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oProducción industrial de penicilina a partir
m de hongo Penicilium. chrysogenum
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-Contreras Flores José Caín
-Gonzales
l Bernal Javier
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-Reyes Baca Guadalupe
-Segundo
c Ramírez Jesús Alberto
-Tello
o Alvarado Bibiana
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Contenido
Resumen....................................................................................................................3
1. INTRODUCCION...................................................................................................3
1.1 Penicilina..........................................................................................................3
1.2 Biosíntesis de penicilinas.................................................................................4
1.3 PRODUCCION INDUSTRIAL..........................................................................8
1.3.1 Desarrollo en tanques de sembrado.........................................................9
1.3.2 Medio de cultivo para la fermentación......................................................9
1.3.3 Etapa II. Biorreacción..............................................................................10
1.3.4 Etapa III. Purificación...............................................................................11
1.4 IMPORTANCIA ECONÓMICA.......................................................................12
1.5 Penicillium chrysogenum...............................................................................13
1.5.1 Clasificación taxonómica de Penicillium chrysogenum...........................13
1.6 Mejora de cepas productoras de penicilina..................................................14
1.7 MEDIO............................................................................................................15
1.7.1 Diseño de medios de cultivo...................................................................15
2. ANTECEDENTES............................................................................................17
3. Estrategia experimental....................................................................................19
4. BIBLIOGRAFÍA.................................................................................................21
Resumen
Se realiza una estrategia experimental basándose en investigaciones anteriores
para la producción industrial de penicilina, donde se hace los cálculos necesarios
para los balances de materia y energía con la finalidad de optimizar la producción
de este metabolito secundario, utilizando métodos de ingeniería de procesos,
tomando en cuenta los distintos parámetros.
1. INTRODUCCION
1.1 Penicilina
La penicilina fue el primer antibiótico empleado en medicina y su descubrimiento
es atribuido a Alexander Fleming, quien junto a otros científicos médicos
obtuvieron el premio Nóbel de medicina en 1945, mención más que merecida tras
semejante aporte. El descubrimiento de la penicilina ocurrió de una forma un tanto
casual y fue relatada por el propio Fleming, quien en la mañana del 28 de
septiembre de 1928 se encontraba estudiando cultivos de bacterias en el sótano
del laboratorio del Hospital St. Mary, en Londres.
Fleming se encontraba estudiando bacterias de estafilococo para entonces, pero,
luego de ausentarse casi por un mes de la ciudad de Londres, olvidó una placa de
Petri en la que se contenían bacterias cerca de una ventana abierta. Al regresar a
sus experimentos, se encontró con que su experimento se había estropeado pues
las muestras se habían contaminado con una especie de moho que había entrado
con el viento.[ CITATION Nol03 \l 2058 ]
La curiosidad de Fleming hizo que el científico en lugar de tirar su experimento
arruinado a la basura, colocase su placa de Petri al microscopio. Lo que observó
fue que no solo el moho había contaminado todo el contenido de la placa, sino que
alrededor de éste, había un claro, una zona limpia en la que el moho había
matado a las bacterias. Luego de identificar el moho como hongos de Penicillium,
Fleming fue optimista acerca de los claros resultados: el Penicillium eliminaba las
mortales bacterias Staphylococcus de una vez por todas[ CITATION Nol03 \l
2058 ].
Aunque, al poco tiempo, perdió un poco la confianza al cuestionarse acerca de
cuánto posible era utilizar este hongo como antibiótico en realidad y cuál seguro
era para el cuerpo humano, sus numerosas investigaciones, pruebas y ensayos
clínicos le dieron la seguridad necesaria para desarrollar y completar el
descubrimiento. En este punto, mucho tuvieron que ver sus colegas universitarios,
entre ellos, Sir Howard Florey y Ernst Chain, ambos de la Universidad de Oxford y
con quienes comparte el premio Nobel.
Finalmente, luego de que los colegas de Fleming demostraran que la penicilina
podía utilizarse perfectamente en los humanos como un antibiótico, se probó por
primera vez en humanos. Orvan Hess y Bumstead Juan fueron las primeras
personas en utilizar la penicilina como antibiótico y los resultados fueron un
completo éxito. Desde entonces, los antibióticos de penicilinas han salvado una
enorme cantidad de vidas en el mundo entero[ CITATION Jor09 \l 2058 ].
1.7 MEDIO
1.7.1 Diseño de medios de cultivo
Para el cultivo de microorganismos, se necesita un medio de cultivo que contenga
los elementos bioquímicos necesarios para el crecimiento, el cual, a su vez
dependerá de tres factores:
1) la composición del medio debe reflejar la composición elemental del
microorganismo.
2) los elementos del medio deben encontrarse o estar disponibles en moléculas
que puedan ser absorbidas y metabolizadas por el organismo.
3)Para la preparación en el laboratorio el número de componentes y
combinaciones debe ser lo más sencillo posible.
Con base en lo anterior, cuando se tiene por objetivo el cultivo y el crecimiento
exitoso de un microorganismo es necesario tener en cuenta el tipo de
microorganismo que se tiene, las fuentes más apropiadas para su crecimiento y el
contexto al que será aplicado en la industria, esto con el fin de preservar las
características de interés que tiene durante su cultivo (expresiones enzimáticas,
metabolitos, tipo de sustratos que es capaz de degradar etc).Para esto los medios
de cultivo juegan un papel fundamental, pues van a permitir obtener la mayor
concentración de biomasa o la mejor actividad degradadora de polímeros, lo que
traerá como resultados tratamientos exitosos como la degradación de sustratos
específicos u otras aplicaciones biotecnológicas con cepas específicas [ CITATION
Jor04 \l 2058 ].
La penicilina G es producida utilizando procesos sumergidos en fermentadores de
40000-200000 litros. Debido a las dificultades en el suministro de oxigeno no
puede ser empleados tanques mayores. La fermentación de la penicilina es un
proceso aerobio con una velocidad de absorción volumétrica de oxigeno 0.4-0.8
mM/l.min. la velocidad de aireación requerida esta entre 0.5-1.0 volúmenes de aire
(volumen de líquido)-1 min-1 dependiendo de la cepa, del biorreactor y del tipo de
impulsor. Para el mezclador se suelen utilizar varios impulsores de tipo Rushton
(120-150 rpm) el rango de temperatura optima es de 25-27 °C.
El caldo de cultivo para la fermentación se obtiene por infusión acuosa de maíz,
añadiendo de un 2 a un 3 % de lactosa, y también se adicionan compuestos
inorgánicos conteniendo hidrogeno, oxigeno, fósforo, azufre, potasio, magnesio,
nitrógeno y trazas de hierro, cobre y zinc.
La concentración de esporas (optima 5*103/ml) y la formación de agregados son
cruciales para el rendimiento subsecuente la penicilina G es un ácido fuerte (pKa
entre 2.5-3.1).
La extracción de penicilina se puede realizar en una o más etapas sucesivas, con
una acidificación del ácido filtrado con H2SO4 O H3PO4 al 10% p/v y con el
agregado de un agente surfactante (0.003-0.1 % p/p, en el solvente) realizándose
la extracción y concentraciones en extractores centrífugos.
La cristalización se puede realizar desde la fase acuosa si se desea, siendo los
valores críticos las concentraciones de sodio o potasio, la temperatura, la
concentración de penicilina y el pH. En caso de hacerse la cristalización a partir de
un solvente se requiere un exceso de Na+ o K+, siendo los cristales recuperados
en un filtro rotatorio de vacío. Estos cristales son lavados y presecados con un
solvente volátil que también separa impurezas coloreadas.
El medio de cultivo típico alimentado puede variar dependiendo de la cepa y
generalmente consiste en:
Liquido de maceración de maíz (4-5 % peso seco)
Una fuente de nitrógeno adicional, harina de soya, extracto de levadura o
suero
Una fuente de carbono, lactosa
El pH se mantiene constante a 6.5
El ácido fenilacético o el fenoxiacético se alimenta continuamente como
precursores (0.5-0.8 % del total).
Los procesos con alimentación de glucosa o melazas también tienen éxito. En
estos casos las velocidades de alimentación son de 1.0-2.5 kg/m3h con una
concentración de glucosa de 500 kg/m3. Aproximadamente el 65% de la fuente de
carbono metabolizada se utiliza para el mantenimiento energético, el 25% para el
crecimiento y solo el 10% para la producción de penicilina [ CITATION Man07 \l
2058 ].
2. ANTECEDENTES
En el año 2000 los investigadores van Gulik WM, de Laat WT y Vinke JL, Heijnen
JJ. desarrollaron un modelo estequiométrico detallado para el crecimiento y la
producción de penicilina-G en Penicillium chrysogenum. A partir de un análisis de
flujo metabólico a priori utilizando este modelo, pareció que la producción de
penicilina requiere cambios significativos en los flujos a través de las vías
metabólicas primarias. Esto es provocado por la biosíntesis de precursores de
carbono para el núcleo beta-lactano y una mayor demanda de NADPH,
principalmente para la reducción de sulfato. Como resultado, ocurren cambios
significativos en el reparto de flujo alrededor de cuatro nodos principales en el
metabolismo primario. Estos se encuentran en: (1) glucosa-6-fosfato; (2) 3-
fosfoglicerato; (3) piruvato mitocondrial; y (4) isocitrato mitocondrial. Estos nodos
deben considerarse como posibles cuellos de botella para aumentar la
productividad. La flexibilidad de estos nodos principales se investigó mediante la
manipulación experimental de los flujos a través de las vías metabólicas centrales
utilizando una cepa de P. chrysogenum de alta producción. Los flujos metabólicos
se manipularon mediante el crecimiento de las células en diferentes sustratos en
el cultivo de quimiostato de carbono limitado. El análisis del flujo metabólico,
basado en los flujos de entrada y salida medidos, se utilizó para calcular los flujos
alrededor de los nodos principales. Se encontró que, para el crecimiento en
glucosa, etanol y acetato, la distribución del flujo alrededor de estos nodos difería
significativamente. Sin embargo, esto apenas tuvo ningún efecto sobre la
productividad de la penicilina, lo que demuestra que es poco probable que el
metabolismo primario del carbono contenga posibles cuellos de botella. Se
realizaron experimentos adicionales para manipular la demanda metabólica total
del cofactor nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADPH). La demanda de
NADPH se incrementó paso a paso al cultivar las células con glucosa o xilosa
como fuente de carbono combinada con amoníaco o nitrato como fuente de
nitrógeno, lo que dio como resultado una disminución escalonada de la producción
de penicilina. Esto muestra claramente que, en la fermentación de la penicilina, las
posibles limitaciones en el metabolismo primario residen en el suministro /
regeneración de los cofactores (NADPH) más que en el suministro de precursores
de carbono.
3. Estrategia experimental