Microscopía

Técnicas histológicas

Métodos histológicos
Ana María Puyó
MICROSCOPIO ÓPTICO (MO) DE CAMPO CLARO
 LÍMITE DE RESOLUCIÓN
AN = apertura numérica = medida de la capacidad del
microscopio de agrupar las refracciones de la luz producidas por los
detalles del objeto.

AN = h x sen 

η = índice de refracción del

medio que separa el cubre-
objetos de la lente objetivo.

 = ángulo de semiapertura =
mitad del ángulo limitado por
los rayos más periféricos que
entran en el objetivo.
MICROSCOPIO ÓPTICO (MO) DE CAMPO CLARO

480 X
 MICROSCOPIO DE CAMPO OSCURO

MO DE CAMPO CLARO MO DE CAMPO OSCURO

MICROSCOPIO DE CAMPO OSCURO
MICROSCOPIO DE CONTRASTE DE FASE

•anillos ópticos en objetivo

y condensador

•utiliza las diferencias en

el índice de refracción
producidas por la luz que
atraviesa el objeto

• = l = resolución

•Utilidad = observación de
células y tejidos vivos, no
coloreados
 MICROSCOPIO DE INTERFERENCIA

•Utiliza diferencias de fase producidas por la luz que

atraviesa el objeto.
•Se pueden obtener datos cuantitativos.
 MICROSCOPIO DE LUZ UV

• Lentes de cuarzo

• λ < (250 nm) >

resolución

• Absorción de luz
UV por las
moléculas de la
muestra

• Se registra en
placa fotográfica

• Utilidad = ácidos
nucleicos y algunos
aminoácidos
MICROSCOPIO DE LUZ UV
 MICROSCOPIO DE LUZ POLARIZADA
• Filtro polarizador
entre luz y
condensador

• Filtro analizador
entre objetivo y
observador

• Sustancias que
rotan el plano de
luz polarizada
producen
birrefringencia

• Permite observar
células vivas
MICROSCOPIO DE LUZ POLARIZADA
MICROSCOPIO DE FLUORESCENCIA

UV

LUZ MONO-
CROMÁTICA
MICROSCOPIO DE FLUORESCENCIA

1400 X

Moléculas de actina + Ac anti-actina con fluoresceína

MICROSCOPIO CONFOCAL

Orificio puntiforme que está en

conjunción con el punto focal de
la lente
 MICROSCOPIO MICROSCOPIO
DE CONFOCAL
FLUORESCENCIA

Enfoca el objetivo Un rayo laser barre

en un solo plano de todos los puntos del
corte a la vez. plano focal
MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE TRANSMISIÓN (MET)

Haz de electrones
l = 0.005 nm

Bobinas
electromagnéticas

Placa fotográfica
MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE TRANSMISIÓN (MET)
MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE TRANSMISIÓN (MET)

Mitocondria 200000 X

Células absortivas del epitelio

cilíndrico simple del intestino
delgado
MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE BARRIDO (MEB)

• Los electrones no atraviesan el objeto.

• El límite de resolución es 2,5 nm.
• La imagen es tridimensional.
 MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE BARRIDO (MEB)

Bacteria

Células absortivas del epitelio

cilíndrico simple del intestino delgado
 MICROSCOPIO DE FUERZA ATÓMICA (MFA)

• No óptico.
• Sonda puntiaguda con el
extremo del tamaño de átomo.
• Puede estudiar tejidos vivos.
• Límite de resolución = 50 pm
MICROSCOPIO DE FUERZA ATÓMICA (MFA)

ATP sintetasas ADN

MICROSCOPÍA VIRTUAL

Análisis de imágenes
Técnicas histológicas
CORTE POR MICRÓTOMO
MÉTODOS HISTOQUÍMICOS

Acidofilia
colorantes ácidos o aniónicos
forman enlaces electrostáticos
con grupos tisulares de carga
positiva

Basofilia
colorantes básicos o catiónicos
forman enlaces electrostáticos
con grupos tisulares de carga
negativa
MÉTODOS PARA SISTEMA NERVIOSO

Nissl
colorantes básicos que se unen
a los ácidos nucleicos.

Cajal
Impregnación argéntica que
utiliza sales de Ag que se
reduce a Ag° sobre los neuro-
filamentos.

Kluver-Barrera
Combina un colorante básico y
uno para mielina.
 MÉTODOS HISTOQUÍMICOS

Metacromasia colorantes básicos: forma monomérica

azul y forma polimérica roja.
 MÉTODOS BASADOS EN LA REACCIÓN DE
SCHIFF PARA ALDEHIDOS

Reactivo de Schiff leucofucsina incolora que forma un producto

estable rojo con aldehidos

Ácido periódico-Schiff (PAS) Feulgen

macromoléculas ricas en H de C ADN
MÉTODO HISTOQUÍMICO PARA LÍPIDOS

• Fijación con formalina

• Corte por congelación
• Coloración con Sudán en alcohol diluído
• Inclusión en medio acuoso
 MÉTODO HISTOQUÍMICO PARA ENZIMAS

•Especificidad de
sustrato

•Corte por congelación

de tejido no fijado

•Producto de reacción
visible que señala la
localización de la
enzima
 MÉTODOS INMUNOHISTOQUÍMICOS

Directo

Indirecto
INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA E
INDIRECTA

Ac 1º Ac 2º
fluoresc.

Ag
 HIBRIDACIÓN IN SITU

• Se utiliza una sonda formada por un ácido nucleico monocatenario con una
secuencia de bases conocida complementaria de la secuencia que se quiere
demostrar

• Permite identificar secuencias de ADN correspondientes a determinados

genes y la expresión de genes por demostración de secuencias de ARNm.
 RADIOAUTOGRAFÍA

•Se inyecta una molécula marcada

con un isótopo radioactivo

•Las moléculas marcadas se

integran a macromoléculas

•Después del montaje de los

cortes se agrega una emulsión
fotográfica

•Permite saber donde se sintetiza

un producto celular y sus
desplazamientos dentro de la
célula y al salir de la misma
PROCESAMIENTO DE MUESTRAS PARA ME