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DE HUAMANGA
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
ESCUELA PROFESIONAL DE BIOLOGÍA
PROYECTO DE TESIS
Bromelina en cáscara de Annanas comosus “piña” con relación a la
madurez del fruto. Ayacucho, 2018.
PRESENTADO POR:
HUAMANÍ NÚÑEZ, Luis
Ayacucho – Perú
2018
I. GENERALIDADES
1. TÍTULO
Bromelina en cáscara de Annanas comosus “piña” con relación a la madurez del fruto.
Ayacucho, 2018.
2. PERSONAL INVESTIGADOR
2.1. Autor
2.2. Asesora
3. TIPO DE INVESTIGACIÓN
Básica Descriptiva
4. RÉGIMEN DE INVESTIGACIÓN
Libre.
5. CRONOGRAMA DE TRABAJO
5.1. Tiempo de duración
04 meses
5.2. Fecha de inicio
Agosto 2018
5.3. Fecha probable de termino
Noviembre del 2018
5.4. Cronograma de actividades.
Meses/Año 2018
Actividades Oct. Nov. Dic. Ene.
Revisión bibliográfica x x x x
Implementación del proyecto x x x x
Recolección de la muestra de “Piña” x x
Identificación y estudio taxonómico Annanas x x
comosus”Piña”
Extracción y purificación de enzimas x x x
Unidad de Digestión de Gelatina (GDU) x x
Análisis e interpretación de datos x x
Redacción del informe final x
Exposición del informe final x
2
6. RECURSOS DISPONIBLES
6.1. Recursos humanos
Biólogos.
Estudiantes de la EP de Biología
6.2. Recursos materiales
6.2.1. Materiales biológicos
Annanas comosus “piña”
6.2.2. Materiales de laboratorio
Una centrifuga de 10 000 rpm
Micropipeta de 10 µL
Micropipeta de 50 µL
Micropipeta de 100 µL
Micropipeta de 1 000 µL
Incubadoras
Tubos Falcon de 15 mL
Tubos de PCR de 5 mL
Matraz de 1000 mL
Picetas
Tela para filtrar
Espectrofotómetro
Baño María
Autoclave
Balanza analítica
Embudo de filtración
Gradillas
estufa
Refrigeradora
Tubos de prueba
Pipetas graduadas de 1 mL
Pipetas graduadas de 2 mL
Pipetas graduadas de 5 mL
Pipetas graduadas de 10 mL
Probetas de 50 mL
Probetas de 100 mL
Vasos de precipitado de 50 ml
Vasos de precipitado de 100 ml
3
6.2.3. Drogas y reactivos.
Tampón de fosfato de sodio de 0,03 M de PH 7
EDTA de 5 mM
Etanol 70 %
Albúmina de suero bovino (BSA) de 10 mg/mL
Ácido clorhídrico (HCl) de 0,1 N y 0,2 N
Cloruro de sodio (NaCl)
Peróxido de hidrógeno de 30%
Formaldehido de 37% de PH 9
Hidróxido de sodio de 0,1 N
Ácido acético
Gelatina
Sulfato de cobre pentahidratado
Tartrato de sodio y potasio
Yoduro de potasio
6.2.4. Otros
Mortero y pilón
Espátula pequeña
Papel de filtro
Cámara fotográfica
Material de limpieza
7. PRESUPUESTO
2.3.15.12. Materiales de escritorio s/ 80,00
2.3.18.21. Equipos y Materiales de laboratorio s/ 22 000,00
2.3.15.31. Materiales de limpieza s/ 100,00
2.3.199.199. Materias primas s/ 2 000,00
2.3.199.199. Material fotográfico s/ 900,00
2.3.15.21. Frutos de piña s/ 540,00
2.3.27.1199. Otros servicios s/ 500,00
2.3.27.1199. Viáticos y Equipajes s/ 500,00
2.3.22.44. Impresión s/ 250,00
2.3.27.1199. Otros gastos s/ 180,00
Total s/ 27 050,00
8. FINANCIAMIENTO
UNSCH s/ 20 000, 00
Autofinanciado s/ 7 050, 00
4
II. PLAN DE INVESTIGACIÓN
1. PROBLEMA CIENTÍFICO
1.1. Enunciado del problema.
Con el presente trabajo de investigación se busca dar el valor agregado a los residuos
de piña desperdiciados en Huamanga, extrayendo la bromelina activa. Para
comprobar si la bromelina activa se encuentra en mayor concentración en cáscaras de
annanas comosus “piña” pre-maduras, maduras o en pos-maduras, se extraerá de los
frutos provenientes del distrito de Pichari de la Provincia de Convención-Cusco.
5
2. MARCO TEÓRICO
2.1. Antecedentes del estudio.
El nombre de la proteína proviene del griego protos que significa “primero” o “más
importante”. Miranda y col en el 2012 en el manual de biología molecular resume,
que las proteínas son macromoléculas más abundantes de las células vivas, se
producen miles de diferentes clases y una gran variedad, mostrando una diversidad en
cuanto su función biológica, se almacenan en unidades denominadas genes en el
ácido desoxirribonucleico y se transcriben para formar diversos tipos de ácido
ribonucleico, y los ribosomas traducen el mensaje formando proteínas.5
Estudios realizados por Ramli y col en 2018 afirmaron, que las proteínas de annana
comosus “piña” perteneciente a la categoría de las frutas frescas, están formadas por
aminoácidos como ácido aspártico, ácido glutámico, alanina, arginina, cistina,
fenilalanina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, prolina, serina,
tirosina, treonina, triptofano y valina; mediante enlaces covalente constituyen
glicoproteínas del grupo cisteína–proteasa, llamados también endopeptidasas,
pudiendo ser C1A y C1B clasificado según la nomenclatura enzimática, forman una
cantidad de 0,44 g proteina por cada 100 g de muestra.7
Todas las enzimas son proteínas pero no todas las proteínas son enzimas. Bolton en
el 2017; las enzimas vegetales como proteasas, lipasa, celulasa, carbohidrasa,
quimopapaína, papaína, bromelina, amilasa, sacarosa y maltasa; producidas por las
plantas, son proteínas y aminoácidos; cumplen diversos funciones en el desarrollo de
los vegetales tales como la germinación, resistencia a enfermedades, crecimiento de
la planta y la modificación de la pared celular; según Ramli y col en el 2018 la
bromelina de piña pertenecen al grupo de las endopeptidasas, las llamadas bromelina
6
del tallo, del fruto, ananaina y comasina; estas dos últimas representan apenas el 5% y
el 1% de las proteínas totales del extracto crudo del tallo respectivamente.7 y 8
Estudios realizados por Gallardo en el 2014 mostraron, que la piña contiene altos
niveles de una enzima llamada bromelina, lo cual es una enzima proteasa, lo que
significa que cataliza las proteínas apropiadas. En tanto Novaes y col en el 2016
afirman sobre el aislamiento y comercialización de esta enzima por empresas
herbarias, a partir de las diversas porciones no comestibles de annanas comosus
“piña”, estas compañías venden las enzimas en forma de pastillas en las tiendas de
alimentos orgánicos como anti-inflamatorio para los enfermos de artritis, ablandadoras
de carne.9 y 10
7
Brullo Adriana en el 2003 sostiene sobre la unión (E-S) el ión imidazol ayuda a la
protonación del residuo del aminoácido resultante como producto, haciendo más fácil
la acilación, ahora el sustrato tiene un grupo carboxi terminal el cual se liberara del
complejo (E-P) por medio de una molécula de agua, produciendo la disociación de la
enzima y los nuevos compuestos. Coello y col en el 2013 resumen el papel de la
asparagina en la catálisis será redireccionar al imidazol de modo de colocarlo en
posición óptima para cada una de las distintas etapas del mecanismo catalítico.16 y 17
Por otro lado Clavijo y col en el 2012, llega a concluir que la caseína resultó ser un
sustrato por el cual la bromelina presenta gran afinidad. El enzima se comporta de
buena manera actuando a temperatura ambiente y pH 6. La velocidad máxima de
reacción alcanzada fue de 9,83e-4 para una concentración de enzima de 4,5e-5 M, y
concentraciones de sustrato (caseína) mayores de 1,6e-3M, condiciones de
concentración bajo las que el enzima se encuentra saturada, ya que la concentración
de sustrato es mucho mayor que la concentración de enzima.18
Vicente y col en el 2016, Ketnawa y col en el 2009 así mismo López y col en el
1996 Afirmaron que la bromelina es el nombre de la enzima proteolítica que se
encuentra en la planta de Ananas comosus “piña” principalmente, está presente en el
tallo y el fruto de la misma. La enzima extraída del tallo se llama bromelina del tallo con
el código numérico (EC 3.4.22.32, anteriormente EC 3.4.22.4) es la proteinasa más
abundante en las preparaciones de bromelina derivadas de los tallos de piña. La
bromelina del fruto clasificada con el código numérico EC 3.4.22.33, anteriormente EC
3.4.22.4 y 3.4.22.5) y ananain (EC 3.4.22.31), están presentes en cantidades menores
con respecto al tallo.1, 19 y 20
Estudio realizado por Hebbar y col en el 2008 indicó que la bromelina también está
presente en los desechos de la piña, como el núcleo, la cáscara, la corona y las hojas
en cantidades relativamente más pequeñas en comparación con los del tallo. Pero la
actividad de bromelina en los extractos crudos de desechos variaba y aumentaba la
actividad en extractos de núcleo y corona.21
Así mismo en las definiciones de, Hebbar y col en 2008, Salvador en el 2006,
Coelho y col en el 2014 Concuerdan que la bromelina es una glucoproteína que
contiene manosa, xilosa, fucosa y N-acetil-D-glucosamina, con un peso molecular
33,000 Da y pH óptimo de 5 a 8. Piñero en el 2009, wan y col en el 2015 Indicaron
con mayor exactitud que la bromelina es una mezcla de endopeptidasas de cisteína y
8
se compone principalmente de bromelina del tallo (80%), fruta (10%) y la ananaína
(5%), en la que el tallo de la piña es rica.2, 3, 21, 22 y 23
9
tallo que constituye el eje de la planta. La inflorescencia contiene entre cien y
doscientas flores colocadas en forma espiral, fusionadas al eje central. La floración se
prolonga entre treinta y sesenta días aproximadamente; el fruto maduro se obtiene
ciento treinta y cinco días después de haber emergido la flor.29, 30 y 31
La Piña una planta con elevado porcentaje de agua, apenas grasa, baja en calorías y
rico en bromelaína, una enzima proteolítica digestiva que actúa como sustitutivo de los
jugos gástricos, mejora la digestión y destruye los parásitos intestinales es también
utilizada en la industria alimenticia, como ablandador de carnes. Gracias a esta enzima
se ejerce una acción normalizadora sobre la secreción y superficie alterada de las
mucosas inflamadas, por lo que se la emplea en los males de la garganta y la boca.4,
21, 27, 31 y 32
La piña de nombre científico Ananas comosus L. tiene como origen a América del Sur
ya que no se conoce con certeza el país de procedencia pero por su domesticación se
cree que puede ser de una zona entre Brasil y Uruguay, de donde se propago a otro
países del continente y posteriormente a Europa y Asia. La piña era aparentemente
domesticada por los indígenas y llevada por ellos a través de Centro y Sudamérica a
México y las Indias Occidentales, expandiéndose más con la llegada de los europeos
a España e Inglaterra; los últimos 100 años, la piña se ha convertido en uno de los
principales cultivos frutícolas comerciales de los trópicos.32 y 33
Reino : Plantae
División : Magnoliophita
Clase : Liliopsida
Subclase : Commelinidae
Orden : Poales
Familia : Bromeliaceae
10
Subfamilia : Bromelioideae
Género : Ananas
Especie : A. comosus
Nombre vulgar : “piña”
Nombres populares: “Pineapple”, “Ananas”, “Nanas”, “Piña”.
Las hojas son largas y angostas, arregladas en espiral sobre un tallo corto, formando
una “roseta” se forman de 70-80 hojas y presentan una yema en la axila de cada una;
algunas yemas crecen formando brotes o hijuelos todas las demás permanecen
latentes. Los brotes se encuentran entre las hojas, un vástago o hijuelo parece brotar
del suelo y posee raíces.35
La inflorescencia contiene 100 ó 200 flores individuales dispuestas entre sí, donde
cada flor dará origen a un fruto pequeño. Las flores son de color rosa y tres pétalos
que crecen en las axilas de unas brácteas apuntadas, siendo numerosas y se agrupan
en inflorescencias en espiga de unos 30 cm. de longitud y de tallo engrosado. Las
flores dan fruto sin necesidad de fecundación, en el ovario hipógino se desarrollan
unos frutos en forma de baya, que conjuntamente con el eje de la inflorescencia y las
brácteas, dan lugar a una infrutescencia carnosa (sincarpico).34 y 36
El fruto tiene forma cilíndrica, globosa; llega a pesar hasta cuatro kilos, mide en
promedio unos 30 cm. de altura, con un diámetro de 15 cm, con peso alrededor de los
2 Kg. El color de su pulpa es amarillo o blanco, que madura su fruto a los 18 ó 22
meses después de plantada. Cada planta produce una sola fruta compuesta sobre su
vástago central.36
11
2.3.5. Composición química Ananas comosus “piña”
La piña presenta una variación muy grande en su composición química, de acuerdo
con la época en la que se produce; si se cultiva en verano con temperaturas elevadas,
presentaran mayor azúcar y menor acidez, comparadas con frutas fuera de época;
presenta un 66% de sacarosa y un 34% de azúcares reductores como glucosa y
fructuosa, con una acidez de 0.79 a 1.11%. Estudios también afirman que los
Principios activos se duplican en las últimas semanas de maduración, por lo que los
frutos recolectados prematuramente resultan ácidos y pobres en nutrientes. Si ha sido
bien madurada contiene alrededor del 11 % de hidratos de carbono.17, 26 y 35
12
Este cuadro de composición química de piña fue extraído de17.
Sus aplicaciones con fines alimenticios y terapéuticos son muy variadas. Se utiliza en
la obtención de hidrolizados de proteínas, en la alimentación animal y humana, el
ablandamiento de carnes y la fabricación de cervezas. Como medicamento se emplea
con éxito como antiinflamatorio, digestivo, en la formulación de vacunas y el
tratamiento de tumores. Está incluida en el grupo de fármacos inmunomoduladores.25 y
39
13
encima o por debajo del óptimo, 6) adicionar agentes crioprotectores como dimetil
sulfóxido (10 %, v/v) o glicerol (25 % v/v) o agentes reductores como ditiotreitol (1Mm),
L-cisteína (5 Mm) o β-mercaptoetanol (1Mm), 7) adicionar agentes quelantes como
EDTA (2 Mm) para remover cationes bivalentes que son cofactores de
metalopeptidasas y de varias peptidasas serínicas.39 y 43
14
mostraron que era posible extraer toda la bromelina (100.0%) permite un aumento en
el factor de purificación de 1.18-2.28, así como un aumento de 2-3 veces en la inicial
actividad específica, que es bastante considerable para una técnica con un bajo poder
de purificación, como en esta precipitación. También se observó que hubo una gran
reducción de aproximadamente 99.4% en el nivel de contenido de carbohidratos
(14.43-0.08 mg / mL), uno de los principales contaminantes en el extracto crudo de
piña, que corresponde a aproximadamente 35-40% de las impurezas totales.
Creciente por cien veces la purificación de la escala de la fracción de 30-70% (v / v) de
la bromelina precipitada con etanol, fue posible recuperar 18.33 mg de bromelina con
un rendimiento de actividad del 99.2% de su actividad inicial.46
2.4.2. Sales: Fosfato de Sodio Monobásico y Dibásico
El fosfato de sodio monobásico, conocido como fosfato sodio dihidrogenado, tiene una
masa molar de 137, 99 g/mol y su fórmula molecular es de NaH2PO4 H2O. Su
disolución en agua es lenta, siendo necesario calentar el sistema para la disolución
total de sal a altas concentraciones. El fosfato dibásico de sodio anhidro tiene una
masa molar de 171,18 g/mol y su fórmula molecular es de Na2HPO4. Presenta cinética
de disolución en agua más rápida que la sal monobásica.47
48
Reacción de Kjeldahl: Considerado históricamente como el método referencia
Existen pocas interferencias en esta determinación; entre ellas, la presencia del ion
amonio altera el desarrollo del color; algunos pigmentos absorben a la misma longitud
15
de onda, algunos lípidos y carbohidratos son capaces de formar complejos con el ion
coordinado.26 y 49
16
La determinación del contenido proteico de una muestra requiere la comparación del
valor de su absorbancia con los obtenidos a partir de cantidades conocidas de
proteínas, con los que se construye una curva de calibración.51
17
2.6.1. Unidades enzimáticas
18
relacionada con el tiempo requerido para coagular 25 ml de sustrato. La actividad
enzimática se compara siempre con una enzima estándar.52
3. IDENTIFICACIÓN DE VARIABLES
3.1. Variable independiente
Cáscaras de frutos de Annanas comosus “piña”.
Indicadores
Concentración pura de bromelina de la cáscara de frutos: pre-maduro, maduro y post
maduro.
3.2. Variable dependiente
La bromelina cruda
Indicadores
Hidrólisis proteolítica.
4. HIPÓTESIS
El extracto de cáscaras de Annanas comosus “piña” tiene mayor concentración de
bromelina activa en estado pos-maduro.
5. OBVETIVOS
5.1. Objetivo general.
Evaluar la enzima bromelina en la cáscara de la piña en etapas de pre-maduro,
maduro y post-maduro.
Básica descriptiva
19
6.3. Métodos instrumentales
20
1. Se seleccionará la longitud de onda en el espectro fotómetro de máximo de
absorción del compuesto a medir con el mando correspondiente (554 nm).
2. Se tomará una cubeta del espectrofotómetro y se verterá en la cubeta un volumen
de la solución blanco, reactivo tal que ocupe las tres cuartas partes del volumen
de la cubeta (2,5 mL).
3. Se colocará la cubeta en el compartimento de cubetas del espectrofotómetro,
procurando que las paredes lisas de la misma se coloquen en la dirección del haz
de luz del espectrofotómetro.
4. Se realizará el ajuste del cero de absorbancia.
5. Se tomará aproximadamente 2,5 mL de muestra objetivo en cada cubeta para
luego medir la absorbancia del extracto crudo, extracto purificado.
21
a.2. Sustrato de gelatina
Ajustar un volumen suficiente (100 ml) de formaldehído a pH 9,0 con NaOH 0,1 N
(aproximadamente 20 ml de formaldehído por muestra antes del ajuste del pH)
a.6. NaOH 0,1N: (Comprado estandarizado)
Solución madre: estandarizada a 0,1 N
b. Procedimiento:
22
Se pipeteará 25 ml de sustrato de gelatina en cada uno de los dos vasos de 100
ml que contienen barras de agitación y se colocará en un baño de agua a 45°C
durante 5 min, uno para la solución de prueba y el otro para la solución en blanco.
23
Registre el pH después de 10 seg y 1 min.
Valorar a pH 9,0 con 0,1 N de NaOH.
Registre el volumen de titulación. Este es el título en blanco, B.
d. Cálculo
(𝑇 − 𝐵) 𝑥 14 𝑥 𝑁 𝑥 50
𝐺𝐷𝑈/𝑔 =
𝑊𝑡(𝑔)
Dónde:
e. Parámetros de prueba:
6.4.4. Tratamientos
Se realizarán tres tratamientos, cada tratamiento con 5 repeticiones.
1. Tratamiento I
25 mL etanol + 25 mL de extracto enzimático bruto / tampón de Pi
2. Tratamiento II
25 mL de etanol+ 25 mL de extracto enzimático bruto / tampón de Pm
3. Tratamiento III
25 mL de etanol + 25 mL de extracto enzimático bruto / tampón de Pp
Pi: piña inmaduro (cáscaras)
7. ANALISIS ESTADISTICO
25
8. BIBLIOGRAFÍA
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30
9. ANEXOS.
31
Determinación de la actividad enzimática
32
MATRIZ DE COSISTENCIA
TÍTUL PROBLEMA OBJETIVOS MARCO TEÓRICO HIPÓTESIS VARIABLES METODOLOGÍA
O
Bromelina ¿Cuál Objetivo general 2.1. Antecedentes del estudio. La cáscara de Variable Investigación
independient
en cáscara será la Evaluar la 2.1.1. Proteínas vegetales Annanas Básica
e
de concentrac bromelina en la Las proteínas son macromoléculas de células vivas, almacenadas en comosus Cáscaras de descriptiva.
Annanas ión de la cáscara de la piña genes. En las plantas se hallan en cereales, hojas verdes; y depende “piña” tiene frutos de Población.
comosus bromelina en etapas de pre- de factores genéticos, climáticos y ecológicos, para producir mayor Annanas Piñas
“piña” con activa maduro, maduro y proteinas.5 y 6 concentración comosus provenientes del
relación a obtenida post-maduro. 2.1.2. Enzimas de origen vegetal de bromelina “piña”. distrito de Pichari
la de la Objetivos Las enzimas vegetales como proteasas, papaína, bromelina, etc. son activa en Indicadores seleccionadas
madurez cáscara de específicos proteínas y aminoácidos. La bromelina de piña son glicoproteínas, estado post- Pre-maduro como inmaduro,
del fruto. Annanas Extraer la pertenecen al grupo de cesteina proteasas, llamadas maduro. Maduro maduro y pos
Ayacucho, comosus bromelina por endopeptidasas; clasificados como bromelina del tallo, fruto, Post- maduras.
2018. “piña” en extracción ananaina y comasina.7 y 8 La piña contiene altos niveles de maduro Muestra.
relación al alcohólica bromelina, aisladas, purificadas y vendidas en forma de pastillas, Variable Constituida por 15
dependiente
grado de Evaluar la anti-inflamatorio, ablandadoras de carne.7, 9 y 10 frutos en total.
Bromelina
madurez actividad 2.1.3. Actividad catalítica de la enzima Divididos en 5
cruda
del fruto? enzimática por Una enzima [E] para actuar sobre un sustrato [S] forma un complejo piñas como
Indicadores
hidrólisis de (E – S) obteniendo como resultado (E – P); en tal proceso interviene inmaduros, 5
Actividad
gelatina un catalizador apropiado-enzimas.11 Las enzimas proteolítica como la piñas como
proteolítica
Determinar Km bromelina de piña, tiene una afinidad hacia las cadenas polipetídicas maduros y 5 piñas
y Vmax de la perteneciente al grupo de proteasas de cisteína, proteasas como pos-
bromelina sulfhidrílicas o tiolproteasas.7, 12, 13 y La caseína es un sustrato por el maduros.
cual la bromelina presenta afinidad, a temperatura ambiente y pH 6; Estadístico
Vmax de reacción 9,83e-4, [ ] de enzima de 4,5e-5 M y [ ] de sustrato ANOVA
(caseína) mayores de 1,6e-3M. 15, 16, 17 y 18
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34