INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS

BIOLÓGICAS

LABORATORIO DE MÉTODOS DE
ANÁLISIS

PRÁCTICA:
“DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIAD DE
ENZIMS PROTEOLÍTICAS. MÉTODO DE
KUNITZ”
OBJETIVOS
 Establecer una curva de actividad enzimática estándar.
 Determinar la actividad enzimática de la bromelaína y la papaína (enzimas
proteolíticas) a partir de una curva estándar de actividad enzimática de la
Tripsina.
 Determinar cuál de las enzimas empleadas tienen mayor actividad
enzimática sobre el mismo sustrato.
RESULTADOS
Tabla 1. Datos para la curva de Actividad enzimática de la Tripsina y de los Problemas de
las enzimas a determinar su actividad.

Conc. de Tripsina A280 A280

Tubo (mg/mL) corregida
Problema Testigo
T1 y 1 0.04 0.221 0.049 0.172
T2 y 2 0.08 0.367 0.051 0.316
T3 y 3 0.12 0.455 0.059 0.396
T4 y 4 0.16 0.549 0.054 0.495
T5 y 5 0.2 0.588 0.067 0.521
Problemas
TI y I Bromelaína 1:10 0.727 0.44 0.287
TII y II Bromelaína 1:20 0.417 0.269 0.148
Tlll y lll Papaína 1:2 1.147 0.331 0.818
TlV y IV Papaína 1:4 0.681 0.216 0.465
 Unidades Trípticas: Pendiente de la recta = 2.6225 = 0.1311 UT/mg
20 min. 20 min.

Tabla 2. Datos para la Curva de actividad enzimática específica para la digestión de

caseína por tripsina

Unidades A280
Tubo
Trípticas. corregida
1 0.005245 0.172
2 0.01049 0.316
3 0.015735 0.396
4 0.02098 0.495
Tabla 3. UT/g de muestra en piña y
papaya (bromelaína y papaína, respectivamente)

UT UT/g de muestra:
Bromelaína 1:10 0.010225 0.12679
Bromelaína 1:20 0.003275 0.08122
Papaína 1:2 0.036775 0.064724
Papaína 1:4 0.019125 0.06732

Cálculos:
Absorbancia corregida: A280 problema - A280 testigo  0.221 – 0.049 = 0.172

Unidades trípticas: 2.6225/20 min. = 0.1311 UT/mg de tripsina

1 mg de tripsina  0.131 UT
0.4 mg tripsina  0.0052 UT

A partir de la ecuación e la recta de la curva de actividad enzimática específica,

obtenemos:
y = 20x + 0.0825
Para obtener las UT de muestra despejamos “x” de la ecuación anterior:
x = y – 0.0825/20 donde “y” es la A280 corregida de las diluciones de bromelaína y
papaína, entonces, por ejemplo para el tubo con solución de papaína 1:2:
x = 0.818-0.0825/20 = 0.036 UT

Después, para los UT/g muestra:

Considerando el valor anterior de UT, el factor de dilución, el volumen del extracto y el
peso de la muestra:
UT/g muestra: [UT] (Factor de dil.) (Vol. De extracto) = [0.036](2)(22mL) = 0.0647 UT/g muestra:
Gramos de muestra 25 g.

DISCUSIONES

El uso de los tubos testigos es principalmente el de tener tubos sin actividad

enzimática para poder comparar pero además nos pueden ayudar a detectar la
presencia de sustancias que absorban a 280 nm y que se encuentren presentes
antes y después de la hidrólisis de la caseína. Dichas sustancias afectan la lectura
de absorbancia, debido a que después de realizar la hidrólisis en los tubos
problema, la solución absorberá como si ésta tuviera una cantidad de proteína
mayor a la que pusimos. Por lo tanto debe obtenerse una absorbancia corregida,
siendo esta la diferencia entre la absorbancia del problema y la absorbancia del
testigo, lo anterior se hace con la finalidad de obtener resultados experimentales
más confiables.
A través de una curva de actividad enzimática realizada con tripsina sobre caseína
se puede utilizar para conocer la actividad proteolítica de otras enzimas como la
papaína y bromelaína, puesto que los datos de dicha curva son independientes de
la enzima proteolítca utilizada sobre el sustrato (en este caso caseína) siempre y
cuando se mantengan las mismas condiciones para la determinación (pH = 7.6, T =
35ºC).
Para la elaboración de las curva de actividad enzimática y act. Enzimática específica
no se tomó en cuenta la absorbancia de los tubos T5 y 5, pues al graficarlo se
observaba que ese dato ya no cumplía con la tendencia líneal que nosotros
requeríamos para elaborar la curva tipo.
Comparando los valores de UT de la tripsina con los de las enzimas que estudiamos,
observamos que éstas tienen una mayor actividad proteolítica (hidrolizan más a la
caseína), puesto que el valor de UT calculados son mayores a los obtenidos para la
tripsina. Aunque hay que considerar que los valores de UT para la papaína y
bromelaína las obtuvimos por gramo de muestra. Observamos además que por
tener una mayor actividad proteolítica las enzimas trabajadas, las concentraciones
de UT no entran dentro de la curva de actividad específica.
Comparando la actividad enzimática de la papaína y la bromelaína, obtuvimos que
ésta última tiene mayor actividad enzimática puesto que tiene valores más altos de
UT/g de muestra. Lo anterior podría relacionarse con que éstas 2 enzimas son
utilizadas en algunos lugares como ablandadores de carne, y se ha visto que la
eficiencia de la papaína en este particular aspecto es bastante menor que la
eficiencia de la bromelina.3
El número de UT/g muestra para la papaína es muy similar independientemente de
la dilución, pudiendo sugerir que la actividad enzimática de la papaína sería similar
a pasar de estar en menos concentración. Sin embargo el último tubo al que se le
añadió enzima fue justamente el tubo de papaína 1:4, y puede que haya transcurrido
más tiempo de acción de la enzima y por eso haya una actividad enzimática similar
a la del tubo menos diluido (1:2).
El grado de maduración de los frutos pudiera ser un factor importante también,
puesto que si es más maduro el fruto mayor será el contenido de enzimas
hidrolíticas que éste contiene. La piña de la cual hizo el extracto estaba muy madura,
más que la papaya, lo cual podría explicar también por qué es mayor la actividad
enzimática en este caso de la bromelaína.
CONCLUSIONES
-Se puede obtener una curva de actividad enzimática estándar que sea
independiente de la enzima proteolítica siempre y cuando se utilice el mismo
sustrato y las mismas condiciones experimentales (pH, Temperaura, etc.)
-Se obtuvo una actividad enzimática para tripsina de: 0.1311 UT/mg
-Se obtuvo una actividad enzimática para bromelaína de: 0.126 y 0.081 UT/g mta.
(respectivamente para dilución 1:10 y 1:20).
-Se obtuvo una actividad enzimática para papaína de: 0.064 y 0.067 UT/g mta.
(respectivamente para dilución 1:2 y 1:4).

PREGUNTAS ADICIONALES
a)Defina:
Actividad enzimática: Capacidad de la enzima para inducir una reacción química
determinada.1
Actividad enzimática específica: Relación de la actividad enzimática y la cantidad
de proteína en la mezcla.1
b) Clasificación de las proteasas en función de su mecanismo de acción y diga en qué
grupo se ubican las determinadas en la práctica.

La papaína y la bromelaína pertenecen al grupo de las cisteín proteasas.

c) ¿Para qué se añade cisteína en las muestras de piña y papaya?
El mecanismo catalítico de las cisteín-proteasas involucra la formación de un
intermediario enzimático acilado. El ataque nucleofílico se realiza a través de in grupo tiol
reactivo de una cisteína presente en el sitio activo. El tiol se transforma en un nucleofilo al
desprotonarse gracias a un residuo de His ayacente. Tienen actividad proteolítica debido
a que bromelina y papaína que se activan por la cisteína, tiosulfato y glutatión.3
d) ¿Cuál es la especificidad de enlace de la tripsina?
La tripsina rompe el enlace peptídico después de residuos con largas cadenas laterales
cargadas positivamente, a saber, arginina y lisina.
BIBLIOGRAFÍA:

1. Styer, L. Bioquímica. 6ª edición. Reverté. Barcelona. 2008. Pp. 67.

2. Ramírez, K. et al. ENZIMATICA S DE ACTIVIDADES PROTEOLITICAS DE PRODUCTOS UTILIZANDO
LATEX DE PAPAYA (Carica Papaya) PARA LOGRAR EL ABLANDAMIENTO DE LA CARNE. (En línea)
Departamento de Graduados e Investigación en Alimentos. ENCB-IPN. Consulta: 18/09/2016.
Disponible en:
[http://www.smbb.com.mx/congresos%20smbb/morelia07/TRABAJOS/Area_III/Carteles/CIII-8.pdf ]
3. Clavijo, Diego; Portilla Martinez, Maghdiel Cecilia; Quijano Parra, Alfonso Cinética de la bromelina
obtenida a partir de la piña perolera (Ananas Comosus) de Lebrija-Santander Bistua: Revista de la
Facultad de Ciencias Básicas, vol. 10, núm. 2, 2012, pp. 41-49