Vous êtes sur la page 1sur 6

SALINAS HERNANDEZ VICTOR ALAN

EMA
3IM65

ESPECTOFOTÓMETRO UV-VIS PARA MICROVOLÚMENES

Comúnmente en laboratorios equipados para universidades, o áreas no dedicadas a la


investigación, cuentan con espectrofotómetros de no más de 2500 nm como máximo y
de no menos de 190 nm como mínimo las llamadas regiones UV, 350-190 nm, VIS,
800- 350 nm y NIR o conocida como infrarrojo cercano, 2500-800 nm. En ESIQIE se
cuenta para el área de espectrofotometría un Perkin Elmer Lambda 2S UV/VIS el cual
entra en el rango de 1100-190 nm, es decir el infrarrojo cercano no alcanza a ser
cubierto, esto como primer limitante.

De luz visible.
De luz UV.
Para UV/VIS.
Infarrojo.
Espectrofotómetros
De absorción atómica (AA),
De emisión de plasma (ICP)
Biológicos o ciencias de la vida.

Esquema 1. Tipos comunes de espectrofotómetros

Cada espectrofotómetro tiene su finalidad, ya sea que trabaje en cierto rango de longitud
de onda, o que su principio fundamental varíe según la muestra ensayada, ahora la
siguiente limitante que se podría presentar es la cantidad de muestra a ensayar, ya que
ésta en los equipos mencionados llega a ser de 2 o 3 ml en la celda que se ingresa para
su análisis, pero ¿Qué empleamos en caso de tener volúmenes de orden micro litros?

Los llamados espectrofotómetros de ciencias para la vida, o bien biológicos son


empleados para justamente fines meramente biológicas como puede ser aplicación en
análisis de proteínas, DNA, RNA, y otras biomoléculas. La diferencia reside en que,
para los espectrofotómetros convencionales se usan muestras ingresadas en celdas o
también llamadas capilares de órdenes de los mililitros, mientras que en estas
aplicaciones van de los 0.5 hasta los 2 microlitros, son únicamente estos equipos
especializados los cuales pueden trabajar empleando estos bajos volúmenes.
SALINAS HERNANDEZ VICTOR ALAN
EMA
3IM65
La innovación de estos espectrofotómetros está en la eliminación de dichas celdas;
evidentemente también en el tamaño de los equipos, ya que estos más allá de trabajar
con celdas o cubetas/capilares, trabaja con dos “placas” que son las superficies de
medición o de muestra una encima de otra trabajando con la tensión superficial de la
muestra entre dos pedestales o lectores ópticos.

Al eliminar dichas celdas de muestra se optimiza el tiempo en el que se trabaja, es decir,


no solamente logras superar la dificultad de trabajar con micro volúmenes, sino que a su
vez permites reducir el tiempo de medición, cambiar en tiempo real el recorrido de la
medición y con esto aumenta el rango de las concentraciones posibles a estudiar de las
muestras, con todo esto se elimina también las diluciones y la preparación de la muestra
se facilita ya que se reduce a la limpieza de las superficies mencionadas con una toallita
de laboratorio.

Estos equipos son ideales cuando tenemos cantidades de muestra muy limitadas pero no
quiere decir que no se puedan emplear cuando se tienen altas cantidades, ya que al tener
un ciclo tan corto de trabajo suele ser empleado en otros casos.

Antes de conocer el principio de estos equipos recordemos las partes fundamentales que
componen a un espectrofotómetro:

 Las fuentes de Luz, en el caso particular se manejan de Xenon.


 Contenedor de muestra a ensayar.
 Selector de longitud de onda.
o Filtros.
o Monocromadores.
o Interferometros.
 Detector.
o De un canal.
o Fotovoltanicos.
o Fotodiodos.
o Multicanal.
o De transferencia de carga.
 Procesador de señal.

En el caso muy partículas de los espectrofotómetros empleados en micro volumen el


funcionamiento se puede resumir a lo siguiente (hablando claro generalmente):

Se colocan las muestras a ensayar en una placa o superficie de muestra, en la cual se


pondrá encima la otra superficie ambas ópticas (ilustración 1), estas con ayuda de la
SALINAS HERNANDEZ VICTOR ALAN
EMA
3IM65
tensión superficial del líquido analizado, formarán una columna de dicha muestra, por
debajo de esta columna mencionada entra en acción nuestra fuente que comúnmente es
de luz Xenón y en la mayoría de marcas tienen una vida media de 3 años, incide la luz
(ilustración 2) seleccionada gracias al software ya sea externo en un equipo de cómputo
o dentro de algunos equipos especiales a la muestra, esta es atravesada y con la
superficie empalmada por la parte de arriba refleja dicha luz que es recibida por nuestro
detector el cual lo codifica con señales CCD o bien Charge-Coupled Devices (los cuales
son aquellos que recogen la luz y lo convierte en señal eléctrica), esto lo procesa
nuestro equipo y nos arroja consigo absorbancias buscadas en el espectrograma
generado.

Ilustración 1. Acoplamiento de las superficies de muestra.

Ilustración 2. Incidencia de luz en muestra.


Por ejemplo tenemos el Espectrofotómetro UV5Nano (Ilustración 3) el cual trabaja
asegurándonos plena fiabilidad con muestras de 1
microlitro con rangos de UV/VIS (1100-190 nm) con
una longitud de trayectoria desde 0.1 mm a 1 mm,
este equipo como ventajas tenemos que trabajar con
su propio software aunque igualmente se le puede
instalar a un equipo de cómputo, además que puedes
meter también celdas de 1 cm para realizar
mediciones de volumen mayor, en este equipo ya
vienen precargadas algunas configuraciones para
realizar ya análisis a biomoléculas comunes. Otro
Ilustración 3.
Spectrophotometer UV5Nano
SALINAS HERNANDEZ VICTOR ALAN
EMA
3IM65
equipo parecido es el Espectrofotómetro para micro volumen Genova Nano (Ilustración
4) los cuales se diferencian al asegurar que sus resultados son fiables con solo 0.5
microlitros, trabajando de longitudes de (198- 1000 nm) y con una longitud automática
menor de 0.2 a 0.5 mm ideal en biomoléculas.
Y finalmente como último ejemplo pondría a uno
de los equipos más empleados en las
investigaciones publicadas para estos estudios, el
Espectrofotómetro NanoDrop 2000 (ilustración
5) de Thermo Scientific, el cual es más exacto
aun que los previamente mencionados estos
emplean 0.5 mcirolitros hasta 2, con una salida
espectral completa UV/VIS (190-840 nm)
también con métodos ya configurados como
proteínas y ADN empleando su software en
cómputo.4. Espectrofotómetro
Ilustración
para micro volumen GENOVA
NANO

Ilustración 6. Vista de la columna de


muestra en un Nano Drop.
Ilustración 5.
Espectrofotómetro Nano Drop.

Evidentemente hay muchísimos más modelos y marcas de espectrofotómetros que


pueden tener estas características pero en las referencias consultadas estas eran los
equipos mencionados.

ESTUDIO DEL ADN CON ESPECTOFOTOMETRÍA.

En los años 50’s James Watson y Francis Crick descubrieron una estructura del ácido
desoxirribonucleico con doble helice mejor conocida en la actualidad como ADN, fue y
es uno de los descubrimientos de mayor índole en la comunidad científica ya que a
partir de dichas fechas se comenzaron a establecer cientos y cientos de investigaciones
que emplean esta molécula para ello, dentro de los resultados que dieron cita a esta
SALINAS HERNANDEZ VICTOR ALAN
EMA
3IM65
investigación el genoma humano, fue uno de los más grandes, este fue descubierto por
el año 2004, básicamente se desarrolla el acervo genético, información de millones de
años atrás en una sola molécula compleja.

En cada estudio en el que se emplea esta molécula se requiere del conocimiento de la


concentración de la misma, el ADN absorbe luz, en el rango ultravioleta: es por eso que
la luz del sol para el ser humano es sumamente peligrosa, la cantidad del ADN presente
en una muestra ensayada puede determinarse con ayuda de un espectrofotómetro, es
decir, midiendo la absorbancia.

Por ejemplo, en el genotipeo de animales se debe realizar un aislamiento del ADN de


biopsias de tejido preparadas en ciertas soluciones que ayudaran a su análisis, esta
solución luego de ser preparada se estudia en un espectrofotómetro bajo condiciones de
específicas, en el caso de roedores se hace a 260-280 nm para luego amplificar con
métodos como la Reacción de Cadena de Polimerasa RCP y asi obtener un molde de
ADN lo más limpia posible.

Otro ejemplo y uno de los usos más importantes de esto son en la detección de
enfermedades, por ejemplo, similar al genotipeo de animales se puede emplear la RCP
para detectar secuencias de ADN del virus de papiloma humano, del cual podemos
obtener muestras y una vez preparadas bajo ciertas condiciones se meten a un
espectrofotómetro a 280-260 nm y se genera el estudio de la concentración que sirve
para generar dichas secuencias que serán usadas para diagnóstico. De forma similar se
puede usar en la detección de Lupus Erimatoso sistémico, y algunas otras enfermedades
que generen una secuencia de ADN.

CONCLUSIONES GENERALES:
Para la investigación se necesitan algunos equipos cada vez más sofisticados, estos
sostenidos en las leyes fundamentales, como podemos ver el principio fundamental de
un espectrofotómetro; la absorbancia, es la misma en todos los tipos, cada uno se rige
igual pero con características de trabajo diferente, esto como todo lo que va surgiendo
es para solucionar limitantes que equipos previos nos daban en ciertos estudios, caso
particular de tener volúmenes limitados de lo ensayado. Gracias a la evolución de estos
equipos se va dando también un mejor desarrollo en otras áreas, ya que una vez dada la
investigación el siguiente paso es buscar dónde y cómo aplicarlo industrias
farmacéuticas, biológicas y el sector médico por dar ejemplos son beneficiados con
espectrofotómetros de micro volúmenes, en el cual al estudiar biomoléculas como el
ADN dan apertura a soluciones de cada vez más y más problemas o prevención de ellos.

REFERENCIAS
SALINAS HERNANDEZ VICTOR ALAN
EMA
3IM65
1.BROWN, C. ULTRAVIOLET, VISIBLE, and NEAR-INFRARED
SPECTROPHOTOMETERS. Applied Spectroscopy Reviews 35, 151-173 (2000).
2.METTLER TOLEDO Laboratory. Micro Volume UV/VIS Spectrophotometers — One
Drop Spectroscopy from METTLER TOLEDO. (2015). en
<https://www.youtube.com/watch?time_continue=41&v=IhG_E204sYs>
3. THERMO SCIENTIFIC. Espectrofotómetros NanoDrop™ 2000/2000c. Thermo
Scientific (2009). en <https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/ND-2000>
4.Desjardins, P. & Conklin, D. NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic
Acids. Journal of Visualized Experiments 45, (2010) doi:10.3791/2565.
5.Desjardins, P., Hansen, J. & Allen, M. Microvolume Protein Concentration
Determination Using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer. Journal of Visualized
Experiments (2009). doi:10.3791/1610
6.Gonzalez, N., Rodriguez, N., Torres, W. & James, O. Protocolo sencillo para la
extracción de ADN genómico de tejido de oreja del ratón y la rata, usando la enzima
bromelina. Revista Científica 233-238 (2011).
7.Soto, Y. et al. Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí" Aplicación de la técnica
de reacción en cadena de la polimerasa para la detección de secuencias de
Papillomavirus humano. Revista Cubana de Medicina Tropical (1998).
8.Bentancourt, O., Padilla, A. & Leiva, L. Purificación de ADN genómico humano para
el diagnóstico del lupus eritematoso sistémico. Revista Archivo Médico de
Camagüey (2009).