Objetivos

Objetivo General

Comprender el contexto de los conceptos relacionados con la tecnología del ADN y ADN
recombinante.

Objetivos específicos

 Indagar temáticas relacionadas con la tecnología el ADN y ADN recombinante.

 Resolver cuestionario propuesto para conocer y afianzar conocimientos y así tener las
bases para dar solución a las demás actividades propuestas.
1. ¿Qué es la ingeniería genética, cuál es el primer desarrollo de ingeniería genética
registrado en el mundo? Mencione al menos cuatro aplicaciones que tenga la ingeniería
genética.

La ingeniería genética: Son metodologías que permiten transferir genes de un

organismo a otro y expresarlos (producir las proteínas para las cuales estos genes codifican)
en organismos diferentes al de origen.

Es un organismo vivo que ha sido creado artificialmente manipulando sus genes. Las
técnicas de ingeniería genética consisten en aislar segmentos del ADN (el material genético)
de un ser vivo (virus, bacteria, vegetal, animal e incluso humano) para introducirlos en el
material hereditario de otro. La obtención de un organismo transgénico mediante técnicas de
ingeniería genética implica la participación de un organismo que dona el gen de interés y un
organismo receptor del gen que expresará la nueva característica deseada.

Primer Desarrollo de ingeniería Genética en el mundo: Si bien podemos hablar de

cruce para modificar genéticamente seres vivos comenzando en las prácticas de las tribus
centroamericanas, el justo comienzo para la ingeniería genética se debe establecer en William
James Beal. Éste botánico estadounidense desarrolló cruces de maíz valiéndose de sus
conocimientos científicos, consiguiendo al finalizar su experimento en 1879 mejorar la
producción de maíz en un 50%.

Aplicaciones que tenga la ingeniería genética.

Agricultura: La tecnología de recombinación celular ha logrado alterar el genotipo de

las plantas con el objetivo de hacerlas más productivas, resistentes a plagas o más nutritivas.
Estos productos son los llamados organismos o transgénicos.

Industria de alimentos: Cada día en los supermercados del mundo, las perchas se llenan
de productos desarrollados a partir de organismos genéticamente alterados. La industria
alimenticia ha encontrado en la ingeniería genética una forma de abaratar costos, aumentar
la producción y encontrar nuevos productos elaborados mediante la investigación genética.
 Limpieza ambiental: La tecnología de recombinación de ADN está siendo utilizada para
restaurar ambientes contaminados, mediante la utilización de seres vivos (microorganismos)
modificados genéticamente que pueden producir la degradación de basura, derivados de
petróleo o desechos industriales tóxicos.

Producción de energía: La tecnología de recombinación genética está teniendo un alto

impacto en la producción de energía. Cada año se producen inmensas cantidades de
biocombustibles (de colza, de soya…), aceites, alcohol o diesel con productos surgidos de
cultivos energéticos que crecen rápidamente y con gran resistencia a partir de organismos
genéticamente alterados.

2. ¿Qué es el ADN recombinante y cómo participa en los procesos de clonación

molecular?

La técnica del ADN recombinante se utiliza en estudios sobre la regulación de la

expresión génica, en la regulación de la producción comercial de síntesis de proteínas como
la Insulina o la hormona del crecimiento, en el desarrollo de organismos transgénicos y en la
amplificación del ADN, es decir, en obtener un gran número de copias de un gen
determinado.

La técnica consiste en introducir el gen seleccionado en el interior de un vector y éste, a

su vez, dentro de una célula, denominada célula anfitriona. Aprovechando la maquinaria
celular, el gen se expresa, sintetizándose así la proteína codificada en el gen. Además, al
dividirse la célula, las nuevas células formadas contienen ese gen que también sintetizan esa
proteína. Se genera un grupo celular que contiene un genoma distinto.

3. ¿Cuáles son los pasos experimentales que se llevan a cabo en la tecnología de ADN
recombinante?

La tecnología de ADN recombinante comprende una variedad de protocolos

experimentales que permiten la transferencia de información genética (ADN) de un
organismo a otro. En este sentido, no existe un solo protocolo para tal fin, sin embargo, el
proceso de esta tecnología involucra algunos pasos claves:
 Primero, el ADN es cortado en puntos específicos por las enzimas endonucleasas de
restricción.

En segundo lugar, se seleccionan pequeños fragmentos de ADN con capacidad para

autorreplicarse, conocidos como vectores de clonación que típicamente son plásmidos o
ADN viral.

Después, se unen dos fragmentos de ADN por enlaces covalentes por medio de las
enzimas ADN ligasas. Los fragmentos de ADN de distintas fuentes unidos covalentemente
se llaman ADN recombinantes.

Posteriormente, el ADN recombinante es llevado del tubo de ensaye a una célula

hospedera que provea la maquinaria molecular para la replicación. Finalmente, se identifican
y seleccionan las células hospederas que contienen ADN recombinante.

4. ¿Qué son las enzimas, cuál es su mecanismo de funcionamiento, cuál es su estructura

molecular y cómo se clasifican de acuerdo a la Unión Internacional de Bioquímica y
Biología Molecular?

Las enzimas son polímeros biológicos que catalizan las reacciones químicas que hacen
posible la vida tal como la conocemos. La presencia y el mantenimiento de un conjunto
completo y equilibrado de enzimas son esenciales para la desintegración de nutrientes a fin
de que proporcionen energía y bloques de construcción químicos; el montaje de esos bloques
de construcción hacia proteínas, DNA, membranas, células y tejidos, y la utilización de
energía para impulsar la motilidad celular, la función neural y la contracción muscular. Casi
todas las enzimas son proteínas.

Las enzimas son indispensables para la vida y catalizan alrededor de 4000 reacciones
químicas conocidas, siempre que sean estables las condiciones de ph, temperatura o
concentración química, ya que las enzimas, al ser proteínas, pueden también desnaturalizarse
y perder su efectividad.

La mayoría de las enzimas se componen de proteínas globulares de tamaño muy

variable: desde monómeros de 62 aminoácidos, hasta enormes cadenas de alrededor de 2500.
Sin embargo, apenas unos pocos de ellos son los involucrados directamente en la catálisis de
la reacción, conocidos como centro activo.

La secuencia en que se ensamblen todos estos aminoácidos determina la estructura

tridimensional de la enzima, lo cual dictamina también su funcionamiento específico. A
veces esta estructura también posee sitios para atraer cofactores, es decir, otras sustancias
cuya intervención es necesaria para producir el efecto buscado.

Los nombres de uso frecuente para casi todas las enzimas describen el tipo de reacción
catalizada, seguido por el sufijo; por lo tanto la International Union of Biochemists (IUB)
creó un sistema de nomenclatura de enzimas sin ambigüedad en el cual cada enzima tiene un
nombre y número de código singular que identifican el tipo de reacción catalizada y los
sustratos comprendidos; así, las enzimas se agrupan en seis clases:

1. Oxidorreductasas: catalizan oxidaciones y reducciones.

2. Transferasas: catalizan la transferencia de porciones, como grupos glucosilo, metilo o

fosforilo.

3. Hidrolasas: catalizan la división hidrolítica de C—C, C—O, C—N y otros enlaces

covalentes.

4. Liasas: catalizan la división de C—C, C—O, C—N y otros enlaces covalentes mediante
eliminación de átomo, dejando dobles enlaces.

5. Isomerasas: catalizan cambios geométricos o estructurales dentro de una molécula.

6. Ligasas: catalizan la unión de dos moléculas en reacciones acopladas a la hidrólisis de

ATP.

5. ¿Qué son las enzimas de restricción, cuál es el origen evolutivo de las enzimas de
restricción y cómo se define su nomenclatura?
 Una enzima de restricción o endonucleasa de restricción es una enzima que corta el
ADN en fragmentos en o cerca de sitios de reconocimiento específicos dentro de la molécula
conocida como sitios de restricción. Son una clase del grupo más amplio de enzimas
endonuleasas.

Probablemente evolucionaron a partir de un ancestro común y se extendieron a través

de la trasnferencia horizontal de genes. Además, existe una creciente evidencia de que las
endonucleasa de restricción evolucionaron como un elemento genético egoista.

Desde su descubrimiento en la década de 1970, se han identificado muchas enzimas de

restricción; por ejemplo, se han caracterizado más de 3500 enzimas de restricción Tipo II
diferentes. Cada enzima lleva el nombre de la bacteria de la que se aisló, utilizando un sistema
de nombres basado en el género bacteriano, las especies y la cepa. Por ejemplo, el nombre
de la enzima de restricción EcoRI se obtuvo como se muestra en el cuadro.

6. ¿Qué organismos producen enzimas de restricción de forma natural? y, ¿Tienen estos

organismos alguna relación desde el punto de vista filogenético?

Estas enzimas se encuentran en bacterias y arqueas y proporcionan un mecanismo de defensa

contra los virus invasores.

Las bacterias son un tipo de célula biológica. Constituyen un gran dominio de

microorganismos procariotas. Por lo general, de unos pocos micrómetros de longitud, las
bacterias tienen varias formas , que van desde esferas hasta varillas y espirales . Las
bacterias estuvieron entre las primeras formas de vida en aparecer en la Tierra, y están
presentes en la mayoría de sus hábitats . Las bacterias habitan suelo, agua, aguas termales
ácidas , los residuos radiactivos , y las porciones profundas de la corteza terrestre.

Las arqueas constituyen un dominio de organismos unicelulares. Estos organismos son

procariotas y no tienen núcleo celular. La clasificación es difícil porque la mayoría no se
han aislado en el laboratorio y solo se han detectado mediante el análisis de sus ácidos nucleicos en
muestras de su entorno.

Las arqueas y las bacterias son generalmente similares en tamaño y forma, aunque algunas
arqueas tienen formas muy diferentes, como las células planas y cuadradas. A pesar de esta
similitud morfológica con las bacterias, las arqueas poseen genes y varias vías
metabólicas que están más estrechamente relacionadas con las de los eucariotas,
especialmente para las enzimas involucradas en la transcripción y traducción .

Desde el punto de vista filogénico, este consiste en el estudio de las relaciones evolutivas
entre diferentes grupos de organismos a partir de la distribución de los caracteres primitivos
y derivados en cada taxón, utilizando matrices de información de moléculas de ADN y de
morfología. Por lo tanto estos organismos tienen una estrecha relación. Con esta información
se establecen los arboles filogenéticos, base de la clasificación filogenética.

7. Las enzimas de restricción se han clasificado en función de su composición y los

requisitos del cofactor enzimático, la naturaleza de su secuencia diana y la posición de
su sitio de escisión del ADN en relación con la secuencia diana. Con base en lo anterior,
¿cuántos tipos de enzimas de restricción se reconocen actualmente? Describa las
características comunes de cada tipo.

Existen 5 tipos de enzimas de restricción:

1. Tipo I y Tipo III:

a. Tienen actividad de restricción (cortan) y modificación (metilan).

 b. Cortan a cierta distancia de la secuencia de reconocimiento, las Tipo I cortan
lejos de la secuencia de reconocimiento, ya sea río arriba o río abajo. Las Tipo
III cortan de 5-8 bases antes o después de la secuencia que reconocen.

c. Necesitan ATP para moverse a través de la molécula de DNA, desde el lugar de

reconocimiento hasta el sitio del corte.

2. Tipo II:

a. Sólo tienen actividad de restricción.

b. Cortan de manera consistente y predecible dentro de la secuencia que

reconocen.

c. Sólo requieren Mg++ como cofactor.

d. No necesitan ATP.

3. Tipo IV
a. Las enzimas de tipo IV son fáciles de identificar ya que cortan ADN con
marcas de metilación, están conformadas por varias subunidades diferentes que
se encargan de reconocer y cortar la secuencia de ADN.

b. Estas enzimas utilizan como cofactores GTP y magnesio divalente.

4. Tipo V

a. Esta clasificación agrupa a las enzimas tipo CRISPER-Cas, que identifican y cortan
secuencias específicas de ADN de organismos invasores.
 b. Las enzimas Cas utilizan una hebra de ARN guía sintetizado de CRISPER para
reconocer y atacar a los organismos invasores.

c. Las enzimas clasificadas como tipo V son polipéptidos estructurados por enzimas
de tipo I, II y II.

d. Pueden cortar secciones del ADN de casi cualquier organismo y con gran rango de
longitud. Su flexibilidad y facilidad de empleo hacen a estas enzimas una de las
herramientas más empleadas en la ingeniería genética actualmente junto con las
enzimas tipo II.

(Raquel Parada Puig)

8. ¿Cuál es la función biológica de las enzimas de restricción? y, ¿Cuál es su función en

aplicaciones tecnológicas?

Funciónes: Las enzimas de restricción cumplen la función opuesta de las polimerasas,

ya que estas hidrolizan o rompen el enlace éster dentro del enlace fosfodiéster entre
nucleótidos adyacentes en una cadena nucleotídica.

En la biología molecular y la ingeniería genética son herramientas muy utilizadas para

la construcción de vectores de expresión y clonamiento, así como para la identificación de
secuencias específicas. También son útiles para la construcción de genomas recombinantes
y tienen gran potencial biotecnológico.

Los avances recientes en terapia génica hacen uso corriente de las enzimas de
restricción para la introducción de genes determinados en vectores que son vehículos para
el transporte de tales genes hacia las células vivas, y que probablemente tienen la habilidad
de insertarse en el genoma celular para realizar cambios permanentes.

(Raquel Parada Puig)

9. Mencione 5 ejemplos de enzimas de restricción mencionando detallando el nombre
de la enzima, su origen bacteriano, el sitio de reconocimiento y su resultado de corte
(organícelo en un cuadro).

10. ¿Cómo es el mecanismo de reconocimiento y corte de ADN de las enzimas de

restricción? Utilice imágenes como gestión visual para explicar el proceso.

Estas funcionan como verdaderas tijeras moleculares capaces de cortar el DNA con
precisión en lugares bien definidos, se conocen numerosas encimas de restricción, que son
aisladas de bacterias y el nombre de la encima está relacionada con el organismo de donde
esta fue aislada. Las enzimas de restricción reconocen y actúan sobre secuencias específicas
de DNA que son los sitios de acción y producen la ruptura del enlace fosfodiester entre dos
nucleótidos consecutivos ligados a determinadas bases, un corte en un fragmento de DNA
por una encima de restricción origina dos fragmentos cuyas extremidades resultantes pueden
ser de tipo cohesivas por tanto las extremidades serán compatibles lo que posibilita el
apareamiento entre bases complementares por la enzima llamada DNA ligasa que cataliza la
unión entre el grupo fosfato unido al carbono 5 y el grupo hidroxila unido al carbono 3. Al
observar la molécula DNA 1 en azul, la molécula DNA en verde se colocan esta moléculas
de DNA cada una a parte se digieren con la encima de restricción BAN H1, donde se forman
extremos cohesivos y después hay un apareamiento y unión por medio de la enzima DNA
ligasa y tenemos nuestra molécula DNA recombinante.

Las enzimas de restricción son enzimas muy específicas, que reconocen una secuencia
corta de ADN duplex rompiendo las dos hebras en los "sitios de reconocimiento" o de
restricción.

Según el tipo de enzima, el sitio de reconocimiento puede coincidir con el sitio de corte o
no. Los sitios de restricción son secuencias cortas, de cuatro a ocho pares de bases.

Los extremos generados por el corte pueden ser "romos", es decir, que los extremos no
tienen bases desapareadas. También, los sitios de corte pueden generar extremos cohesivos
o escalonados, que contienen bases desapareadas. Los extremos cohesivos son muy reactivos,
por lo que reciben el nombre de "pegajosos", ya que se adhieren a fragmentos de ADN con
secuencias de bases complementarias.

11. ¿En qué consiste el sistema de modificación-restricción de las células procariotas,

cuántos tipos de sistemas (RM, por sus siglas en inglés) existen y, ¿cuál es su
aplicación en procesos de clonación molecular?

La restricción y modificación fue descubierta en 1968, a resultas de una serie de estudios

sobre la infección del fago l en dos cepas diferentes de Escherichia coli (las llamadas cepas
“K12” y “B”): La restricción es un sistema que poseen muchas cepas bacterianas, y
representa una especie de “barrera” frente a la permanencia de ADN extraño que hubiera
podido entrar por alguno de los sistemas. De esta forma, las bacterias evitan la
“promiscuidad” en los intercambios genéticos. El posible significado adaptativo de este tipo
de sistemas es el de conferir “inmunidad” frente a exogenotes (por ejemplo, fagos) que
pudieran poner en peligro la individualidad genética e incluso la superviviencia de la bacteria
en cuestión. La restricción va asociada a un sistema “paralelo” de salvaguardia del
ADN de la bacteria frente al propio sistema de restricción. Este sistema de protección del
ADN propio se denomina modificación, y mediante él, el ADN queda “marcado”
químicamente por metilación de determinadas secuencias.

Exixten dos tipos de sistemas M-R, el TIPO I y el TIPO II. El TIPO I Reconocen secuencias
relativamente grandes, que no presentan simetrías. La actividad endonucleasa (de las
subunidades R) no corta dentro de la secuencia reconocida,
sino lejos de ella, a distancias variables (del orden de unos 1000 pb., y en lugares
inespecíficos.

SISTEMAS M-R DE TIPO II Las actividades metilasa y restrictasa están en proteínas

distintas que no forman complejos multifuncionales, no requieren ATP sólo necesitan iones
Mg2+ para funcionar. La metilasa, además, usa SAM como donador de metilos. cada
miembro de la pareja de modificación y restricción reconoce la misma secuencia específica
de ADN.

El sistema de restricción-modificación EcoRI: tanto la restrictasa como la metilasa de este

sistema reconocen la misma secuencia palindrómica. En a) se muestra dónde corta la
restrictasa en cada una de las cadenas. En este caso se generan extremos protuberantes en 5’
(de cuatro bases). En b) se muestran las dos adeninas (una por cadena) que son metiladas
dentro de la secuencia reconocida por la enzima modificante.

El mecanismo general de las restrictasas de tipo II es más sencillo que las de tipo I: cada
subunidad del dímero reconoce la misma secuencia, presente en cada una de las partes
especulares del palíndromo, y realiza un corte en un lugar específico, que obviamente tiene
su correspondiente en la otra cadena de la otra mitad del palíndromo.

Existen cientos de restrictasas de tipo II (y se están descubriendo continuamente). Más de la

tercera parte de las cepas bacterianas presentan al menos un sistema M-R de tipo II. Muchas
de ellas son codificadas a partir de genes situados en plásmidos.

La importancia de las enzimas de restricción radica en su gran especificidad para reconocer

una secuencia corta de DNA bicatenario e hidrolizar un enlace fosfodiéster en cada hebra,
siempre en la misma posición. Cada enzima se caracteriza, pues, por su sitio o secuencia de
reconocimiento o de restricción, o secuencia diana. Los fragmentos de DNA resultantes son
útiles para iniciar la clonación celular o acelular,para el análisis del DNA, para elaborar
mapas físicos de restricción o para la detección de polimorfismos.

12. ¿Qué es la ADN Ligasa, ¿cuál es su función biológica natural y cuál es su función en
aplicaciones de tecnología de ADN recombinante?

La ADN ligasa es una enzima que une ADN. Si dos fragmentos de ADN tienen extremos
complementarios, la ligasa puede unirlos para formar una molécula única e intacta de ADN.
La enzima ligasa une covalentemente dos cadenas de DNA, previamente unidas entre sí a
través de los puentes de hidrógeno. Las enzimas que llevan a cabo la función contraria a las
nucleasas, o sea el formar uniones covalentes fosfodiester entre moléculas de DNA, reciben
el nombre genérico de ligasas de DNA.
 La tecnología de ADN recombinante comprende una variedad de protocolos
experimentales que permiten la transferencia de información genética (ADN) de un
organismo a otro. En este sentido, no existe un solo protocolo para tal fin, sin embargo, el
proceso de esta tecnología involucra algunos pasos claves: primero, el ADN es cortado en
puntos específicos por las enzimas endonucleasas de restricción. En segundo lugar, se
seleccionan pequeños fragmentos de ADN con capacidad para autorreplicarse, conocidos
como vectores de clonación que típicamente son plásmidos o ADN viral. Después, se unen
dos fragmentos de ADN por enlaces covalentes por medio de las enzimas ADN ligasas. Los
fragmentos de ADN de distintas fuentes unidos covalentemente se llaman ADN
recombinantes. Posteriormente, el ADN recombinante es llevado del tubo de ensaye a una
célula hospedera que provea la maquinaria molecular para la replicación. Finalmente, se
identifican y seleccionan las células hospederas que contienen ADN recombinante.
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