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Pour les techniques de génétique, le prélèvement ça sera l’ADN ou dans certaines circonstances des

ARN. Ça va été des acides nucléiques qu’il faudra puiser et extraire et c’est la technique de base en
biomol. Comment ?

L’adn est présent dans les noyaux : en général le prlvt généralement utilisé c’est le sang total prélevé sur
un anti coagulant particulier et c’est l’EDTA à chaque fois car l’héparine va être un inhibiteur de la
polymérase qui va être toujours utilisée pour les détections de mutations que l’on va voir après.

Donc le prlvt le plus facile, c’est le sang total. Mais après, là où il y aura des noyaux, on pourra utiliser
cette technique : un tissu, le liquide amniotique, un prélèvement anatomopath…etc mas ça nécessitera
des moyens plus poussés pour extraire l’ADN.

Le sang total est formé différents éléments et là où l’on va trouver notre noyau, c’est les GB. On extrait
en utilisant un tampon de lyse des globules rouges et ensuite on va centrifuger et là il y aura une
précipitation du culot globulaire au fond et dans le surnageant l’hémolysât des rouges que l’on va
éliminer par retournement. On utilisera des tubes spéciaux des tubes falton ( ?).

Par la suite on procèdera à des rinçages avec de l’eau phy isotonique et il faudra obtenir le culot
leucocytaire blanchâtre et cette couleur blanchâtre est importante.

Après avoir obtenu cela, il faudra libérer les noyaux. Donc dans une seconde étape on va utiliser un
tampon de lyse des GB. Ce tampon va libérer le contenu cellulaire et en plus, il faudra utiliser non
seulement une protéinases (enz pour digérer les protéines rattachées à l’ADN) et en plus un détergeant
qui est le SDS qui va servir à dénaturer toutes les membranes et les débris cellulaires. Cette étape durera
en général entre 4 à 16h pour laisse le temps à la protéinase de libérer l’ADN.

Après cette étape, il faudra utiliser un agent précipitant pour pouvoir précipiter les débris cellulaires et
libérer l’ADN. (L’ADN va être miscible à l’eau et là c’est une technique basée sur la solubilité
différentielle de l’ADN : ou bien on va utiliser des techniques de séparation éther-chloroforme ou bien
des techniques de précipitation le salting out et c’est cette dernière qui est la plus utilisée). En utilisant
une solution saline saturée ça va nous permettre de précipiter tous les débris cellulaires et d’avoir une
phase aqueuse qui va contenir de l’ADN.

Après centrifugation, on élimine le précipitât et le surnageant : on va l’utiliser pour révéler l’ADN (on va
le précipiter par l’éthanol absolu et là on va voir une méduse d’ADN).

Donc ca c’est des techniques manuelles basées sur

Actuellement, il y a une automatisation de l’extraction de l’ADN : ou bien en utilisant des automates qui
sont basés sur les propriété physico-chi des acides nucléiques et ça sera en fonction de la charge ionique
sur des principes de membranes échangeuses d’ions ou bien des colonnes qui contiennent des
membranes filtrantes et en fonction de la taille des filtres et en utilisant des tampons de solubilité
différente, on peut extraire l’ADN. Mais le principe de base c’ets toujours le même, lyse des rouges, lyse
des blancs puis le reste sur le principe de solubilité différentielle.

C’est l’étape préliminaire indispensable de toute technique de BIomol.

Une fois qu’on obtient cet ADN, il faudra en vérifier non seulement la quantité mais aussi la qualité. Il
faudra avoir non seulement un ADN de bonne quantité mais aussi de qualité qui ne contiendra pas
d’impuretés car toutes les techniques de biomol nécessitent une asepsie rigoureuse.

Comment on vérifie la quantité ? Par des techniques de dosage des ac nucléiques. Ces techniques, c’est
une technique basée sur le principe analytique qui sont l’aspect photométrique : la longueur d’onde
d’absorption des ac nucléiques. Parallèlement à cette longueur d’onde, on va nécessairement mesurer
une deuxième longueur d’onde et c’est la longueur d’onde d’absorption des protéines.

A chaque fois qu’il faudra doser l’adn, il faudra faire une dilution au cinquantième et cela par ce qu’une
unité d’AND est représentée par 50 ng/ul. Arbitrairement, il faudra toujours utiliser ce facteur de
dilution.

L’unité de muse de l’ADN c’est ou bien le ng/ul ou ug/ml car on va travailler avec des volumes de l’ordre
du ul.

Ensuite, on mesure au spectro à 260 pour les ac nucléique de l’adn ET systématiquement les protéines à
280.

Ensuite, on devra faire le rapport entre les deux qui devra être entre 1.8 et 2. Si le rapport est dans cet
intervalle, ça voudra (la quantité d’and extraite par les techniques manuelles donnent des
concentrations d’and qui sont entre 100 jusqu’à 1500 ng/ul, mais les techniques semi automatiques ou
automatisées, ça sera une moindre quantité : pour les tech auto de 20 à 150 ng/ul max).

Si ce rapport est inférieur à 1.8 : contamination par les arn et ce n’est pas bon

Si sup à 2, il y a une contamination par les protéines et toujours, il faudra refaire car dans tous les cas ça
va nous gêner par la suite pour les techniques utilisées pour mettre en évidence les anomalies
moléculaires.

Une fois que l’ADN a été extrait, vérifié. Par la suite, i faudra utiliser des techniques pour mettre en
évidence ce qui ne va pas au niveau de la partie d’ADN qui nous intéresse. Mais avant d’arriver à ces
techn de bases, on va devoir utiliser des outils qui sont différents.

Les premiers outils utilisés ça sera les enz et les premières utilisées c’était des bactéries qui avaient la
capacité de couper au niveau de certaines régions de l’ADN. Mais en majorité ce sont des enz et
actuellement on les appelle des enz de restriction : les endonucléases de classe II (elles vont couper à
l’intérieur de l’adn). Ces endonucléases de classe II sont en générale appelées des enzymes de
restriction et cela pour la simple raison que ces enzymes vont couper à l’intérieur d’un site de
restriction. C’est un site spécifique qui a une particularité : en général, il s’agit d’un site qui se présente
sous forme de palindrome. Pour ces enzymes, on a deux types de coupures : des fois on a des enz qui
coupent au niveau de la même région sur les deux brins d’ADN, on appellera ça des bouts francs, c’est
une coupure franche. Dans d’autres circonstance, on appellera ça des bouts cohésifs et c’est des
coupures alternées (ex : G/AATTC – CTTAA/G). Donc ces enzymes coupent au niveau d’une région bien
précise dans les sites de restriction.

Là, ça représente les enzymes qui sont actuellement utilisées. Les bactéries sont actuellement
abandonnées.

Quand on utilise ces enz ça va être assez simple. Si on a un ADN qui contient une mutation, en utilisant
juste cette enzyme, on va faire la part des choses entre un sujet normal ou pathologique (car l’enzyme
ne coupera pas car elle ne va pas reconnaitre le site).

On a aussi les isoschisomères qui sont des séquences proches qui ne diffèrent pas de grand-chose et ces
iso vont être reconnues par le même type d’enzymes de restriction. (Mais le plus important à retenir,
c’est les enzymes de restriction).

Ces enzymes de restriction auront une nomenclature et c’ets généralement des enz extraites de
bactéries (car c’est chez les bactéries qu’on a d’abord remarqué ces phénomènes de coupures). On a ex
l’eco-R1 (Eco pour e.coli (espèce, R pour RY13 la variété, le numéro pour le numéro d’ordre
d’identification).

Les autres enz utilisées en biomol, o va voir que l’enz phare c’est l’ADN polymérase car toutes es
techniques que l’on va citer reposent sur d’abord une technique d’amplification d’ADN et c’ets une
étape obligatoire. Ça se fera par PCR. Et pour cela, on utilisera une enz spéciale qui ets l’ADN polym.

Il y a des enz terminale transférases qui sont en général qui assurent le transfert des nucléotides.

La transcriptase inverse : pour des techniques particuliers pour transcrire l’ARN en ADN. Utilisées pour
mettre en évidence par exemple les anomalies au niveau du sida etc.

On a aussi les DNA ligase : des enz qui vont raccorder l’ADN et de souder deux brins d’ADN

Les nucléases : qui coupent à l’intérieur des ac nucléique (réécouter ici pour les enz).

Les enz les plus utilisées et les plus importantes : adn polym et la transcriptase revers dans certaines
patho comme le VIH et les DNA ligase.

- Les techniques d’analyse de l’ADN proprement dite :

Comme c’est le cas pour l’extraction de l’ADN, la première technique indispensable, ça va être la
technique d’amplification de l’ADN. Ces techn d’amplifications sont appelées PCR. Ces techniques de
polymérisation et d’amplification est indispensable et systématique pour toute étude génétique et cela
car :

On est sur de la biomol, c’est assez ciblés : donc grâce à cette technique, on va cibler la partie de l’ADN
qui va nous intéresser.

La deuxième raison, comme son nom l’indique c’est une technique d’amplification : donc on va répéter
certaines étapes et ça va augmenter la quantité de l’ADN présent.

Ces tech de polymérisation et de PCR ça a vraiment révolutionné le monde de la biomol car à partir de
cette technique, on a pu avancer vers autre chose et connaitre le génome humain. C’est une technique
assez simple et fréquemment utilisée au labo mais qui nécessite de suivre certaines instructions et de
suivre toujours les mesures d’hygiène et d’asepsie.

C’est une technique d’amplification, méthode simple, rapide et sensible qui nécessite certains
ingrédients spécifiques. C’est un outil de base aux diff tech utilisées par la suite pour mettre en évidence
l’anomalie moléculaire.

Elle a été fondée sur le principe et le mécanisme de réplication de l’adn qui se fait chez l’être humain in
vivo et qui est réalisé par l’ADN polymérase. Cette technique a été calquée en fonction de la réplication
qui se fait chez l’être humain. Et pour répliquer l’ADN, il faut dénaturer le brin parental, par la suite on
utilisera une amorce qui va initier la réplication et ensuite l’adn polym va catalyser l’addition de
nucléotides spécifiques en fonction de l’adn parent et ensuite, après l’étape de réplication, on va
obtenir deux adn néosynthétisées identiques à l’adn parent.

Ce qu’elle nécessite :
- L’élément de base : le prélèvement d’ADN qui sera présent sous forme de double brin. Il faudra
cibler la région que l’on veut analyser.
- Donc le premier ingrédient nécessaire, ça sera des amorces spécifiques. Pour chaque réaction
de PCR, il faudra utiliser un couple d’amorces : une amorce dite sens (forward) et une amorce
antisens (Revers).
Ces amorces : la première amorce sens va cibler là où je devrais commencer à amplifier. La
deuxième amorce, va se situer dans le sens inverse mais dans le second brin (on commence à
gauche pour l’amorce sens et en commence à droite pour l’amorce antisens). Donc ils vont
cibler le début et la fin de la zone à amplifier
- L’enzyme, c’est l’adn polymérase car c’est elle qui va assurer ce phénomène de réplication in
vitro.
- Des nucléotides sous forme de désoxynucléotides tri phosphates dNTP
- Milieu tampon2 et milieu sp2ciale
- MGCL2 : activateur allostérique de l’enzyme allostérique

(réécouter les ingrédients)

Cette réaction se fait par cycle et elle va se dérouler en 3 étapes : dénaturation, hybridation et
élongation.

Dénaturation : elle va se dérouler à température élevée entre 80 et 90°C, en général, c’est 96°C. On va
obtenir de l’ADN sous forme de simple brin.

Hybridation : pour un petit fragment d’ADN, on a une température assez spéciale qui est dite la TM ou
température de fusion moléculaire. A la température TM, c’est le moment où on aura à 50% de l’ADN
simple brin et 50% de l’ADN double brin.

Ps : les amorces c’est des oligonucléotides dont la taille varie entre 18 et 22 paires de bases et en général
c’est 20 paires de bases que l’on utilise). En utilisant la TM, ça va favoriser l’hybridation des amorces sur
l’ADN parental qui a été momentanément dénaturé.

Ici la température varie entre 50 et 62°C. et en fonction de la nature nucléotidique, on va calculer la TM


pour permettre aux oligonucléotides de se fixer aux ADN parentaux.

Elongation : elle est choisie en fonction de l’ADN polym utilisée. En générale, elle se fait à 72°C (elle va
favoriser l’action de l’adn poly). L’ADN polymérase va catalyser l’addition des nucléotides (sous forme de
tri phosphates) nécessaires pour finir le brin d’ADN.

Ensuite, après a fin de ce cycle, ça va être une réaction séquentielle, et ensuite on va avoir : 2, 4, 8,
16…etc.

Généralement, on répète ce cycle de 25 à maximum 30-35 fois et cela dépendra de l’ADN à amplifier (De
la nature et de la constitution nucléotidique. Ex : un ADN riche en GC, ça va être plus difficile de
l’amplifier) et sa longueur.

Tous ces ingrédients sont choisis à différentes concentrations.

Pour l’ADN il faudra une concentration optimale pour pouvoir l’amplifier : Quantité qui varie entre 50 à
150 ng/ul.

Les amorces sont aussi utilisées en C optimale : 0.4/0.8 umol.

Adn polymérase : lorsque l’on procède à des réactions PCR, l’adn est a porté du patient, les amorces
sont à part, mais après on est sur des kit de polymérase qui contiennent l’adn polym 1 à 1.5 U (C pas à
retenir).
Le nombre de cycle est en fonction de la taille du fragment et sa nature : plus il ets grand plus il aura
besoin de cycle et plus il a de GC et plus il aura besoin de cycles aussi.

Comment on calcul ?

Après 30 cycles, (réécouter). On dira qu’on aura 2^.

Avant d’arriver à cette étape, comment choisir les amorces ? : les amorces sont commercialisées en
fonction de l’ADN que l’on va analyser et elles sont commandées par le manipulateur lui-même selon la
pathologie sur laquelle il est.

Calcul de la TM : il y a un rapport et uen formule :

Pour une taille d’amorce de 18 à 22, la formule utilisée à

(4GC + 2AT) : on calcule le nombre de T, de A, de G, de C… puis on fait ce calcul.

Comment choisir les bonnes amorces pour que ceux-ci se fixent (c’est l’étape limitante) : après avoir
calculée la taille des amorces, il va falloir vérifier que les amorces respectent certaines conditions :

1er condition : la taille du couple doit être similaire.

2ème : faut aller voir au niveau de l’ADN à analyser que le couple d’amorce n’est pas complémentaire
pour éviter que les amorces se collent entre eux au lieu de l’AND°. Il faut que la séquence de l’amorce
ne va pas s’hybrider sur elle-même.

3ème Au niveau de la séquence même de l’amorce que l’on va choisir, il ne faut pas qu’elle forme une
forme secondaire.

4ème Il faudra choisir un couple d’amorce dont les TM ne différent que de max 5°. Si on a une variation
max de 5°, on choisira la plus faible.

La réaction PCR : c’est une réaction cinétique car l’enz qui va réaliser cette réaction est une enz
allostérique donc on aura les deux phases de la réaction enzymatique : une réaction exponentielle pour
atteindre un plateau qui est la phase en plateau.

En pratique, on va travailler sur des tubes miniatures. C’est des tubes épindorphes( ?) de 1.5 ml et pour
la PCR elle-même, on va être sur des tubes epindorphes mais de 800 ul. On met les ingrédients, l’adn, les
amorces…etc.

Dernière étape : on est sur u cycle et l’on voit très bien que les températures diffèrent beaucoup, donc
on doit utiliser un appareil qui pourra faire varier très rapidement la température : le thermocycleur.

- Techniques de séparation de l’ADN :

Une fois que la PCR et le programme en lui-même ets finie, il faudra vérifier si la réaction a marché ou
pas. Et pour cela, on va utiliser des techniques de séparation de l’ADN.

En générale, pour les PCR, ça va être pour cibler la région d’ADN qui m’intéresse. Il faudra lancer en
parallèle un blanc réactif comme pour la biochimie mais son intérêt ici est différent. Comme on a dit
dans la biomol la contamination ets un facteur très important. Donc il faudra à chaque fois vérifier s’il n
y a pa de contamination. Et pour cela, on va utiliser un blanc et pour ça on va utiliser une eau stérile et à
la fin on ne doit pas trouver de fragment d’AND et ça va me servir à valider la pureté de la PCR.
Après avoir fini, il faudra aller voir le fragment qui a été amplifié et pour cela, on utilise les tech de
séparation : la plus utilisée est la technique d’électrophorèse. Une électrophorèse spéciale pour les ac
nucléiques.

Cette électrophorèse, comme toute électrophorèse on aura besoin d’un support et d’un tampon que
l’on va soumettre à migration au niveau d’un courant électrique. L’adn est chargé négativement, on va
choisir un tampon de telle sorte qu’il va être chargé – et migrer vers le pole +. Ça sera un gel spécial qui
est le gel d’agarose qui est utilisé pour la biomol et cela à différentes concentrations en fonction de la
taille du gène que je veux mettre en évidence.

C’est une poudre que l’on va solubiliser dans un tampon spécial et ensuite on va couler, mettre des puits
et par la suite introduire notre ADN.

Notre ADN va être incolore. Il faudra lui rajouter un colorant, le plus utilisé c’est le bleu de bromophénol
+ un agent qui va servir à précipiter l’ADN (le xylène cyanol ou le glycéro).

On va prendre une petite quantité des réactions PCR auxquels onva ajouter ce colorant et le xylène, on
va les mettre dans un puits puis on va les soumettre dans un champ.

Pour visualiser l’ADN, le gel d’agarose contient un produit particulier qui est un agent intercalant et le
plus utilisé c’est le bromure d’étidium BET (?). Cet agent est fluorescent et en l’utilisant, on va visualiser
le gel sous UV et ça va émettre une fluorescence qui va permettre de visualiser la bande d’intérêt et
nous dire si le résultat est bon.

Autres méthodes de séparation : par ultracentrifugation basée sur la densité des éléments contenus
mais c’est des tech pas utilisées en routine

Et des techniques de chromato mais surtout dans les labos de recherche.

- Techniques de détection de mutation :

Après avoir ciblé l’adn à analyser, il faudra aller identifier éventuellement l’anomalie moléculaire pour
poser un diagnostic. Pour cela, i y a différentes techniques. L’une de ces techniques :

La technique de Southern blot : technique de référence pour mettre en évidence les grands
réarrangements qui vont avoir lieu au niveau de l’ADN.

Cette technique repose sur deux principes : il y a l’amplification du fragment d’intérêt bien sûr, mais on
va utiliser des enzymes de restriction et ensuite on va utiliser ce qu’on appelle des sondes spécifiques
(comme les oligoéléments, c’est comme les amorces) et on va utiliser le principe d’hybridation
moléculaire.

Après amplification du grand fragment, on va utiliser des enzymes de restriction. Ex sur un élément de
1kb, après amplif, on utilise 4 ou 5 enz de restrictions qui vont couper à des régions diff et donner des
tailles diff. Ensuite après avoir mis ces enz (qui sont fonctionnelles à une T de 7°), on va faire un transfert
des fragments obtenus après coupure sur une membrane de nitro cellulose et ensuite on va utiliser pas
des amorces mais des sondes (qui ressemblent aux amorces : c’est des oligonucléotides dont la
composition est connue) et en utilisant les bonnes TM vont s’hybrider en fonction du lieu de la coupure.
Donc ça c’est dans le cas normal, mais s’il y a anomalie moléculaire, il n’y aura pas toutes les coupures
ou plus de coupures.

C’est la technique utilisée surtout pour les grands réarrangements et par exemple : l’X fragile : due à une
répétition de 3 nucléotides CGG.

Cette technique permet d’avoir la taille exacte du fragment et le nombre de répétitions.


Donc la PCR en elle-même ne vas pas suffire à mettre en évidence l’altération au niveau de l’ADN. Pour
les pathologies, on a ce qu’on appelle différentes altérations de l’ADN, c’est les mutations (mutation
juste par changement d’un nucléotide qui va entrainer changement d’acide aminé s’il touche un
domaine fonctionnel on appelle ça une mutation faux sens et on a aussi des mutations non-sens c’est à
dire la modif du nucléotide va entrainer l’apparition d’un codant stop prématuré et on a aussi des
mutations par délétion ou insertion d’un ou plusieurs paires de bases). Donc, en fonction de la mutation
recherchée, il faudra adopter une certaine stratégie.

Si on veut mettre en évidence les mutations ponctuelles, s’il y en a une seule ou deux sur une séquence
d’AND et que cette mutation est accessible à une enzyme de restriction, on utilise directement une enz
de restriction.

Mais si on est sur un gène qui contient plusieurs codant et qu’il faudra rechercher une mutation privée
ou spécifique qui peut se trouver au niveau de n’importe quelle région des codants, il faudra utiliser des
techniques plus poussées. En biomol, il y a une technique qui permet de mettre avec exactitude la
constitution nucléotidique de notre ADN : c’est le séquençage de l’AND. C’est la technique de référence.
Elle a été mise au point pour mettre en évidence les anomalies moléculaires parce que cette technique
de séquençage va rétablir la constitution nucléotidique de l’ADN à analyser base par base et en
comparant cette composition par rapport à une référence sauvage c’est-à-dire normale, on va pouvoir
mettre en évidence l’anomalie moléculaire en question. Mais elle est cher et elle nécessite un
appareillage très cher.

Pour les mutations, on a les mutations par délétion, insertions ou les mutations ponctuelles (on a les
deux types de mutations faux sens et non-sens).

- Application de la PCR :

Si on a une PCR et détection de délétion  ex myopathie de Duchêne : on a un grand gène et une


délétion de certains exons. On peut réaliser facilement le diagnostic en faisant une PCR multiplex pour
détecter les délétions.

C’est-à-dire le gène est assez grand, il est formé de 21 exons. On va tous les amplifier et ensuite on va
faire une électrophorèse. Chaque exon aura une taille bien précise et on va amplifier PCR multiplex, car
dans un même tube, on va amplifier plusieurs fragments (chaque fragment a besoin d’un couple
d’amorces). On est sur une PCR multiplex donc on va amplifier dans un tube plusieurs fragments. Donc,
par exemple si on a 6 fragments on aura besoin de 12 amorces qui seront choisies pour avoir des
fragments de tailles différentes pour pouvoir les visualiser dans l’électrophorèse pour qu’ils ne migrent
pas dans la même région.

Pour les pathologies où il y a délétion de certains exons comme la myopathie de Duchêne, on va


amplifier tous les exons et ensuite faire une migration et on va vérifier s’il y a tous les exons et s’il y en a
qui manquent et là on va mettre en évidence le problème.

PCR couplée à la restriction enzymatique (digestion enzymatique) : on va avoir une région où je vais
avoir une mutation ponctuelle comme la drépanocytose. Pour un individu normal, on va avor une
coupure en utilisant une enzyme spécifique un fragment coupé à 1.2kb, si on a la mutation (comme
pour la drépanocytose), on va avoir un changement de nucléotide où l’on va transformer glu (HbA) en
val (HbS) par transformation d’une A en T. Pour un individu ayant une drépanocytose homozygote, on
va avoir un cycle de restriction supplémentaire qui va donner un fragment à 1.4 kb.
Donc en couplant la PCR et ensuite ne soumettant le fragment à une enzyme de restriction spécifique.
Ensuite en fonction du profil, on fera une deuxième électrophorèse pour voir les fragments obtenus (la
première électrophorèse, rappelez-vous sert à vérifier si la PCR a marché). Si j’obtiens de 1.2 kb,
l’individu est normal, si les deux, il est hétérozygote et si j’obtiens le 1.4, c’est un drépanocyte
homozygote. Et c’est assez simple car les outils sont moins couteux et c’est plus rapide.

ACRS Amplification Created Restriction Sites : des fois, on est sur des pathologies pour lesquelles il y a
une mutation ponctuelle, mais qui n’a pas de site de restriction naturel. Donc on va introduire une
amorce qui est modifiée artificiellement par un mésappariement d’une paire de base de telle sorte de
créer un site de restriction pour l’enzyme utilisée. Par exemple, on a la MSP1 qui coupe au niveau du
site CCGG. On va aller sur un ADN qui ne contient pas ce site de restriction, mais en regardant bien, si je
choisi une amorce et que je modifie un nucléotide, la modification d’un nucléotide sur les 20, va
permettre l’appariement avec la matrice. Donc ça va juste aider à la création d’un site de restriction, le
principe étant le même.

ASO Allele Specific Oligonucleotide : là c’est comme les techniques de southern blot. On va utiliser une
hybridation en utilisant des sondes qui vont s’hybrider au niveau d’une région particulière de l’allèle.
Mais ça va être associé à des outils pour mettre en évidence les anomalies moléculaires. On a ici un
exemple d’allèle : on utilise une sonde qui est un oligonucléotide d’à peu près 20 paires de bases, de 40
…etc. En fonction de la sonde utilisée et de son hybridation. Pour une pathologie donnée, on va mettre
une évidence s’il y a une mutation ou pas. Bien sûr, toujours associé à une méthode de détection qui est
en général l’électrophorèse dans ce cas-là.

ARMS : Amplification Refractory Mutation System : là, on va réaliser deux PCR et avec 3 amorces. On a
une amorce sens qui est spécifique de la mutation, une amorce spécifique de la base sauvage et une
amorce revers. Ici on va juste jouer sur les amorces et ici c’est aussi une technique qui varie la PCR
couplée à l’électrophorèse. En fonction de si le malade est normal ou muté, on va avoir une hybridation
du couple S et l’amorce revers ou alors en fonction de l’hybridation de l’amorce normale avec une
revers…etc, on va juste jouer sur les éléments, des variants qui vont nous srevir à détecter assez
rapidement la mutation.

RT-PCR : transcriptase revers : on part d’un acide nucléique qui est l’ARN et on utilise en plus une
enzyme qui est la transcriptase revers. On va transcrire et faire le chemin inverse en faisant la
transcription de l’ARN en ADN codant et ensuite procéder à la réaction d’amplification. Pour les rt-pcr,
ce sont des techniques utilisées pour l’exploration du virus VIH.

Techniques pour la recherches de nouvelles mutations :

Là, on était sur des mutations connues qui sont les mêmes chez tous les individus : comme la drépano,
c’est un changement de glu en val chez tous le spatients. Par contre, sur d’autres pathologies, ça va etre
des mutations privée, familiales qu’il faudra rechercher sur toute la taille des parties codantes. Il faudra
donc utiliser d’autres techniques.

On a tout d’abord, les techniques de mise en évidence de variants de séquences. Lorsqu’on a un ADN
d’une certaine longueur et qu’on va mettre en évidence une variation, on ne va pas tout de suite
s’enchainer et dire on a trouvé une mutation, c’est bon on a posé le diagnostic. Devant toute variation,
on va appeler ça une variation de séquence. Il faudra prouver que ce changement que cette variation est
délétère, en génétique cette terminologie est celle qui est utilisée : il faut dire que cette mutation est
délétère, donc variation qui provoque la symptomatologie chez le patient. Quand on trouve un
changement, on l’appellera variation et il faudra prouver que c’est une mutation. Comment ? On va aller
voir la protéine, voir si ça change un AA ou si ça crée un codon stop. Quand on a des délétions ou des
insertions, c’est souvent pathogène, mais quand il y a une variation, il faudra voir si ce nucléotide
change au niveau de la protéine, s’il touche un AA qui touche un domaine fonctionnel ou crée un codant
stop.

Et ensuite, quand on donne une nomenclature, on va toujours aller vérifier si cette mutation a été
décrite ou pas, si elle est dans la littérature ou si c’est une nouvelle mutation. Et si c’est le cas, il faudra
avoir près de 100 échantillons et faire une banque d’AND et voir si cette mutation n’est pas retrouvée
chez tout le monde our dire qu’elle est pathogène.

Pour mettre en évidence ces nouvelles variations, il faudra adopter une stratégie : il y a d’abord les
techniques de balayage qui vont nous permettre de dire si l’ADN est normal ou s’il présente une
variation qui est intéressante et qui mérite qu’on s’y arrête et que l’on regarde de plus près pour voir si
elle entraine une mutation. Cette technique permettra de séparer les profils normaux et intéressants et
ensuite on passera à la technique de séquençage.

Les techniques sont nombreuses : certaines sont abandonnées, parmi ces techniques : SSCP, DGGE, et
des techniques qui vont permettre de mettre en évidence les hétéroduplex.

Il y a aussi des méthodes qui reposent sur des clivages enzymatiques en utilisant des RNases et des
méthodes chimiques ou de chromatographie (CCM, FAMA, clivage à la carbodiimide) et bien sur les
techniques par la suite qui vont permettre d’identifier la mutation c’est les techniques de séquençage
de l’ADN.

Donc toutes ces techniques sont des techniques de balayage (sauf le séquençage), de première
intention et ensuite si on trouve une anomalie, une variation ou un profil intéressant, on passera à une
technique plus performante qui est le séquençage.

SSCP : c’est un polymorphisme de conformation simple brin. Méthode d’électrophorèse qui révèle les
polymorphismes de conformation.

On va prendre la molécule d’ADN sous forme de double brin, on va la dénaturer. Ensuite, deux
molécules d’ADN simple brin issues de la dénaturation d’un ADN bicaténaire vont adopter chacune, en
se renaturant, une certaine conformation. En fonction de leur séquence, on va les soumettre à un
protocole d’électrophorèse et en fonction de la conformation, on va voir s’il y a une variation par
rapport à un témoin sauvage.

Donc, en fonction de la conformation obtenue, on va éliminer (c’est pour ça que c’est une technique de
première intention de balayage), on va dire qu’ils sont normaux ou alors qu’ils ont un profil suspect que
l’on va analyser par la suite par la technique de séquençage.

C’est une technique assez rapide et simple et qui ne nécessite pas trop d’équipement spécifique. La
limite c’est la taille limite du fragment à analyser qui ne doit pas dépasser les 400/500 paires de bases.
Et ne détecte pas bien sur toutes les substitutions.

Technique DGGE (polymorphisme de conformation en gradient dénaturant). Avec la SSCP c’est les deux
premières techniques à avoir été mises en évidence. Et là, on va faire migrer l’ADN, mais cette fois-ci on
va le faire migrer dans un gel qui contient un gradient, un gradient dénaturant. Un agent qui va favoriser
la dénaturation de l’ADN. Plus on avance dans le gel, plus le gel sera dénaturant. C’est du formamide en
générale qui va ouvrir l’ADN, on va utiliser un support d’agarose ou de polyacrylamide qui contient une
concentration qui s’élèvent en agent dénaturant. Et en fonction du profil de migration de notre ADN, on
va voir s’il y a une variation entre les patients à tester et les patients sauvages.

La DGGE est utilisée de moins en moins à l’heure actuelle.

La technique qui est maintenant de plus en plus utilisée c’est la technique de DHPLH : chromatographie
liquide haute performance mais en condition dénaturante. On va faire une PCR du fragment que l’on
veut analyser. Ensuite, cette PCR va être soumise à des étapes de dénaturation/renaturation (On
n’oublie pas qu’on veut rechercher s’il y a une anomalie, une variation au niveau de notre séquence).
Donc si on a une mutation une T qui est remplacée par une G, par exemple. Donc on va soumettre le
produit PCR à des étapes de dénaturation et renaturation pour favoriser la formation de ce que l’on
appelle les hétéroduplex. On n’oublie pas que la mutation peut être présente à l’état homozygote ou
hétérozygote, donc en favorisant la dénaturation et la renaturation, on va favoriser la formation de ce
qu’on appelle des hétéroduplex (c’est les fragments d’AND mésappariés) et ces fragments d’ADN
mésappariés ont une particularité par rapport aux fragments d’AND appariés, c’est qu’ils sont moins
stables. Donc quand on les fait passer en électrophorèse, on va avoir un petit pic qui correspond aux
hétéroduplex. Si j’ai des hétéroduplex, il faudra aller voir de plus près ce qu’il se passe.

Mais c’est des techniques d’orientation, de première intention. Elles ne vont pas se prononcer sur le fait
pathologie ou pas.

Technique de référence  le séquençage :

C’est la technique qui va permettre de rétablir la constitution en nucléotide base par base. Et après avoir
obtenu le résultat, on n’aura qu’à comparer avec la séquence sauvage et voir s’il y a variation ou pas. Et
c’est la technique le plus couteuse pour l’identification des mutations.

Il ressemble à la PCR et il nécessitera les même ingrédients que la PCR : polymérase, dNTP, MgCl2,
l’amorce…etc.

Sauf que l’on va travailler sur le produit spécifique amplifié.

Deuxième différence, c’est quelque chose qui est en plus : il y aura un ingrédient en plus qui est le
ddNTP (ce sont déoxy-désoxy-nucléotide triphosphate : l’ADN est déshydroxylé en 2’, ici ils sont en plus
déshydroxylés en 3’). Ils sont présents en faible concentration et sont marqués par un produit
fluorescent. Chaque base sera marquée.

Ils sont présents en faible concentration, ils sont déshydroxylés en plus du 2 ‘, en 3’ et ils sont
fluorescents.

Qu’est ce qui va se passer dans le tube ? On va utiliser la matrice qui est le produit PCR, l’ADN à
séquence. Il y aura une polymérisation, mais au moment où la polymérisation va introduire
aléatoirement le DDNTP, il y aura un arrêt de l’élongation, car l’élongation se fait de manière 5’3’.
Alors lorsque la polymérase introduira le ddNTP à la place du dNTP, il y aura un arrêt de l’élongation. Ils
sont présents en faible C donc ce n’est pas à chacune que les ddNTP vont être introduits. Donc au niveau
de chaque barrette de ma réaction de séquence, on va avoir différents produits, différents fragments de
tailles différente en fonction du ddNTP introduit.

Si on est, par exemple, au niveau d’un fragment d’ADN de 200 paires de bases que l’on va séquencer.
Lorsqu’on le met dans notre tube, lorsqu’il va amplifier 50 paires de bases, il va introduire le ddNTP.
Ensuite, il recommence, peut-être qu’il fera 60, ou 150. Donc il va amplifier et à l’intérieur, on va avoir
des fragments de longueurs différentes en fonction de l’introduction des ddNTP.

Comme ces ddNTP sont marqués, en reliant cette réaction de séquence, cette polymérisation à une
électrophorèse automatique, on va obtenir un électrophorégramme qui va nous donner une séparation
de notre fragment en fonction de la taille et de la constitution nucléotidique puisque chaque ddNTP a
été marqué.  C’est ça la réaction de SANGER : ce qu’on a en plus, c’est le ddNTP, donc.

La PCR en temps réel :

C’est une PCR qui est associée à un système de quantification. Donc quand on est sur gel d’agarose c’est
qualitatif, absence ou présence, mais ici c’est quantitatif. On va la coupler à un agent intercalant qui va
absorber à une longueur d’onde qui va être relié à un système informatique qui va quantifier en temps
réel la PCR.

Donc c’est comme la PCR mais avec un agent intercalant en plus qui va émettre une fluorescence et relié
à une mesure spectrophotométrique reliée à un ordinateur qui va nous donner la quantité de la PCR à
chaque ampliquant. Pas beaucoup d’applications en biochimie mais beaucoup d’application en virologie
pour la charge virale.