Vous êtes sur la page 1sur 26

TP de Microbiologie

MERLET-BILLON Maryvonne
PALAGI Alexandre
STREK Laura GB4 2011-2012

1
Abréviations
ADN : Acide DésoxyriboNucléique

ARN : Acide RiboNucléique

BET : Bromure d’Ethidium

CaCl2 : Chlorure de Calcium

DO : Densité Optique

LB : Lysogeny broth

MgCl2 : Chlorure de Magnésium

NaCl : Chlorure de Sodium

PCR : Polymerase Chain Reaction

PSM : Poste de Sécurité Microbien

U.V : Ultra Violet

2
Introduction
Au cours de ce TP nous avons eu à choisir les expériences et établir les protocoles que nous
souhaitions réaliser. Nous avons décidé de suivre le cheminement suivant :

 Etablir des courbes de croissance de Bacillus subtilis en présence et en absence de


différents sels

 Préparer une expérience de dénombrement sur Bacillus subtilis

 Analyser des prélèvements de surface que nous avons effectué sous une semelle de
chaussure et au niveau d’un interrupteur dans les toilettes des hommes

 Les prélèvements sont mis en culture de manière à obtenir des colonies isolées

 Une coloration de gram est réalisée pour chaque prélèvement

 Une PCR est réalisée pour chaque prélèvement

 Réaliser une série d’expérience pour identifier une souche inconnue :

 Culture pour isolement

 PCR

 Galerie API

3
Protocoles
I. Détermination de courbe de croissance de B. subtilis

Nous avons choisi d’étudier l’effet de trois sels sur la croissance de la souche bactérienne
Bacillus subtilis : le NaCl, le CaCl2 et le MgCl2. Suite à des recherches bibliographiques nous
avons sélectionné les concentrations suivantes :

0,5 et 1,5M pour le NaCl préparées à partir d’une solution mère à 5M

10 et 50mM pour le CaCl2 et le MgCl2 préparées à partir de solutions mères à 2M

10 tubes contenant 4mL de LB ont été préparés selon le tableau suivant :

Numéro du tube et contenant Volume de LB Volume de solution


enlevé ajouté
Tube n°1 : contrôle LB pour CaCl2 et MgCl2 à 20µL 20µL d’eau stérile
10mM
Tube n°2 : contrôle LB pour CaCl2 et MgCl2 à 100µL 100µL d’eau stérile
50mM
Tube n°3 : contrôle LB pour NaCl à 0,5M 400µL 400µL d’eau stérile
Tube n°4 : contrôle LB pour NaCl à 1,5M 1,2mL 1,2mL d’eau stérile
Tube n°5 : NaCl à 0,5M 400µL 400µL de NaCl à 5M
Tube n°6 : CaCl2 à 50mM 100µL 100µL de CaCl2 à 2M
Tube n°7 : MgCl2 à 10mM 20µL 20µL de MgCl2 à 2M
Tube n°8 : MgCl2 à 50mM 100µL 100µL de MgCl2 à 2M
Tube n°9 : CaCl2 à 10mM 20µL 20µL de CaCl2 à 2M
Tube n°10 : NaCl à 1,5M 1,2mL 1,2mL de NaCl à 5m

Nous avons ensuite mesuré la turbidité de chaque échantillon en diluant 100µL dans 900µL
de LB et ce toutes les demi-heures pendant 7h30.

Nous avons tracé le graphe représentant la DO en fonction du temps pour chaque condition
ainsi que log(DO) en fonction du temps et calculé µmax (coefficient de la tangente lors de la

4
phase exponentielle de croissance) et le temps de génération ln(µmax)/2 à partir de ce dernier
graphe.

II. Détermination du nombre de bactérie d’une solution inconnue

A partir d’une solution mère inconnue nous avons dénombré le nombre de bactérie par la
technique des dilutions en séries :

Nous avons effectué des dilutions en séries au 10ème à partir de la solution mère, jusqu’à une
dilution finale de 1/106 : 100µl de la solution mère ont été prélevés, puis dilués dans 900µl
d’eau distillée stérile. De cette dilution de 1/10, 100µl ont été de nouveau prélevés et dilués
dans 900µl d’eau distillée stérile, pour une nouvelle solution concentrée au centième de la
solution mère. Cette opération a été répétée jusqu’à obtenir une concentration finale de 1/106.

Pour chacune de ces dilutions, 100µl ont été étalés sur boite de gélose (LB agar), en condition
stérile sous PSM (poste de sécurité microbien). Une fois ensemencées, les boites ont été
placées en incubateur 24 heures. Pour faciliter les calculs, il est aisé de constater que
l’ensemencement correspond à une nouvelle dilution au 10ème. Un comptage du nombre de
colonie est effectué 24h après incubation, afin d’estimer la quantité de bactérie par ml de la
solution mère.

Le schéma suivant, que nous avons réalisé, récapitule l’expérience :

5
III. Prélèvements
Pour réaliser les prélèvements de surface nous avons utilisé des écouvillons stériles. Nous
avons effectué ces prélèvements sur des surfaces équivalentes d’environ 3 à 4 cm2.

Les écouvillons ont ensuite été utilisés pour ensemencer trois boites de pétri successivement
par la techniques des cadrans.

Les boites sont utilisées pour les expériences suivantes après 24h et 48h d’incubation à 37°C.

IV. Coloration de gram sur E. coli, B. subtilis et les prélèvements

Objectif : distinguer et classifier les bactéries à partir des propriétés de leur paroi bactérienne.
Le violet de gentiane se fixe sur des composants cytoplasmiques et après ce temps de
coloration, toutes les bactéries sont violettes. Chez les bactéries à Gram négatif, la paroi, riche
en peptidoglycanes, laisse passer l’acétone qui décolore le cytoplasme alors que, chez les
bactéries à Gram positif, la paroi constitue une barrière imperméable et le cytoplasme
demeure coloré en violet.

Etapes à suivre :

- Préparer un frottis fixé : déposer une goutte d’eau stérile sur une lame puis ajouter à
l’anse de platine stérilisée une colonie isolée. Etaler et fixer à l’alcool jusqu’à obtenir
une lame sèche.
- Recouvrir la lame de violet de gentiane et laisser agir pendant 30 secondes. Rejeter le
colorant et rincer à l’eau déminéralisée.
- Mordançage au lugol : recouvrir la lame de lugol et laisser agir pendant 30 secondes.
Rincer à l’eau déminéralisée.
- Décoloration : recouvrir la lame d’acétone et laisser agir 10 secondes. Rincer
rapidement à l’eau déminéralisée.
- Recoloration : recouvrir la lame de safranine et laisser agir pendant 30 secondes.
Rejeter le colorant et rincer légèrement à l’eau déminéralisée. Sécher délicatement la
lame avec du papier.
- Observation au microscope. Ajouter une goutte d’huile à immersion sur la lame pour
l’observation à l’objectif 100.

6
V. Galeries API

Objectif : Analyser le métabolisme d’une colonie bactérienne isolée sur boite, afin de vérifier
s’il s’agissait bien, ou non, d’une colonie d’Escherichia coli. Pour cela, nous avons utilisé une
galerie API 20E (Biomérieux) se présentant sous la forme d’une galerie de petits tubes en
plastique contenant chacun un milieu différent déshydraté. Après inoculation et incubation
durant 24H, la coloration des milieux sera révélatrice d’une modification ou non d’un
composé donné par l’organisme étudié. Les résultats obtenus sont ensuite reportés sur une
fiche d’identification, permettant d’obtenir un code propre à la souche étudiée, et
l’identification se fait par consultation du catalogue de références fourni par Biomérieux.

La galerie API 20E est une galerie dédiée à l’identification des entérobactéries, et est
relativement simple à mettre en place, mais nécessitant travailler en condition stérile
puisqu’une seule souche bactérienne ne peut être étudiée à la fois.

Par manque de réactifs révélateurs, nous n’avons pu analyser que la partie « métabolisme »
dans partie des résultats.

Protocole : Les étapes de réalisation d’une galerie API, toutes en conditions stériles via bec
benzène, sont décrites dans le manuel livré avec le kit, et sont résumés ci-dessous.

- Répendre 5ml d’eau distillée sur les alvéoles du fond de la boite d’inoculation, pour
créer une atmosphère humide.
- Prélèvement d’une colonie bactérienne jeune (18/24h) sur boite de gélose, avec une
anse de platine.
- Resuspension de la colonie prélevée dans 5ml d’eau distillée stérile.
- Inoculation de tous les puits à l’aide de la même pipette (et même cône) :
o Pour les tests CIT, VP et GEL, remplissage du tube et de la cupule.
o Pour tous les autres, remplir les tubes mais pas les cupules.
o Pour les tests ADH, LDC, ODC, H2S, URE, remplir la cupule avec de l’huile
de paraffine pour créer une anaérobiose.
- Refermer la boite et incuber à 37°C environ (±2°C) pendant 18 à 24h.

Le lendemain, la lecture de certains résultats passe par différents révélateurs à rajouter à


certains puits, dont nous ne disposions malheureusement pas. D’autres restent néanmoins
directement lisibles : GLU, MAN, INO, SOR, RHA, SAC, MEL, AMY, ARA.

7
VI. PCR sur colonie

1°) Choix des amorces :


Nous avions 6 amorces à notre disposition :

Amorce 1: CCA GTT TCC AAT GAC CCT CCC C

Amorce 2: AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG

Amorce 3: AGC CCG GGG ATT TCA CAT CTG ACT TA

Amorce 4: CTG CTC CCT CCC GTA G

Amorce 5: AAG TCG AGC GGA CAG ATG G

Amorce 6: GGA AGA AGC TTG CTT CTT TGC TGA C

Pour chaque amorce nous avons lancé un BLAST afin de déterminer quels couples nous
pouvions utiliser et pour quelles souches.

Souche Gène Amorce Amorce Température de Taille de


bactérienne Reverse Forward dénaturation l’amplicon

E. Coli 50 16S 3 78°C


544pb
E. Coli 50 16S 6 74°C

B. Subtilis JR5-5 16S 1 70°C


645pb
B. Subtilis JR5-5 16S 2 60°C

B. Subtilis JR5-5 16S 1 70°C


594pb
B. Subtilis JR5-5 16S 5 60°C

Pour mettre en évidence la présence d’E. coli via la technique de PCR sur colonie, nous avons
donc choisi les amorces 3 et 6. En effet, au sein de ce couple nous disposons d’une amorce
forward et d’une amorce reverse codant pour l’ARN 16S de la souche E. coli 50 et amplifiant
un fragment d’ADN de taille adéquate pour la réalisation d’une PCR. En suivant le même

8
raisonnement que précédemment, nous avons choisi les couples d’amorce 1 et 2 puis 1 et 5
pour détecter la présence de B. subtilis.

Remarque : l’amorce 4 ne correspondant pas à l’une des souches bactériennes que nous
étudions ici, nous ne l’avons pas utilisée.

2°) PCR
Préparation du milieu réactionnel :

Nous réalisons une PCR sur colonie, l’ADN bactérien n’a donc pas besoin d’être extrait des
bactéries car celles-ci seront lysées thermiquement lors de la réaction de PCR.

Nous avons testé plusieurs conditions :


- Tube 1 (contrôle négatif) : mix + A3/A6
- Tube 2 (contrôle négatif) : mix + A1/A2
- Tube 3 (contrôle négatif) : mix + A1/A5
- Tube 4 (contrôle positif) : mix + E. coli + A3/A6
- Tube 5 (contrôle positif) : mix + B. subtilis + A1/A2
- Tube 6 (contrôle positif) : mix + B. subtilis + A1/A5
- Tube 7 : mix + prélèvement 1 + A3/A6
- Tube 8 : mix + prélèvement 1 + A1/A2
- Tube 9 : mix + prélèvement 1 + A1/A5
- Tube 10 : mix + prélèvement 2 + A3/A6
- Tube 11 : mix + prélèvement 2 + A1/A2
- Tube 12 : mix + prélèvement 2 + A1/A5

La colonie présente dans le tube 4 appartient à la souche inconnue que nous avons identifiée
comme étant E. coli grâce à la coloration de Gram et à la galerie API. Nous l’utilisons dans un
premier temps pour confirmer par PCR qu’il s’agit bien d’une souche d’E. coli et dans un
second temps pour avoir un contrôle positif de la présence d’E. coli.

Pour chaque condition testée, le volume final de solution est de 25 µl. Nous avons préparé le
mélange suivant :

9
Réactifs du mix Concentration de Concentration de Volume à Volume à prélever
PCR la solution stock la solution finale prélever (µl) pour 13 tubes (µl)
ThermoPrime 5U/µl 0,625 U 0,125 1,625
(Taq)
Tampon de 10X 1X 2,5 32,5
réaction
dNTP Mix 20 mM 0,2 mM pour 1 13
chaque
MgCl2 25 mM 2 mM (1,5 à 4 mM) 1,5 19,5
Amorce Forward 10 µM 0,5 µM 1,25 16,25
Amorce Reverse 10 µM 0,5 µM 1,25 16,25
Eau - - 17,375 225,875

A ce mélange est ajoutée une colonie bactérienne (E. coli ou B. subtilis selon les conditions).
Remarquons que la Taq est ajoutée en dernier.

 Méthode de prélèvement de la colonie : on prélève stérilement avec un cure-dent une


colonie bactérienne et on dépose dans le tube PCR contenant le mélange réactionnel,
puis on mélange.

Cycle de la PCR :
- 94°C 2 minutes (lyse des bactéries et dénaturation initiale) x 1 cycle
- 94°C 20 sec (dénaturation)
- 60°C (B. Sub) 68°C (E. Coli) 40 secondes (hybridation) x 35 cycles
- 72°C 40 secondes (élongation)
- 72°C 5 minutes (élongation finale) x 1 cycle

Pour amplifier l’ADN bactérien d’E. coli, nous avons choisi d’effectuer l’hybridation à 68°C
car les amorces 3 et 6 ont une température de dénaturation élevée (74°C pour la 6 et 78°C
pour la 3) et la température optimale de catalyse de la Taq est de 72°C, il convient donc de
choisir une température relativement élevée.
Pour amplifier l’ADN de B. subtilis, nous avons choisi d’effectuer l’hybridation à 60°C car au
sein de chaque couple nous disposons d’une amorce ayant une température de dénaturation de
50°C et une autre ayant une température de dénaturation de 65°C.

10
Analyse par électrophorèse sur gel d’agarose :

 Préparation du gel : rajouter 20 µl de BET au fond de la cuve, puis verser l’agarose


liquide, mélanger et placer délicatement le peigne.
 Préparation des échantillons : ajouter dans chaque échantillon du tampon de charge
contenant du rouge crésol et du saccharose (volume 0,2 fois en volume final, soit 5 µL
pour 25 µl). Mélanger.
 Dépôt des échantillons :

Puits 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Echantillon Marqueur 1 4 7 10 2 5 8 11 3 6 9 12
de taille

 Migration puis révélation sous lecteur U.V.

11
Résultats et Discussion
I. Courbes de croissance :
Nous avons sélectionné les concentrations après des recherches bibliographiques (Shaheen et al. 2008,
Donnellan et al. 1964, et Adinarayana et al. 2003). Selon ces publications la tolérance de B. subtilis au
NaCl a été démontrée jusqu’à 5M. Nous nous sommes donc placés un peu en dessous à 0,5M et 1,5M
tout en sachant que notre milieu LB contenait entre 0,9M et 0,17M de NaCl.
Nous avons également appris que B. subtilis était normalement cultivé dans un milieu contenant 10mM
de CaCl2 et 0,4mM de MgCl2. Etant limité par le nombre de tubes de culture que nous pouvions utiliser
(10 au total) nous avons donc choisis les mêmes concentrations pour ces deux sels : 10mM et 50mM.
A partir des DO mesurées (Tableau 1) nous avons tracé les courbes de croissance (DO en fonction du
temps) pour chaque condition (Figure 1) puis les graphes Ln(DO) en fonction du temps (Figure 2).
Nous avons finalement calculé la pente de cette dernière droite (µmax) et le temps de génération pour
chaque condition (ln(2)/µmax) (Tableau 2).

a) Croissance de B. subtilis en présence de NaCl

En présence de 0,5M et 1,5M de NaCl la croissance de B. subtilis est altérée par rapport à la condition
contrôle. (Figure 1 A et B). Ceci se traduit par un temps de génération nettement inférieur, (113 minutes
pour 0,5M) en particulier à 1,5M où la croissance est quasiment nulle (866 minutes) (Tableau 2).
Il faut également noter ici que le temps de génération en condition contrôle n’est pas représentatif de celui
observé en général pour B. subtilis dans des conditions normales de culture qui est d’environ 26 minutes.
Ceci peut s’expliquer par la mise au point de l’expérience : nous avons choisi des concentrations élevées
de NaCl et nous disposions d’une solution mère liquide à 5M. Le volume à ajouter dans le milieu de
culture était donc important et nous avons beaucoup dilué nos milieux de culture dans nos conditions
contrôles. Il est fort probable que les bactéries n’aient pas eu assez de nutriments pour croître de manière
optimale.
Pour éviter ce biais il faudrait utiliser du NaCl en poudre et le dissoudre directement dans le milieu.

b) Croissance de B. subtilis en présence de MgCl2

En présence de 10mM et 50mM de MgCl2 la croissance de B. subtilis est légèrement diminuée (Figure 1
C et Figure 2 C et D). Son temps de génération est de 134% en présence de 10mM de MgCl2 et de 192%
en présence de 50mM de MgCl2 (Tableau 2).

12
c) Croissance de B. subtilis en présence de CaCl2

Lors de cette expérience nous avons observé l’apparition d’un précipité dans le milieu. Ce phénomène est
à prendre en compte car il augmente la turbidité du milieu. Pour contrebalancer ce biais nous aurions pu
ajouter deux conditions sans bactérie avec les mêmes concentrations de CaCl2.
En présence de 10mM de CaCl2 la croissance de B. subtilis est diminuée (Figure 1 C et 2 C) ce qui se
traduit par un temps de génération de 205% (Tableau2).
B. subtilis est normalement cultivée en présence de CaCl2, nous pouvons supposer que la concentration
dans notre milieu n’était pas suffisante pour permettre une croissance optimale et même diminuer cette
croissance. En effet nous pouvons observer qu’à 50mM de CaCl2 (Figure 1 D et 2 D) la croissance de B.
subtilis est améliorée par rapport au contrôle : le temps de génération est de 71% (Tableau 2).
Bien que nous ayons vu dans les publications que B. subtilis était cultivée en présence de CaCl2 nous
avons utilisé un milieu de culture générique, sur lequel un grand nombre de bactérie sont capables de
croître. Ce milieu n’était pas optimal pour notre souche.
Pour avoir de meilleurs résultats concernant l’effet de ces sels sur B. subtilis il aurait fallu cultiver notre
souche dans un milieu plus spécifique.

13
Condition Equation de la droite Coefficient de µmax Temps de
corrélation génération
-1
Contrôle 0,5M y = 0,0084x - 4,1878 R² = 0,9606 0,0084 min 82,5 minutes
-1
NaCl 0,5M y = 0,0061x - 4,4599 R² = 0,9191 0,0061 min 113 minutes
-1
Contrôle 1,5M y = 0,0077x - 4,2665 R² = 0,8778 0,0077 min 90 minutes
-1
NaCl 1,5M y = 0,0008x - 4,3011 R² = 0,0975 0,0008 min 866 minutes
-1
Contrôle 10mM y = 0,0211x - 6,1744 R² = 0,9887 0,0211 min 32,8 minutes
-1
CaCl2 10mM y = 0,0103x - 5,1483 R² = 0,9762 0,0103 min 67,3 minutes
-1
MgCl2 10mM y = 0,0157x - 5,6336 R² = 0,9984 0,0157 min 44,15 minutes
-1
Contrôle 50mM y = 0,0215x - 6,2925 R² = 0,9336 0,0215 min 32 minutes
-1
CaCl2 50mM y = 0,0301x - 6,3486 R² = 0,9848 0,0301 min 23 minutes
-1
MgCl2 50mM y = 0,0113x - 5,1052 R² = 0,9778 0,0113 min 61,34 minutes
Tableau 2 : Récapitulatif des données de la figure X2 et calcul du temps de génération de B. subtilis.

II. Prélèvements
Nous avons effectué deux prélèvements : l’un sous une semelle de chaussure et l’autre sur
l’interrupteur des toilettes pour homme, puis nous avons cherché à identifier les bactéries
présentes dans ces prélèvements. Pour cela, nous avons tout d’abord réalisé une identification

14
bactérienne via une coloration de Gram, puis nous avons poursuivi l’identification à l’aide
d’une PCR sur colonie.
a) Identification bactérienne du prélèvement effectué sous une semelle de chaussure :

La coloration de Gram d’une des colonies bactériennes obtenues après encensement sur boite
de pétri et incubation du prélèvement, a révélé la présence de bacille Gram- (couleur rose) en
forme de petits bâtonnets s’agrégeant en chaîne (figure 3).

Figure 3 : Observation au microscope (grossissement x100) d’une coloration de Gram sur


une colonie obtenue à partir du prélèvement effectué sous une semelle de chaussure.

Ces bactéries étant des bacilles Gram-, elles peuvent appartenir à plusieurs espèces
différentes. Sachant que pour la PCR nous avions à notre disposition des amorces permettant
d’identifier E. coli ou B. subtilis, cette technique nous aurait permis seulement de dire s’il
s’agissait ou non d’E. coli.
Nous avons donc réalisé une PCR sur colonie à partir des amorces 3 et 6 codant pour l’ARN
16S de la souche E. coli 50. Malheureusement, nous n’avons obtenu aucun résultat. En effet,
nous n’avons pu observer de fluorescence sur le gel, pas même pour le marqueur de taille.
Nous pensons donc que le BET utilisé a été excessivement exposé à la lumière avant que nous
l’utilisions, perdant ainsi son efficacité.

b) Identification bactérienne du prélèvement effectué sur l’interrupteur des toilettes pour


homme :

Dans le cas de ce prélèvement, la coloration de Gram a révélé la présence de coques Gram+ en


amas (Figure 4), pouvant correspondre à des staphylocoques ou des microcoques. Pour
poursuivre l’identification et préciser le genre, il aurait fallu réaliser une galerie API Staph.
En effet, suite à des recherches effectuées sur internet, nous avons constaté une certaine
similarité entre les staphylocoques et nos bactéries.

15
Figure 4 : Observation au microscope (grossissement x100) d’une coloration de Gram sur une colonie obtenue
à partir du prélèvement effectué sur l’interrupteur des toilettes pour homme.

III. Identification d’une souche inconnue


Pour préparer ce TP nous avions 3 solutions à notre disposition :
 Une solution de B. subtilis
 Une solution d’E. coli
 Un mix des deux souches
Ces solutions étaient numérotées et nous ne savions pas quelle solution contenait quelle
souche. Nous avons donc décidé de réaliser un protocole d’identification et nous avons choisi
la solution n°1. Une partie de cette solution a été mise en culture de manière à obtenir dès 24h
de croissance des colonies isolées.

a) Coloration de Gram

Après coloration de Gram nous avons observé la lame au microscope. Nous avons pu
observer des bactéries Gram-, roses (donc avec une paroi plutôt pauvre en peptidoglycanes) et
en forme de bâtonnets (figure 5). Au vue des solutions dont nous disposions nous avons
supposé qu’il s’agissait d’E. coli. Afin de confirmer cette hypothèse nous avons réalisé une
galerie API.

Figure 5 : Observation au microscope (grossissement x100) d’une coloration de Gram sur des
colonies de la solution 1.

16
b) Galeries API

La galerie API 20E a été réalisée selon les recommandations du fournisseur et laissée en
incubateur à 37°C environ 20h. L’identification de notre souche n’a été que partielle car nous
n’avions pas les réactifs nécessaires à l’interprétation de certaines caractéristiques (figure 6
haut et bas, partie de droite). Cependant nous avons pu analyser la partie métabolique de la
galerie API. En comparant nos résultats à ceux prédits par le fournisseur nous pouvons
fortement penser que la souche présente dans la solution 1 est bien E. coli. En effet, bien que
le tube ONPG se révèle négatif dans notre galerie, notre souche est capable de
fermentation/oxydation : les tests concernant le glucose, le mannitol, le sorbitol, le rhamnose,
le melibiose et l’arabinose sont positifs.

Figure 6 : Interprétation de la galerie API 20E, réalisée à partir de la solution 1. Tableau


d’identification du fournisseur (haut), galerie API (bas).

IV. Détermination du nombre de bactérie dans une solution de B.


subtilis
Comme décrit dans le protocole nous avons mis en culture différentes dilutions de B. subtilis.
Après 24h de culture nous avons observé les boîtes de pétri et sélectionné deux d’entre
elles afin de compter les colonies. La première boîte, correspondant à une dilution au 1/106
(figure 7 à droite) comportait 168 colonies. La seconde boîte, correspondant à une dilution au
1/107 (figure 7 à gauche) comportait 10 colonies. Pour ces dilutions ceci nous a ramené à 168
et 10 bactéries pour 100µL. Soit, 1680 et 100 bactéries par mL de chaque dilution et au final
entre 1,68.107 et 107 bactéries dans la solution mère. Nous avions donc en moyenne 1,3.107
bactéries dans notre solution mère de B. subtilis

17
Figure 7 : observation de colonies de B. subtilis après 24h de culture.

18
Conclusion
Lors de ce TP nous avons voulu établir des protocoles reflétant une démarche scientifique, par
exemple avec la série d’expériences que nous avons réalisées pour les prélèvements.

Dans nos protocoles il y a cependant des points que nous pourrions améliorer :

 Utiliser des poudres de sels que nous diluerions directement dans le milieu de culture
afin d’éviter la dilution des nutriments de notre milieu.
 Envisager un contrôle spécifique pour l’ajout de CaCl2 dans le milieu puisque ce sel
augmente la turbidité.
 Utiliser un milieu plus spécifique de notre culture bactérienne.
 Réaliser une galerie API Staph sur l’un des prélèvements pour avoir une idée plus
précise du genre de la bactérie.
 Réaliser des PCR pour confirmer certains résultats
 Pouvoir utiliser tous les réactifs nécessaires pour la galerie API

19
Bibliographie
Influence of culture conditions on production and activity of proteases frome Bacillus subtilis
BS1. Mussarat Shaheen, Aamer Ali Shah, Abdul Hameed, Fariha Hasan. Pak. J. Bot. 2008

Chemically defined synthetic media for sporulation and for germination and growth of
Bacillus subtilis. Hillel S. Levinson J. Edward Donnellan Jr., Ella H. Nags. Journal of
bacteriology 1964

Purification and partial characterization of thermostable serine alkaline protease form a newly
islated Bacillus subtilis PE-11. Kunamneni Adinarayana, Poluri Ellaiah, and Davuluri Siva
Prasad. AAPS PharmSciTech 2003.

20
Fiche financière
Consommables :
Matériels Marque, Quantité Quantité Prix total Amortissement
consommables fournisseur totale utilisée

Boîtes de pétri VWR 100 25 89,70€ 22,425€

Milieu LB Grosseron 1L 200 ml 92,18€ 18,436€

Gélose 300 ml

Cônes 1 ml PhysioCare 10 x 1000 200 120€ 2,4€


concept

Cônes 200 µl PhysioCare 10 x 1000 400 104€ 0,416€


concept

Cônes 20 µl PhysioCare 10x384 30 540€ 4,21€


concept

Solution NaCl VWR 1L 4mL 17,748€ 0,07€


5M

Solution VWR 500mL 200µL 19,38€ 0,007€


MgCl2 2M

Solution VWR 500mL 200µL 25,53€ 0,01€


CaCl2 2M

Ethanol 70% Sigma Aldrich 1L 10 ml 27,10€ 0,271€

Kit galerie bioMérieux 25 1 204,19€ 8,17€


API E20 (ref 20 100)

Kit PCR Quiagen 400 24 116€ 6,96€


réactions

Tubes falcon BD 500 3 139€ 0,834€


25 ml Biosciences

Eppendorfs Jeulin 100 15 6,80€ 1,02€


1,5 ml

Ecouvillon Grosseron 300 2 364,5€ 2,43€


stérile

21
Huile à Socimed 100mL 100µL 30,63€ 0,04€
immersion
Gurr

Paraffine Lelaborantin.fr 75m 1m 20€ 0,2€

Total 67,899€

Matériel Commun :
Matériel
Marque/revendeur Prix Durée Durée Amortissement
de vie d’utilisation
Techne TC-4 000
(PCR)
Techne chez 4427€ 5 ans 3h 0,30€
Grosseron
Vortex
Grant-bio pv1 167€ 5 ans 1h 0,003€
Bec Bunsen
Sordalab 257€ 10 ans 1h 0,003€
Incubateur
WiseCube 2962€ 10 ans 48h 1,62€
Hotte à flux
laminaire
Faster 5644€ 15 ans 72h 3,1€
Spectrophotomètre
WPA
Biowave DNA 1961€ 10 ans 12h 0,54€
Autoclave 23L
Quirumed 1424€ 10 ans 72h 1,17€
Microscope cyscope
HP
Partec 990€ 10 ans 1h 0,01€
Pippette 100µL-1mL

20-200µL/2µL-20µL Eppendorf 558€ 5 ans 72h 0,91€

Pipette 0,1µL-2,5µL
Eppendorf 267€ 5 ans 24h 0,15€
Lecteur UV
Major science 4706€ 5 ans 24h 2,58€

22
UVDI
Anse de platine Labomoderne (ref 93,89€ 5 ans 72h 0,15€
AP40051)

Total 10,536

Entre le matériel utilisé et le matériel commun notre TP a couté approximativement : 78,5€

23
Fiches de sécurité
Phrases de risques des produits utilisés pour les cultures et la réalisation des
courbes de croissance :
NaCl :

R36 Irritant pour les yeux


R37 Irritant pour les voies respiratoires
R38 Irritant pour la peau
S26 En cas de contact avec les yeux, laver immédiatement et abondamment avec de
l’eau, consulter un spécialiste
S36 Porter un vêtement de protection approprié

CaCl :

R36 Irritant pour les yeux


S22 Ne pas respirer les poussières
S24 Eviter le contact avec la peau
H319 Provoque une sévère irritation des yeux
P280 Porter des gants de protection/des vêtements de protection/un équipement de
protection des yeux/du visage

MgCl2 :

Si contact avec la peau laver à grandes eaux. Retirer les vêtements contaminés
Si contact avec les yeux : laver à grandes eaux en gardant les paupières soulevées
En cas d’ingestion si malaise recourir à l’assistance d’un médecin

Milieu LB :

Pas de dangers dans les conditions normales d’utilisation

Ethanol à 70%:

R11 inflammable
Peut provoquer une irritation des yeux

24
Phrases de risques des réactifs utilisés pour la coloration de Gram :
Acétone :

R11 Facilement inflammable


R36 Irritant pour les yeux
R6 L'exposition répétée peut provoquer dessèchement ou gerçures de la peau
R67 L'inhalation de vapeurs peut provoquer somnolence et vertiges

Violet de gentiane :

R22 Nocif en cas d'ingestion


R40 Effet cancérogène suspecté – preuves insuffisantes
R41 Risque de lésions oculaires graves
S26 En cas de contact avec les yeux, laver immédiatement et abondamment avec de l'eau
et consulter un spécialiste

Safranine :

R36 Irritant pour les yeux


R38 Irritant pour la peau

Lugol :

Pas de dangers dans les conditions normales d’utilisation

Phrases de risques des réactifs utilisés pour la PCR :


Bromure d’éthidium :

T+ Très toxique
R 22 Nocif en cas d’ingestion
R 26 Très toxique par inhalation
R 68 Possibilités d’effets irréversibles
S 26 En cas de contact avec les yeux, laver immédiatement et abondamment avec de
l’eau, consulter un spécialiste
S37 En cas de contact avec les yeux, laver immédiatement et abondamment avec de
l’eau, consulter un spécialiste

Bleu de bromophénol :

R36 Irritant pour les yeux


R38 Irritant pour la peau

25
Agarose :

R36 Irritant pour les yeux


R38 Irritant pour la peau

EDTA :

R36 Irritant pour les yeux


S24 Eviter le contact avec la peau
S26 En cas de contact avec les yeux, laver immédiatement

Acide borique :

R 60 Peut altérer la fertilité


R61 Risque pendant la grossesse d'effets néfastes pour l'enfant
S53 Éviter l'exposition - se procurer des instructions spéciales avant l'utilisation
S45 En cas d'accident ou de malaise, consulter immédiatement un médecin

Tris (Hydroxyméthyle) Aminométhane :

R36 Irritant pour les yeux


R37 les voies respiratoires
R38 Irritant pour la peau
S26 En cas de contact avec les yeux, laver immédiatement consulter un ophtalmologiste
S36 Porter un vêtement de protection approprié

26