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CLINICA CHIMICA ACTA 207

DGTERMINATION RAPIDE DE L’ACTIVITI? CHOLINI%TERASIQUE DU


SfiRUM PAR UNE ULTRAMICROMfiTHODE CONDUCTIMfiTRIQUE

ANDRE REY ET MAXIME HANSS*


Section de Biophysique du Centre de Recherches du Service de Sante’ des Armies,
108, boulevard Pinel, Lyon, jdme, 69 (France)
(Rep le 13 avril 1970)

SUMMARY

Rapid Ultramicro Determination of Serum Cholinesterase Activity by a Conductimetric


Technique

The conductivity increase which appears during the enzymatic hydrolysis of


acetylcholine is used to measure the serum cholinesterasic activity. A description
of the method is given; the measurement is simple and takes only a few minutes;
between 20 and 40 ,uclof serum are necessary. The results are similar to those obtained
by the Ellmann method.
Unlike with calorimetric techniques, the precision and sensitivity of the
concluctometric determination are unaffected by the color or turbidity of the samples.

Alors que l’acetylcholinesterase est localisee clans les globules rouges, le serum
contient une butyrylcholinesterase responsable de son activite cholinesterasique.
Les variations de l’activite cholinesterasique clu serum interessent a la fois le
clinicien et le toxicologue. Pour le clinicien, la butyrylcholinesterase, au meme titre
que la cholesterolesterase, la lipoproteine lipase et la pyruvate kinase, fait partie
au groupe des enzymes seriques d0nt la diminution a principalement la signification
dune insuffisance fonctionnelle au foier. Pour le toxicologue, les cholinesterases
sdriques sont un temoin de l’intoxication par les anticholinestQasique9.
11 existe de nombreuses m&ho&s pour closer la butyrylcholinesterase: me-
thodes manomCtriques3~*, pH-mCtriquesS-8, titrimCtriquess~lO,colorimetriquesrl-16,
spectrophotomCtriques16-18 et Clectrochimiquesr9-2r. La plupart de ces techniques
sont adaptees a la determination de l’activite cholinesterasique du serum; toutefois,
les methocles colorimetriques sont les plus utilisees en raison de leur sensibilite et de
leur commoclite. Jusqu’a ces clernieres an&es, les techniques clerivant de la reaction
de Hestrinll-r* (reaction des hyclroxamates) ont CtCles plus employees. Recemment,
la reaction de Ellmann16 (substrat : adtylthiocholine, revelateur : clithiobisnitroben-
zoate) a egalement CtCmise a profit.

* Adresse actuelle : Facult6 de M6decine de Paris, Unit6 P.C.E.M. de Bobigny, Rue Marcel Cachin,
Bobigny 93, France

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Quelles que soient leur sensibilite et leur commodite, les methodes optiques
peuvent Ctre perturbees par la turbidite et par des colorations anormales des Cchan-
tillons. Aussi nous pensons utile de decrire une nouvelle methode, bake sur l’en-
registrement des variations de conductivite, non influencee par ces causes d’erreurs.

PRINCIPES GtiNi+RAUX

En presence de butyrylcholinesterase, l’acetylcholine est hydrolysee en acide


acetique et choline. La reaction s’accompagne d’une variation de conductivite
principalement lice a la liberation d’acide ac&ique22-24. L’importance de cette
variation est determinCe par diverses reactions secondaires dependant du milieu
reactionnel.
Nous avons precedemment decrit en detail les conditions d’emploi de la
methode conductimetrique pour Ctudier les reactions enzymatiques, en particulier
le systeme butyrylcholinestCrase-ac&ylcholine23~24. Nous avons ainsi defini le
rendement conductimetrique experimental, RE, de la facon suivante:

RE = ‘,9Q”- (Mho . cm2. Cquiv.-I)

(T est la variation totale de conductivite qui apparait apres la transformation en-


zymatique de c moles par litre de substrat. Le facteur IOOO provient du choix des
unites de conductivite (Mho.cm-1) et de la concentration (molecule-gramme par
litre). Dune facon @kale, RE doit &tre exprime en equivalent-l car l’action en-
zymatique peut porter sur plus d’une liaison par molecule de substrat. Dans le cas
de l’adtylcholine n = I et RE se rapporte indifferemment a la molecule de substrat
ou a l’equivalent enzymatique.
A partir de Rs, on peut calculer l’activite specifique d’une preparation enzy-
matique inconnue par la formule:

A +$
E

A = activite specifique (unites internationales . mg-I)


K = constante de cellule (cm-*)
V = volume du milieu reactionnel (ml)
RE = rendement conductimetrique experimental (Mho*cm2*Cquiv.-‘)
X = quantite d’enzyme (mg)
dG
vitesse de variation de la conductance (pMho*min-I)
dt =
L’activite enzymatique d’un liquide biologique est generalement exprimee en
micromoles.min-1.1-1, c’est a dire en unites internationales d’activite par litre, si
bien que nous employons la formule:

A’ _ KV dG Io6
REdt a

A’ = activite (unites internationales *l-l)


a = volume du prelevement (~1)

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&TERMINATION RAPIDE DE L’ACTIVITfi CHOLINESTRRASIQUE 209

Dans des conditions experimentales fixes, le terme KV/RE/IO~/~ = B est


constant. Nous ecrirons done :

dt

Le but de ce travail est de decrire un protocole permettant de mesurer l’activite


cholinesterasique du serum et de comparer les resultats obtenus avec ceux d’une
methode colorimetrique classique. Ses conclusions ont deja fait l’objet d’une com-
munication preliminairez5.

PARTIE EXPRRIMENTALE

A. Techniques utilist!es
La methode conductimetrique est utilisee dans les conditions suivantes:
l’adtylcholine* (c = Z.IO-~ M) en milieu tris-HCI (pH = 8.1) est hydrolysee par
40 ,ul de serum; la duree totale de la mesure est de 4 min.
La methode colorimetrique de reference derive de la reaction de Ellmann. Le
protocole utilise est propose par la firme Boehringer** sous forme de trousses reactifs,
ses caracteristiques &n&ales sont les suivantes: a pH = 7.2 (tampon phosphate),
l’acetylthiocholine est scindee en acide acetique et en thiocholine dosee colorimetri-
quement par le dithiobisnitrobenzoate. Une determination est effect&e en 3 min sur
20 ~1 de serum.

I. MatLrieL
MWhode conductidtrique. Cet appareillage a CtC decrit antCrieurementa3j24. I1
est constitue par les elements suivants: pont de mesure Wayne Kerr A-221 et acces-
soire pour enregistrement B-221 ; ultrathermostat regle a 25” & 0.01; cellule con-
ductimetrique Metrohm EA 660 (capacite 2 ml; constante de cellule K = 11.15
cm-l) ; enregistreur.
Mdhode colorimWrique. Nous avons utilise un spectrophotometre Carl Zeiss
PM Qz avec enregistreur. Les dosages ont CtC effectues dans des cuves de I cm.
Les prelevements habituels sont effect&s a l’aide dune micropipette Marburg de
20 ~1 (& I ~1). Une microseringue Hamilton de plus grande precision a CtC reservee
aux etalonnages.

2. Produits et dactifs
Mbthode conductimdrique. Les reactifs sont prepares a partir de: chlorure
d’acetylcholine BDH (conserve a l’obscurite dans un dessicateur) ; trihydroxymethyl-
aminomethane (= tris) Merck; acide chlorhydrique normal titrisol Merck; butyryl-
cholinesterase du serum de cheval Schwarz (4.5 U.I./mg).
Solutions stock :
R I : chlorure d’acetylcholine 0.1 M (conserve au refrigerateur)
R II: tampon tris-HClo.1 M, pH = 8.15

* 11 est connu que le substrat prCf&entiel de la butyrylcholinestkrase est la butyrylcholine,


mais l’a&tylcholine reste le plus souvent utiliske dans les ddterminations d’activittk.
** Biochemica test combination, C. F. Boehringer et Soehne GMBH, Mannheim. Biochemical

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Solution de travail (pH = 8.1) :


RI:zml
R II: 4 ml
eau distillee qsp IOO ml.
Cette solution doit Ctre utilisee dans les 24 h.
Mbthode colorimWrique. Pour la preparation des reactifs, ainsi que pour la
reaction de dosage, nous nous sommes conform& en tous points a la notice du
fabricant.

3. Protocole de la mbthode conductim&ique (Fig. I)


Introduire dans un b&her: essai t&mobs
solution de travail 5 ml 5 ml
serum 40 iul -
Puis :

//
AG

I
50 n Mho

f-7
I/ I’ Imin

Fig. I. En (I), la cellule est remplie avec la solution “temoin”. Aprbs une periode de stabilisation
thermique de I min 30 set environ, il apparait une variation de conductance reguliere, faible
et reproductible. En (2), la cellule est remplie avec la solution “essai”. L’equilibre thermique est
la aussi atteint apres I min 30 environ. Ensuite, la conductance varie regulierement par suite de
l’hydrolyse enzymatique de l’acetylcholine.

(a) melanger, (b) remplir la cellule conductimetrique et enregistrer la con-


ductance pendant trois minutes; (c) Cvaluer la difference de pente [dG/dt (essai -
dG/dt (tCmoin)]* exprimee en pMho*min-1; (d) calculer le resultat ainsi:
A’ = B [dG/dt (essai) - dG/dt (temoin)]
A’ est exprime en unites internationales par litre de serum.

4. Factew d’btalonnage B
En principe B = IoeKV/aRE Cependant, l’etude de la constante de vitesse
k en fonction du pH nous a montrC23924que l’optimum cinetique se situe a pH = 8.9 ;

* dG/dt (temoin) depend principalement de l’equilibre thermique du dispositif experimental.


Dans une serie de mesures, dG/dt (temoin) demeure constant.

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c’est pour des motifs purement conductimetriques (palier de rendement) que nous
avons choisi de fixer le pH a 8.1. Dans un but de normalisation des resultats, (choix
des conditions optimales), nous corrigerons le facteur d’etalonnage par un coefficient
k(pH = 8.9)
f=
k(pH = 8.1)= 1'23
Si bien qu’en definitive:

B = Kg T x 1.23
E

(la valeur f = 1.23 est deduite de nos resultats anterieurs).


Dans nos conditions experimentales :
K = 11.15 cm-l, V = 5 ml, RE = 64 Mho*cm2*Cquiv.-1, a = 40 ~1
Ainsi
x
BE-- 11.15 5 x 2 x 1.23 = 26.785 N 26.800.
64 40
5. Valeur de RE
En fait RE peut varier leghement suivant les conditions experimentales.
Lorsqu’on modifie la technique initiale, il faut en toute rigueur determiner RE dans
les conditions effectivement utilisees lors du dosage.
Ce controle peut se faire en ajoutant une petite quantite connue soit d’adtyl-
choline dans une solution de cholinesterase, soit d’acide acetique dans le milieu
reactionne123~24.
En pratique, les variations de RE avec le pH ou la force ionique seront g&kale-
ment negligeables.

B. Controle de la m&hode conductim&rique


Linda& de l’action. 11 importe a la fois que la pente de l’enregistrement con-
ductimetrique dG/dt demeure constante pendant le temps necessaire a la mesure et
que 1’CgalitCA’ = B (dG/dt(essai) - dG/dt (temoin) soit respect&e sur toute la gamme
des activites observees en clinique. C’est la raison pour laquelle nous avons CtudiC
dans des conditions limites la linearite de l’action en fonction du temps et de l’activite
enzymatique.
(a) Linearite en fonction du temps. L’enregistrement prolong6 de la reaction
d’un serum normal donne par exemple les resultats suivants:
temps en min 3 8 15 20 30
dG/dt (valeurs relatives) 1.00 1.03 0.97 0.89 0.77
Ainsi, on constate que la lecture est possible trois minutes apres le melange
serum-solution de travail. Les resultats sont a peu p&s constants dans les dix
minutes qui suivent.
(b) Linearit& en fonction de la quantite d’enzyme. De man&e a Climiner
l’influence possible des activateurs ou des inhibiteurs seriques sur l’activite, nous
avons utilise des solutions p&pa&es a partir d’une enzyme purifiee (butyrylcholines-
terase Schwarz). La linearite a et6 CtudiCe pour des solutions d’activites comprises
entre IOOOU.I. I-1 et 8000 U.I. 1-l; ce qui correspond aux valeurs limites rencontrees
en cliniquel.

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0.3-

L”
t
.-
E
I w-
0
llllr
m-

111.-1.*1 0

1000 4000 8000


I

v. 1.P
Fig. z. Vitesse de variation de la conductance en fonction de la quantite d’enzyme.

La Fig. 2 montre que dans cette zone la linearite est bien respect&e.
de la mWhode. Dix determinations en serie sur un meme serum
Reproductibilitk
de faible activite nous ont donne les resultats suivants:
x J% = 1840 Lc_60 U.I. 1-l.
enzyme de rkf&ence. Nous avons utilise une butyrylcholinesterase
.l?tude d’une
Schwarz titrant 4.5 U.I. par mg; l’activite 6valuCe par notre methode est de 4.2
U.I. par mg.

C. Premiers rbultats cliniques


Nous avons mesure par la methode conductimetrique l’activite cholinesterasi-
que d’une serie de IO serums normaux et pathologiques et controle les resultats par
la methode colorimetrique (Fig. 3).

AG I I

( t
Imin

Fig. 3. Extrait d’une serie de mesures conductimetriques de l’activitd cholinesterasique de serums


differents (I, 2, 3. 4). Les courbes en pointille representent les enregistrements obtenus pour chacun
des serums par la methode spectrophotometrique.

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DltTERMINATION RAPIDE DE L’ACTIVITk CHOLINESTfiRASIQUE 213

Le Tableau I rend compte de ces essais.

TABLEAU I
R$SULTATS CLINIQUES

.St!VUm Mbthode M&ho& R


PZO. colorimeYrtriqua condztctimt!trique

I 2680 3731 I.39


2 3000 4205 1.40
3 1960 2510 1.28
4 1260 1822 I.45
2 2250 2984 1.33
2430 2984 1.23
: 1380 1899 1.38
2780 3643 I.31
9 2310 3043 1.32
IO 2430 3120 1.28

Le rapport des resultats - methode conductimetriquel methode colorimetrique (R) est


sensiblement different de I .oo (valeur moyenne I .34), car les conditions experimentales
sont differentes (substrats, milieux tampons, pH). Quelle que soit l’activite cho-
linesterasique du serum, (R)reste a peu pres constant (&art type (I = 0.07) ; ce qui
justifie l’intCr&t de la methode propode.
Compte tenu de (R)et des valeurs normales don&es par la firme Boehringer,
les activites cholinesterasiques des serums normaux determinCes par conductimetrie
seront vraisemblablement comprises entre 2550 et 5100 U.I. l-1.
Bien entendu, ces valeurs ne sont qu’une premiere estimation et devront &tre
confirmees par une experimentation clinique plus importante. Des contrciles effectues
sur des serums presentant des traces d’hemolyse ont montre que les resultats de la
methode conductimetrique n’etaient pas modifies, au contraire la methode colori-
metrique devenait inutilisable dans ces conditions.

CONCLUSION

La methode conductimetrique permet de mesurer l’activite cholinesterasique


du serum. Les resultats obtenus sont cornparables a ceux don&s par les techniques
colorimetriques classiques. La reproductibilite et la linearit sont tres satisfaisantes.
Dans les conditions experimentales utilisees, le dosage est effect& en 4 min avec
40 ~1 de serum. Ce volume pourrait &tre reduit a 20 ,ul sans diminution notable de
la precision. La commodite de la methode est comparable sinon superieure a celle
des techniques colorimetriques (dont les reactifs peuvent presenter des problemes de
conservation). Elle possede l’avantage fondamental de ne pas &tre perturbee par les
colorations ou turbidites parasites des prelevements.
Nous avons recemment pris connaissance d’un nouveau dosage colorimetrique
base sur la reaction de Ellmann et l’utilisation de microcuveP; il permet d’effectuer
les determinations sur des prelevements de volumes inferieurs a I ,ul. Nous pensons
que, de la m&me man&e, la methode conductimetrique pourrait atteindre des
sensibilites plus fortes que celles dont nous avons fait &at en disposant de micro-
cellules conductimetriques. La rapidit du dosage pourrait Ctre Cgalement amelioree
par l’emploi de cellules a Cquilibre thermique rapide.

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L’augmentation de conductivite qui accompagne l’hydrolyse enzymatique de


l’adtylcholine est utilisee pour mesurer l’activite cholinesterasique du serum. Nous
decrivons la methode; la mesure est obtenue t&s simplement en quelques minutes
a partir de 20 A 40 ,ul de serum. Les resultats sont en accord avec ceux don&s par
la methode de Ellmann. Contrairement aux techniques colorimetriques, la precision
et la sensibilite du dosage conductimetrique ne sont pas modifiees par la coloration
et la turbidite des prelevements.

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