y, en menor cantidad, B1 y la B6; la piña tiene los componentes no nutritivos tales
como ácidos orgánicos, cítrico y málico, responsables de su sabor ácido; Contiene
nitrógeno total en la cantidad de 500 mg/l, y en pequeñas porción de forma orgánica,
como proteínas, péptidos, aminoácidos; cabe mencionar aquí la presencia de la
bromelina, una enzima proteolítica que se encuentran mayoritariamente en el cilindro
central.17 y 37

La piña Contiene bromelina, enzima o fermento de acción proteolítica, capaz de


romper las moléculas de proteína dejando libres los aminoácidos que las forman. La
bromelina es una cisteína-proteasa soluble en agua pero insoluble en solvente
orgánico, aislada y purificada de órganos de Ananas comosus “pina”.2, 3, 19, 25 y 38

12
Este cuadro de composición química de piña fue extraído de17.

2.3.6. Propiedades y funciones

La bromelina del fruto es una cistein-proteasa de carácter ácido, se trata de una


glucoproteína aparentemente homogénea, que hidroliza enlaces peptídicos, la cual se
encuentra conformada por un residuo amino terminal, la valina y su carboxilo terminal,
la glicina. La enzima se encuentra constituida por los aminoácidos: Arginina, Ácido
Aspártico, Serina, Prolina, Alanina, Valina, Glicina, Metionina y Glucosamina.18 y 38

Sus aplicaciones con fines alimenticios y terapéuticos son muy variadas. Se utiliza en
la obtención de hidrolizados de proteínas, en la alimentación animal y humana, el
ablandamiento de carnes y la fabricación de cervezas. Como medicamento se emplea
con éxito como antiinflamatorio, digestivo, en la formulación de vacunas y el
tratamiento de tumores. Está incluida en el grupo de fármacos inmunomoduladores.25 y
39

En la industria farmacéutica se emplea como digestivo en el tratamiento de dispepsias,


como antiinflamatorio y como antiedematoso, en tratamientos contra las infecciones,
en tratamientos contra la celulitis, la forunculosis, la ulcerosis, los edemas
postoperatorios y también en tratamientos contra el cáncer. En el laboratorio se usa en
la fabricación de peptonas, que formarán parte de medios de cultivo, en la producción
de aminoácidos y péptidos y en el estudio de la composición de las proteínas.14 y 40
2.4. Métodos de extracción de enzimas

La primera etapa en la extracción de una proteína es su liberación de las células que


la contienen, que puede ser por ruptura mecánica de las células vegetales se pueden
mencionar: 1) trituración con arena, 2) trituración en mezclador de alta velocidad, 3)
homogeneizador a pistón, 4) prensa francesa, 5) sonicación y 6) congelación con
nitrógeno líquido y macerado (LLORENTE, 2000).39 y 41

Con la finalidad de prevenir la proteólisis durante la extracción es recomendable


utilizar algunos técnicas desarrolladas específicamente para extraer moléculas
biológicas que son: 1) extraer con buffer que contenga EDTA, 2) extraer con TCA frío
al 10 % (p/v), 3) adicionar un cóctel de inhibidores de peptidasas al buffer de
extracción, 4) trabajar a baja temperatura durante períodos cortos de tiempo1, 3, 21 y 42

Cuando los procesos de extracción se minimisa la temperatura a 4°c disminuye la


desnaturalización de la enzima y reduci la actividad de las proteasas. Pero existen las
literaturas que mencionan, la exposición de la enzima a bajas temperaturas puede dar
lugar a la inactivación debido a la cristalización del solvente, 5) usar buffers de pH por

13
encima o por debajo del óptimo, 6) adicionar agentes crioprotectores como dimetil
sulfóxido (10 %, v/v) o glicerol (25 % v/v) o agentes reductores como ditiotreitol (1Mm),
L-cisteína (5 Mm) o β-mercaptoetanol (1Mm), 7) adicionar agentes quelantes como
EDTA (2 Mm) para remover cationes bivalentes que son cofactores de
metalopeptidasas y de varias peptidasas serínicas.39 y 43

2.4.1. Extracción alcohólica

El proceso de extracción alcohólica consiste en la transferencia de una sustancia


orgánica denominada etanol a un sustrato miscible o parcialmente miscibles, al
ponerlos en contacto, a estas dos sustancias se mesclen. Este proceso es
ampliamente utilizado en la recuperación de los ácidos orgánicos a partir de caldos de
fermentación. Sin embargo, la aplicación en la purificación de proteínas es todavía
limitado principalmente debido a la posibilidad de desnaturalización de la proteína en
contacto con disolventes orgánicos, obteniéndose un producto inútil.17, 43 y 44

La temperatura tiene un efecto importante en el proceso de extracción de


biomoléculas, principalmente cuando se usa etanol como solvente. Para evitar la
desnaturalización de la bromelina por el etanol, se han realizado estudios para evaluar
la temperatura variación con el tiempo cuando se añade etanol al sistema. La variación
de temperatura en el medio acuoso en función del tiempo de contacto con el etanol,
que al realizar una única aplicación de 90% (v / v) de etanol, la temperatura más alta
fue de 5,2 C. Dentro de aproximadamente 2 minutos después de la adición de etanol,
la temperatura fue de 1.0°C, y adecuada para la precipitación sin desnaturalización de
la bromelina.45

La adición de etanol en una sola aplicación puede conducir a la desnaturalización de


enzimas formando '' bolsillos '' de etanol en la solución, incluso si la temperatura está
por debajo del temperatura crítica (> 10.0 C). Por esta razón, la adición de etanol se
realiza con tres aplicaciones consecutivas durante 2 min. Los resultados indicaron que
con la adición de Etanol al 20% (v / v) (0 min), la temperatura más alta registrada fue
4.8°C. Después de 1.0 min, la temperatura disminuyó a 2.2°C y cuando la
concentración de etanol se completó al 50% (v / v), la más alta la temperatura alcanzó
3.7°C, una reducción del 21.0% de la temperatura después de la adición de la primera
alícuota de etanol. Al final de 2.0 min, la temperatura disminuyó a 1.7°C y cuando el
etanol la concentración se completó al 90% (v / v), la temperatura continuó
disminuyendo hasta 0.1°C en aproximadamente 7.0 min, cuando estabilizado.44 y 45

En un intento de mejorar el proceso de extracción de la bromelaína, la prueba de


precipitación se realizó en dos pasos, la fracción de F30-70% (v / v). Los resultados

14
mostraron que era posible extraer toda la bromelina (100.0%) permite un aumento en
el factor de purificación de 1.18-2.28, así como un aumento de 2-3 veces en la inicial
actividad específica, que es bastante considerable para una técnica con un bajo poder
de purificación, como en esta precipitación. También se observó que hubo una gran
reducción de aproximadamente 99.4% en el nivel de contenido de carbohidratos
(14.43-0.08 mg / mL), uno de los principales contaminantes en el extracto crudo de
piña, que corresponde a aproximadamente 35-40% de las impurezas totales.
Creciente por cien veces la purificación de la escala de la fracción de 30-70% (v / v) de
la bromelina precipitada con etanol, fue posible recuperar 18.33 mg de bromelina con
un rendimiento de actividad del 99.2% de su actividad inicial.46
2.4.2. Sales: Fosfato de Sodio Monobásico y Dibásico

El fosfato de sodio monobásico, conocido como fosfato sodio dihidrogenado, tiene una
masa molar de 137, 99 g/mol y su fórmula molecular es de NaH2PO4 H2O. Su
disolución en agua es lenta, siendo necesario calentar el sistema para la disolución
total de sal a altas concentraciones. El fosfato dibásico de sodio anhidro tiene una
masa molar de 171,18 g/mol y su fórmula molecular es de Na2HPO4. Presenta cinética
de disolución en agua más rápida que la sal monobásica.47

2.5. Métodos de medición de concentración de proteína


2.5.1. Químicos

48
Reacción de Kjeldahl: Considerado históricamente como el método referencia

El método de Biuret es la técnica más simple para la determinación de proteínas


solubles. Las sustancias que contienen dos o más enlaces peptídicos forman un
complejo púrpura-violeta con sales de cobre (II) alcalinas. Es posible que el color se
desarrolle por la formación de un ion coordinado, tetracúprico, con dos grupos amida
adyacentes 26 y 48

El desarrollo del color es diferente para cada proteína y su intensidad se puede


determinar espectroscópicamente a 540 nm. La intensidad de coloración es
directamente proporcional a la cantidad de proteínas (enlaces peptídicos) y la reacción
es bastante específica, de manera que pocas sustancias interfieren. La cuantificación
de la proteína se lleva a cabo con una curva patrón, utilizando el principio establecido
por la ley de Beer 49.

Existen pocas interferencias en esta determinación; entre ellas, la presencia del ion
amonio altera el desarrollo del color; algunos pigmentos absorben a la misma longitud

15
de onda, algunos lípidos y carbohidratos son capaces de formar complejos con el ion
coordinado.26 y 49

La curva de patrón es un método de química analítica empleado para medir la


concentración de una sustancia en una muestra por comparación con una serie de
elementos de concentración conocida. Se basa en la existencia de una relación en
principio lineal entre un carácter medible (la absorbancia en los enfoques de
espectrofotometría) y la variable a determinar (la concentración). Para ello, se efectúan
diluciones de unas muestras de contenido conocido y se produce su lectura y el
consiguiente establecimiento de una función matemática que relacione ambas;
después, se lee el mismo carácter en la muestra problema y, mediante la sustitución
de la variable independiente de esa función, se obtiene la concentración de esta. Se
dice pues que la respuesta de la muestra puede cuantificarse y, empleando la curva
patrón, se puede interpolar el dato de la muestra problema hasta encontrar la
concentración.49 y 50

Método de Lowry: Se basa en la reducción del reactivo de Folin-Ciocalteau provocada


por el complejo unión peptídico-Cu2+ en medio alcalino. La formación del complejo
coloreado entre el Cu2+ y los nitrógenos de los enlaces peptídicos se da por la
reacción de Biuret, luego para resaltar el color formado en esta reacción y aumentar la
sensibilidad, se hace reaccionar posteriormente con el reactivo de Folin-Ciocalteau
que al ser reducido por los residuos de aminoácidos aromáticos tirosina y triptófano,
da un color azulado 26, 48 y 50

Método de BCA: El ácido bicinconínico, sal sódica, es un compuesto capaz de formar


un complejo púrpura intenso con inones Cu1+ en medio alcalino. Este reactivo forma
la base de un método analítico capaz de monitorizar el ión cuproso producido en una
reacción entre las proteínas con Cu2+ en medio alcalino (reacción de Biuret).

Método de Bradford: Es una técnica sensible que consiste en la medición de la


extinción provocada por el cambio en el espectro visible de un colorante (Coomasie
Blue G-250) cuando éste se une a las proteínas (absorbiendo así a 595 nm). Esta
unión se realiza a través de grupos ionizados y se comprueba proporcionalidad con la
concentración de proteínas contenidas en la muestra. El colorante cambia de color de
marrón a azul al unirse a proteínas. Este método es sensible (1-15 μg), simple, rápido,
barato y pocas sustancias interfieren en su determinación. Entre las sustancias que
interfieren están los detergentes y las soluciones básicas.26, 31, 48 y 51

16
La determinación del contenido proteico de una muestra requiere la comparación del
valor de su absorbancia con los obtenidos a partir de cantidades conocidas de
proteínas, con los que se construye una curva de calibración.51

2.6. Métodos de medición de actividad enzimática

La cantidad de enzima en una muestra expresada en moles, o cuantificadas en


términos de actividad enzimática. La actividad enzimática es una medida de la
cantidad de enzima activa presente y del nivel de actividad de la misma, por lo que es
una medida dependiente de las condiciones de trabajo, mismas que se deben
especificar cuándo se dan los valores de actividad. Existen diferentes métodos para la
determinación de la actividad de una enzima, el método aplicado está dado por el
sustrato y mecanismo de acción que tenga la enzima como: el ensayo de coágulo de
la leche, el cual se basa en una determinación subjetiva del tiempo de coagulación, y
aquellos métodos que proporcionan resultados utilizando un espectrofotómetro.26 y 52

Existen tres métodos para la determinación de la actividad proteolítica. Primer método


basada en la técnica de Sörensen, conocido como titulación formólica. Por este
método se mide directamente la hidrólisis de una proteína-substrato realizada por una
cantidad conocida de enzima. Los substratos usuales son la caseína o la gelatina. Es
el más exacto, pero el menos usado debido a su poca funcionabilidad.

Segundo método basada su propiedad bioactiva de la enzima para coagular la leche,


conocido como el método de Balls y Hoover, este método toma como índice de
actividad proteolítica, el tiempo necesario para que una cantidad conocida de enzima
coagule un determinado volumen de solución de leche, y la actividad se expresa en
[25]
términos de unidades de leche coagulada por g de preparado enzimático . Es un
método impreciso, depende mucho del tipo de leche utilizada y cantidad de proteína
presente en la misma

Tercer método, se basa en la hidrólisis de proteínas y tiene como base el método de


Anson, el cual consiste en cuantificar la cantidad de producto formado por la proteólisis
enzimática de un sustrato proteico, como la caseína y la hemoglobina. En esta técnica,
se detiene la reacción de hidrólisis, mediante la adición de una solución de ácido
tricloroacético (TCA) a la mezcla de reacción, de modo que precipitan tanto el sustrato
aun sin degradar, como la enzima, mientras que los péptidos resultantes se mantienen
estables en la solución (SINCHE, 2009). .El sustrato utilizado es diferente en cada
método, siendo imposible la comparación de resultados de diferentes laboratorios y
trabajos realizados.26

17
2.6.1. Unidades enzimáticas

Definir la unidad enzimática es necesario para poder expresar en forma cuantitativa, la


pureza y la actividad de las diversas fracciones obtenidas durante la purificación. La
acción enzimática se mide determinando la cantidad de sustrato consumido, de
producto formado o el número de las acciones elementales realizadas por unidad de
tiempo lógicamente en condiciones estandarizadas (MACARULLA, 1992). Así, se
define como unidad internacional de actividad enzimática, U, a la cantidad de enzima
necesario para transformar un micromol de sustrato por minuto, a 25°C y en
condiciones definidas. La actividad específica es el número de unidades
internacionales por mg de proteína (U/mg proteína) o por ml de disolución (U/ml).
Estas mediciones pueden realizarse sin haber conseguido la purificación completa o el
aislamiento previo de la enzima.17 y 52

La enzima Bromelina se encuentra en el mercado por las siguientes actividades: En


unidades Rorer, unidades FIP, BTU (unidades de tirosina de la bromelina), CDU
(unidades de digestión de caseína), GDU (unidades de digestión de gelatina) o MCU
(unidades de coagulación de leche). Una unidad Rorer de actividad de proteasa se
define como la cantidad de enzima que hidroliza un sustrato de caseína de
estandarización a pH 7 y 25°C para provocar un incremento en la absorbencia de
0,00001 por minuto a 280 nm. Una unidad FIP de actividad de bromelina está
contenida en la cantidad de una preparación estándar que hidroliza una preparación
adecuada de caseína (controlada por FIP) bajo las condiciones estándar a una
velocidad inicial tal que se libera por minuto una cantidad de péptido, no precipitado
por un reactivo de precipitación de proteínas específico, que da la misma absorbencia
que 1 umol de tirosina a 275 nm. Las BTUs, CDUs, GDUs y MCUs son como se
definen en la literatura, como sigue.52

BTU: Una unidad de tirosina de la bromelina es la cantidad de enzima que liberará un


micromol de tirosina por minuto bajo las condiciones del ensayo (por ejemplo, después
de la digestión de un sustrato de hemoglobina desnaturalizada con ácido a pH 5 y
30°C). GDU: La actividad de enzima que libera un miligramo (10-3 g) de nitrógeno
amónico de una solución de gelatina estándar después de 20 minutos de digestión a
45°C y a pH 4,5. CDU: La cantidad de enzima que liberará un microgramo de tirosina
después de un minuto de digestión a 37 °C a partir de un sustrato de caseína estándar
a pH 7,0. Unidad de Coagulación de Leche (MCU/mg): Se basa en la hidrólisis
proteolítica de un sustrato de leche tamponada a 40°C, la actividad enzimática está

18
relacionada con el tiempo requerido para coagular 25 ml de sustrato. La actividad
enzimática se compara siempre con una enzima estándar.52

3. IDENTIFICACIÓN DE VARIABLES
3.1. Variable independiente
Cáscaras de frutos de Annanas comosus “piña”.

Indicadores
Concentración pura de bromelina de la cáscara de frutos: pre-maduro, maduro y post
maduro.
3.2. Variable dependiente
La bromelina cruda
Indicadores
Hidrólisis proteolítica.
4. HIPÓTESIS
El extracto de cáscaras de Annanas comosus “piña” tiene mayor concentración de
bromelina activa en estado pos-maduro.

5. OBVETIVOS
5.1. Objetivo general.
Evaluar la enzima bromelina en la cáscara de la piña en etapas de pre-maduro,
maduro y post-maduro.

5.2. Objetivos específicos


 Extraer la bromelina por extracción alcohólica
 Evaluar la actividad enzimática por hidrólisis de gelatina
 Determinar Km y Vmax de la bromelina
6. DICEÑO METODOLÓGICO
6.1. Tipo de investigación

Básica descriptiva

6.2. Definición de la población y la muestra.

Población: Cáscara de Annanas comosus “pina” del distrito de Pichari de la


Provincia de Convención del Departamento de Cusco.

Muestra. 15 unidades de cáscara de fruto de Annanas comusos “piña” de variedad


hawaiana con tamaño mediano clasificados en inmaduras, maduras y pos-maduras;
que serán identificados en los Laboratorios de Botánica de la Facultad de Ciencias
Biológicas de la Universidad Nacional de San Cristóbal de Huamanga.

19
6.3. Métodos instrumentales

Se recolectarán 15 unidades de fruto de Annanas comusos “pina” de diferentes


grados de madurez, que serán identificados en los Laboratorios de Botánica de la
Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional de San Cristóbal de
Huamanga.

6.3.1. Preparación de extracto crudo

La extracción se realizará mediante el método.3 y 45 con algunas modificaciones. Para


preparar el extracto crudo, la cáscara se separará manualmente de la fruta, se pesará
la cáscara extraída y se aplastará con tampón de extracción (tampón fosfato de sodio
0,03 M de pH 7,0 conteniendo EDTA 5 mM) en una relación de 1: 1 por 5 min y
después se filtrará a través de una tela o gasa. El filtrado se centrifugará a 10.000 rpm
por 25 min y el sobrenadante obtenido se guardará para utilizar en los experimentos
de extracción alcohólica.

6.4. Procedimiento experimental


6.4.1. Extracción de bromelina mediante precipitación con etanol.

Se realizará mediante la precipitación con etanol. Extracción etanólica (Extracto


enzimático bruto / tampón) y orgánica (Etanol 70 %)

1. Se medirá en un tubo tipo Falcon de 15 mL en relación de volumen 1: 2 para el


extracto enzimático bruto / tampón (conocido como extracto crudo) y orgánica
(Etanol 70%) respectivamente.
2. Se procederá por centrifugación a 10 000 rpm por 40 min.
3. La extracción hacia atrás será llevada a cabo mediante la mezcla de etanol
sobrenadante obtenida de la primera extracción en relación de 2: 1 con respecto
al extracto crudo fresca
4. La mezcla luego se centrifugará a 10 000 rpm por 35 min
5. Se separará el sobrenadante con una micropipeta de 1000 µL a un tubo limpio, y
el precipitado se resolubilizará en 1,0 ml de tampón de fosfato de sodio (0,03 M,
pH 7.0) de tal manera será almacenada a -18°C hasta su posterior análisis.
6. El precipitado obtenido y resolubilizada, se analizará después de la extracción
hacia atrás para la actividad de la bromelina y el contenido total de proteínas.

6.4.2. Medición del contenido de proteínas

La determinación de proteína total del extracto se realizará mediante el método de


Biuret modificado por Robinson.50

20
1. Se seleccionará la longitud de onda en el espectro fotómetro de máximo de
absorción del compuesto a medir con el mando correspondiente (554 nm).
2. Se tomará una cubeta del espectrofotómetro y se verterá en la cubeta un volumen
de la solución blanco, reactivo tal que ocupe las tres cuartas partes del volumen
de la cubeta (2,5 mL).
3. Se colocará la cubeta en el compartimento de cubetas del espectrofotómetro,
procurando que las paredes lisas de la misma se coloquen en la dirección del haz
de luz del espectrofotómetro.
4. Se realizará el ajuste del cero de absorbancia.
5. Se tomará aproximadamente 2,5 mL de muestra objetivo en cada cubeta para
luego medir la absorbancia del extracto crudo, extracto purificado.

La recta de calibración de la reacción de Biuret será obtenida de la siguiente


manera.50

1. Se colocarán en una gradilla 10 tubos de ensayo, se adicionará a cada uno de


ellos los volúmenes de la disolución patrón de albúmina de suero bovino (BSA 10
mg/ ml) y de agua destilada.
2. A cada uno de los tubos de ensayo se añadirán 3 ml de reactivo de Biuret y se
agitarán en vórtex
3. Se introducirán los tubos en baño María a 37ºC, dejándose que se desarrolle el
color durante 15 min.
4. Se enfriarán los tubos de ensayo y se procederán a medir en el
espectrofotómetro.
5. Se ajustará el cero de absorbancia con la solución blanco exenta de proteína
(tubo 1).
6. Se medirán las absorbancias de los tubos 2 a 8 de la solución menos concentrada
a la más concentrada.

6.4.3. Determinación de la actividad enzimática

Para determinar el componente activo de la Bromelina se utilizará gelatina como


método analítico de la unidad de digestión (GDU). La prueba a realizar es la hidrólisis
proteolítica de sustrato de gelatina. Se realizará mediante el método de Enzyme
Development Corporation. Con algunas modificaciones a lo largo del proceso.52

a. Reactivos y preparaciones de reactivos:

a.1. Agua destilada

Aproximadamente 500 ml: se ajustará a un pH de 4,5 con 0,1 N de HCl.

21
a.2. Sustrato de gelatina

 Se disolverá 25 gramos de gelatina en 375 ml de agua caliente, se llevará a


ebullición. se enfriará a 45°C.
 Se ajustará el pH a 4,5 con HCl 0,1 N y se diluirá a 500 ml con agua destilada de
pH 4,5.
 Se mantendrá el sustrato de gelatina a 45°C.

a.3. Solución buffer

 Se añadirá 15 g de NaCl lentamente a 40-50 ml de agua en un vaso de


precipitados de 150 ml y se agitará para disolver.
 Se agregará 0,570 ml de ácido acético.
 Se ajustará el pH a 4,5 con 0,2 N HCL (el volumen será mayor a 100 ml)

a.4. 3% de peróxido de hidrógeno

 Se pipeteará 2,5 ml de peróxido de hidrógeno al 30% (solución madre) en una


fiola de 25 ml y se diluirá a volumen con agua destilada de pH 4,5

a.5. 37% de formaldehído pH 9,0

 Ajustar un volumen suficiente (100 ml) de formaldehído a pH 9,0 con NaOH 0,1 N
(aproximadamente 20 ml de formaldehído por muestra antes del ajuste del pH)
a.6. NaOH 0,1N: (Comprado estandarizado)
 Solución madre: estandarizada a 0,1 N

b. Procedimiento:

b.1. Preparación de la enzima

 Cálculo de la preparación enzimática Peso = 100 / Actividad objetivo


(aproximadamente 0,05 g o 50 mg)
 Pesar la enzima con precisión en un matraz volumétrico de 50 ml
 Agregue 8,3 ml de solución buffer. luego. Dejar reposar durante 30 minutos a
temperatura ambiente.
 Se Diluirá a 50 ml con agua destilada de pH 4,5; se agregará una pequeña barra
agitadora y agitar durante 10 a 15 min adicionales

b.2. Procedimiento de la enzima

22
 Se pipeteará 25 ml de sustrato de gelatina en cada uno de los dos vasos de 100
ml que contienen barras de agitación y se colocará en un baño de agua a 45°C
durante 5 min, uno para la solución de prueba y el otro para la solución en blanco.

b.3. Solución de prueba

 Se agregará 1,0 ml de solución de bromelina en el vaso designado para la


solución de prueba, se encenderá el cronometro y girar.
 Después de exactamente 20 minutos de incubación a 45°C, se agregará 0,1 ml de
peróxido de hidrógeno al 3 % y girar.
 Incubar durante 5 minutos adicionales.
 Se retirará el vaso de precipitado del baño de agua y, con agitación constante,
inserte la sonda de pH.
 Registre el pH después de 10 segundos (pH inicial)
 Ajuste a pH 6,0 con NaOH 0,1 N. (Aproximadamente 2-4 ml)
 Continuando con la agitación constante, se agregará 10 ml de formaldehído al
37% pH 9,0.
 Se registrará el pH después de 10 segundos y 1 minuto.
 Se valorará a pH 9,0 con 0,1N de NaOH.
 Se registrará el volumen de titulación. Este es el título de la prueba, T.

c.4. Solución en blanco

La solución en blanco se ejecutará al mismo tiempo que la solución de prueba. Esto se


logrará iniciando la determinación de la Solución en blanco 12 minutos después de
que se inicia la Solución de prueba. Eso le da tiempo para completar el ensayo en la
Solución de prueba antes de tener que continuar con la Solución en blanco.

 Se agregará 0,1 ml de peróxido de hidrógeno al 3% al vaso designado para la


solución en blanco y agitar.
 Después de exactamente 20 min de incubación a 45°C, se agregará 1,0 ml de
solución de bromelina y agite.
 Incubar durante 5 min adicionales.
 Retire el vaso de precipitados del baño de agua y, con agitación constante, inserte
la sonda de pH.
 Registre el pH después de 10 seg (pH inicial)
 Ajuste a pH 6,0 con NaOH 0,1 N. (Aproximadamente 2-4 ml) * Ver la nota anterior.
7) Continuando con la agitación constante, agregue 10 ml de formaldehído al 37%
pH 9,0.

23
 Registre el pH después de 10 seg y 1 min.
 Valorar a pH 9,0 con 0,1 N de NaOH.
 Registre el volumen de titulación. Este es el título en blanco, B.

d. Cálculo

 Definición: Una unidad de digestión de gelatina es la cantidad de enzima que


liberará, después de 20 min de digestión a 45°C, 1 mg de nitrógeno amino de una
solución de gelatina estándar a pH 4,5 o pH 5,5 (GDU pH 4,5 o pH 5,5).

(𝑇 − 𝐵) 𝑥 14 𝑥 𝑁 𝑥 50
𝐺𝐷𝑈/𝑔 =
𝑊𝑡(𝑔)

Dónde:

T = título de prueba (ml 0,1 N NaOH)

B = título en blanco (ml 0,1 N NaOH)

N = Normalidad de NaOH estandarizado (es decir, 0,100)

Peso (g) = peso inicial de la enzima

e. Parámetros de prueba:

Las preparaciones enzimáticas se diluyen a una concentración de aproximadamente


0,001 g / ml (1 mg / ml) o para bromelina concentra aproximadamente 1-2 GDU / ml.
Un material de referencia se analiza con cada ejecución para garantizar la precisión
del método.

6.4.4. Tratamientos
Se realizarán tres tratamientos, cada tratamiento con 5 repeticiones.
1. Tratamiento I
25 mL etanol + 25 mL de extracto enzimático bruto / tampón de Pi
2. Tratamiento II
25 mL de etanol+ 25 mL de extracto enzimático bruto / tampón de Pm
3. Tratamiento III
25 mL de etanol + 25 mL de extracto enzimático bruto / tampón de Pp
Pi: piña inmaduro (cáscaras)

Pm: piña madura (cáscaras)

Pp: piña post–maduro (cáscaras)


24
extracto enzimático bruto / tampón de
Tratamiento Etanol Gelatina Annanas comusos “piña”
pre-maduro madura Post-maduro
Blanco x
Estándar X x
Muestra problema I x x
Muestra problema II x x
Muestra problema III x x

7. ANALISIS ESTADISTICO

Los datos obtenidos serán introducidos en un ordenador y se realizara la interpretación


estadística mediante el análisis de varianza, así como también la prueba de tuckey con
95% de confianza para saber la concentración significativa de Bromelaina activa
obtenida.

25
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30
9. ANEXOS.

Ananas comosus “Piña”


Extraer cáscara de piña Pesar la cáscara extraída y
lavar con etanol 70% y
manualmente. añadir tampón fosfato de sodio
enjuagar con agua destilada
0,03 M de pH 7,0 conteniendo
EDTA 5 mM en una relación de
1: 1

Dispensar en Tubos Falcon Filtrar a través de una Triturar cáscara por


de 50 mL de extracto gasa 5 min.
enzimático crudo (CE).
Centrifugar y guardar
sobrenadante -18°C

Centrifugar a 10 000 rpm Extraer sobrenadante y


Colocar 3 mL de (CE) agregar extracto cruda fresca
añadir 6 mL de etanol por 40 min a 4°C
al 70%

Refrigerar a -18°C Descartar sobrenadante y


hasta posterior añadir 1,0 ml de tampón de
análisis de proteínas fosfato de sodio (0,03 M,
y la actividad pH 7.0) al precipitado
enzimática
Centrifugar a 10 000 rpm
por 35 min a 4°C

Figura 1. Procedimiento para la extracción de bromelina activa


Elaborado por: Huamaní Núñez, Luis

31
Determinación de la actividad enzimática

Figura 2: procedimientos para determinar la actividad enzimática.


Elaborado por: Huamaní Núñez, Luis

32
MATRIZ DE COSISTENCIA
TÍTUL PROBLEMA OBJETIVOS MARCO TEÓRICO HIPÓTESIS VARIABLES METODOLOGÍA
O
Bromelina ¿Cuál Objetivo general 2.1. Antecedentes del estudio. La cáscara de Variable Investigación
independient
en cáscara será la Evaluar la 2.1.1. Proteínas vegetales Annanas Básica
e
de concentrac bromelina en la Las proteínas son macromoléculas de células vivas, almacenadas en comosus Cáscaras de descriptiva.
Annanas ión de la cáscara de la piña genes. En las plantas se hallan en cereales, hojas verdes; y depende “piña” tiene frutos de Población.
comosus bromelina en etapas de pre- de factores genéticos, climáticos y ecológicos, para producir mayor Annanas Piñas
“piña” con activa maduro, maduro y proteinas.5 y 6 concentración comosus provenientes del
relación a obtenida post-maduro. 2.1.2. Enzimas de origen vegetal de bromelina “piña”. distrito de Pichari
la de la Objetivos Las enzimas vegetales como proteasas, papaína, bromelina, etc. son activa en Indicadores seleccionadas
madurez cáscara de específicos proteínas y aminoácidos. La bromelina de piña son glicoproteínas, estado post-  Pre-maduro como inmaduro,
del fruto. Annanas  Extraer la pertenecen al grupo de cesteina proteasas, llamadas maduro.  Maduro maduro y pos
Ayacucho, comosus bromelina por endopeptidasas; clasificados como bromelina del tallo, fruto,  Post- maduras.
2018. “piña” en extracción ananaina y comasina.7 y 8 La piña contiene altos niveles de maduro Muestra.
relación al alcohólica bromelina, aisladas, purificadas y vendidas en forma de pastillas, Variable Constituida por 15
dependiente
grado de  Evaluar la anti-inflamatorio, ablandadoras de carne.7, 9 y 10 frutos en total.
Bromelina
madurez actividad 2.1.3. Actividad catalítica de la enzima Divididos en 5
cruda
del fruto? enzimática por Una enzima [E] para actuar sobre un sustrato [S] forma un complejo piñas como
Indicadores
hidrólisis de (E – S) obteniendo como resultado (E – P); en tal proceso interviene inmaduros, 5
Actividad
gelatina un catalizador apropiado-enzimas.11 Las enzimas proteolítica como la piñas como
proteolítica
 Determinar Km bromelina de piña, tiene una afinidad hacia las cadenas polipetídicas maduros y 5 piñas
y Vmax de la perteneciente al grupo de proteasas de cisteína, proteasas como pos-
bromelina sulfhidrílicas o tiolproteasas.7, 12, 13 y La caseína es un sustrato por el maduros.
cual la bromelina presenta afinidad, a temperatura ambiente y pH 6; Estadístico
Vmax de reacción 9,83e-4, [ ] de enzima de 4,5e-5 M y [ ] de sustrato ANOVA
(caseína) mayores de 1,6e-3M. 15, 16, 17 y 18

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