Escherichia coli muestra en superficie para la selección de nanocuerpos.

Agosto 2017 Biotecnología Microbiana 10 (Pt 12)

Valencio Salema and Luis Angel Fern andez* Department of Microbial Biotechnology, Centro
Nacional de Biotecnologıa (CNB), Consejo Superior de Investigaciones Cientıficas (CSIC), Madrid,
Spain

Los nanocuerpos (Nbs) son los fragmentos de anticuerpos funcionales más pequeños conocidos en
la naturaleza y tienen múltiples aplicaciones en biomedicina o monitoreo ambiental. Las Nbs se
derivan del segmento variable de los anticuerpos de solo cadena pesada de camélidos, conocidos
como VHH. Para la selección, las bibliotecas de los segmentos del gen VHH de animales no
tratados, inmunizados o de origen sintético se han clonado tradicionalmente en sistemas de
presentación de fagos o levaduras de fagos de E. coli, y los clones que se unen al antígeno diana
recuperado, generalmente de superficies de plástico con el antígeno inmovilizado (fagos).
visualización) o mediante la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS; visualización
de levadura). Esta revisión describe brevemente estos enfoques convencionales y se centra en las
distintas propiedades de un sistema de visualización de E. coli desarrollado en nuestro laboratorio,
que combina los beneficios de la visualización de fagos y los sistemas de visualización de levadura.
Demostramos que la visualización de E. coli utilizando un dominio N-terminal de intimin es una
plataforma efectiva para la visualización de la superficie de las bibliotecas VHH que permite la
selección de Nbs de alta afinidad mediante la clasificación de células magnéticas y la selección
directa en células de mamíferos vivas que muestran el antígeno objetivo en su superficie. El
análisis de citometría de flujo de bacterias de E. coli que muestran las Nbs en su superficie permite
el monitoreo del proceso de selección, facilita el rastreo, la caracterización de los clones de unión
a antígeno, la especificidad, la competencia de ligandos y la estimación de la constante de
disociación de equilibrio (KD). La visualización de coli que utiliza un dominio N-terminal de intimin
es una plataforma efectiva para la visualización de la superficie de las bibliotecas VHH que permite
la selección de Nbs de alta afinidad mediante la clasificación de células magnéticas y la selección
directa en células de mamíferos vivos que muestran el antígeno objetivo en su superficie. El
análisis de citometría de flujo de bacterias de E. coli que muestran las Nbs en su superficie permite
el monitoreo del proceso de selección, facilita el rastreo, la caracterización de los clones de unión
a antígeno, la especificidad, la competencia de ligandos y la estimación de la constante de
disociación de equilibrio (KD). La visualización de coli que utiliza un dominio N-terminal de intimin
es una plataforma efectiva para la visualización de la superficie de las bibliotecas VHH que permite
la selección de Nbs de alta afinidad mediante la clasificación de células magnéticas y la selección
directa en células de mamíferos vivos que muestran el antígeno objetivo en su superficie. El
análisis de citometría de flujo de bacterias de E. coli que muestran las Nbs en su superficie permite
el monitoreo del proceso de selección, facilita el rastreo, la caracterización de los clones de unión
a antígeno, la especificidad, la competencia de ligandos y la estimación de la constante de
disociación de equilibrio (KD).

Fig. 1. Estructura de los anticuerpos y nanobodies de solo cadena pesada de

camélido. (A) Representación esquemática de un Ab solo de cadena pesada con
la estructura del dominio VHH (Nb) resaltada. Las regiones determinantes de la
complementariedad (CDR) están marcadas en diferentes colores: CDR1 en
amarillo, CDR2 en verde, CDR3 en azul y las regiones marco (FR) se indican en
rojo. (B) El diagrama estructural lineal de un dominio VHH, que indica CDR,
enlaces disulfuro (SS) en la molécula y posiciones de la región marco 2 de VHH
que contienen más aminoácidos hidrofílicos (por ejemplo, Y37, E44, R45, G47) en
comparación con los convencionales VHs (por ejemplo, V37, G44, L45,
W47). También se ilustran los SS canónicos conservados en los dominios de Ig y
los SS no conservados adicionales encontrados en muchos Nbs.
 Fig. 2. Visualización de
fagos y visualización de
levaduras de nanocuerpos.
(A) Expresión de Nbs
fusionada a la proteína de
recubrimiento menor III
(pIII) de fagos filamentosos
en el periplasma de E. coli.
La proteína de fusión se
exporta al periplasma con
un péptido señal N-terminal
(por ejemplo, PelB) a
través del complejo Sec. El
dominio Nb está expuesto
al periplasma y está atado
a la membrana interna (IM)
de E. coli por pIII. Una
etiqueta de epítopo (por ejemplo, HA, myc) generalmente se incluye entre los
restos Nb y pIII. Las chaperonas periplásmicas (por ejemplo, SurA, Skp, FkpA,
DegP) y los catalizadores de enlace disulfuro (por ejemplo, DsbA) ayudan al
plegamiento del dominio Nb en el periplasma. También se indican la membrana
interna de E. coli (IM), el peptidoglicano (PG) y la membrana externa (OM). (B)
Esquema de una partícula de fago-Nb filamentoso ensamblada tras la infección de
células de E. coli que expresan fusiones Nb-pIII con un fago auxiliar. La fusión Nb-
pIII se muestra en la punta de la cápside del fago filamentoso (generalmente una
copia por fago), que contiene el ADN del fagémido con el gen VHH codificador. (C)
Esquema del despliegue de Nbs en una célula de levadura fusionada con el
extremo C del receptor de aglutinina de levadura (Aga2) presente en la superficie
de la célula de levadura (agrandada). La fusión Aga2-Nb sigue la ruta secretora de
las células de levadura desde el retículo endoplásmico (ER) hasta la membrana
plasmática. Las etiquetas de epítopo que flanquean el dominio Nb también están
indicadas (por ejemplo, HA, myc). La fusión Aga2-Nb sigue la ruta secretora de las
células de levadura desde el retículo endoplásmico (ER) hasta la membrana
plasmática. Las etiquetas de epítopo que flanquean el dominio Nb también están
indicadas (por ejemplo, HA, myc). La fusión Aga2-Nb sigue la ruta secretora de las
células de levadura desde el retículo endoplásmico (ER) hasta la membrana
plasmática. Las etiquetas de epítopo que flanquean el dominio Nb también están
indicadas (por ejemplo, HA, myc).
 Fig. 3. Estructura de las fusiones
Neae-VHH y su mecanismo de
secreción en la exhibición de
nanobodies de E. coli. (A)
Representación lineal del
polipéptido codificado por
fusiones Neae-VHH para la
presentación de E. coli. El
fragmento intimin Neae (residuos
1–654) comprende el péptido
señal N-terminal (sp), el dominio
LysM para la unión a PG, el barril
b para el anclaje de OM y el
dominio similar a D0 Ig expuesto.
El VHH codifica el Nb. La fusión
Neae-VHH también contiene los
epítopos E-tag y myctag que
flanquean el VHH. (B) El
polipéptido de fusión expresado
en el citoplasma bacteriano se
transloca a través del IM a través
del complejo Sec. En el
periplasma, los chaperones
ayudan al plegamiento de la Nb y
al transporte del dominio
intiminar de barril b al complejo
BAM en la OM. El complejo BAM
es responsable del plegamiento y
la inserción del barril b de Intimin
en el OM y participa en la translocación de los dominios D0 y Nb a la superficie bacteriana. Los
epítopos E-y myc-tags se utilizan para la inmunodetección de Nb mostrada en la superficie de E.
coli por citometría de flujo.
Fig. 4. Generación de bibliotecas inmunes de visualización de E. coli y su selección por clasificación
de células magnéticas (MACS) y en células de mamíferos (CellS). (A) Esquema de la generación de
una biblioteca inmune de visualización de E. coli de Nbs. Los animales (por ejemplo, dromedarios o
llamas) se inmunizan con antígeno purificado o células que expresan el antígeno diana. Después
de la inmunización, los segmentos del gen VHH se amplifican a partir de linfocitos de sangre
periférica mediante RT-PCR, se clonan en el vector plásmido pNeae2 y se inducen en E. coli para la
visualización de la superficie. (B) Selección de una biblioteca de visualización de E. coli utilizando
MACS. Las bacterias Escherichia coli se incuban con el antígeno biotinilado y las bolas magnéticas
de antibiotina. Las bacterias con antígeno unido se capturan en una columna de hierro contenida
en un imán. La elución de las bacterias unidas se lleva a cabo con medios LB nuevos al retirar la
columna del imán y cultivarla mediante placas. (C) Selección de una biblioteca de visualización de
E. coli en células de mamíferos (CellS). Las bacterias Escherichia coli se incuban inicialmente con
células de control que carecen de expresión del antígeno diana (selección negativa). Las bacterias
que no se unen a las células de control se incuban con células que expresan el antígeno objetivo
en su superficie para una selección positiva. Las bacterias unidas a las células positivas para el
antígeno después del lavado (por ejemplo, PBS) se recuperan mediante la lisis de las células de los
mamíferos y se cultivan mediante placas. Las bacterias que no se unen a las células de control se
incuban con células que expresan el antígeno objetivo en su superficie para una selección positiva.
Las bacterias unidas a las células positivas para el antígeno después del lavado (por ejemplo, PBS)
se recuperan mediante la lisis de las células de los mamíferos y se cultivan mediante placas. Las
bacterias que no se unen a las células de control se incuban con células que expresan el antígeno
objetivo en su superficie para una selección positiva. Las bacterias unidas a las células positivas
para el antígeno después del lavado (por ejemplo, PBS) se recuperan mediante la lisis de las
células de los mamíferos y se cultivan mediante placas.