POLIMORFISME GENETIK DARI Anopheles barbirostris

KAITANNYA DENGAN PREVALENSI MALARIA DI KECAMATAN CINEAM,

KABUPATEN TASIKMALAYA

Arnrul ~ u n i f ' M.Sudomol,

, dan A ~ U S , D . P . ~
~oelaksono,~~,~aelita,~.~,

POLIMORFISME GENETIK OF Anopheles barbirostris WITH PREVALENCE OF

MALARIA IN CINEAM REGENCY, T A S I m A L A YA DISTRIC

Abstrac. The level of genetic polymorphism found in &.barbirostris was obtained by

employing the Random Ampli$ed Polymorphic DNA (RQPD) method and then
analyzing the patterns of DNA bands formed, some of which would be polymorphic and
other monomorphic. Polymorphic DNA band frequency was calculated to obtain the
persentages polymorphic of DNA bands occurring in b.barbirostris from all 10
villages. The result of DNA band pattern analysis managed to be amplificated from
-
An. barbirostris was found to contain a different number of polymorphism in each
village. The highest level of polymorphism was obtained in the sample from Cikondang
village (88.9%),Cijulang (81.2%) and Rajadatu (77.8%) which are both HCI areas
While in MCI areas, the level ofpolymorphism was lower for Ciampanan (63.6%) and
Nagara Tengah (69.2%) Then, for LCI villages, the result for Pasirmukti (50%).
Cisarua was 50%, Cirteanl was 44.5%. and Ancol was 50%. The regression analysis
showed the relation of genetic variation in &. barbirostris in each village with the
prevalence showing positive correlation Y = 0.692 X + 3.2, R = 0.58, p >0.05, in
which the level of polymorphism affected the high level of malaria prevalence, either
from SPR.

Key word: Polimorfisme genetik, RAPD,b.barbirostris, PCR, Prevalertsi malaria.

PENDAHULUAN hitung kelangsungan hidup harian vektor

Variasi/polimorfisme/keanekaragaman
genetik pada spesies vektor mempunyai
pengaruh terhadap kapasitas vektorial
(angka yang menunjukkan terjadinya trans-
misi) dan sifat kemampuan vektor dalam
menularkan penyakit ('I.Melalui per-
hitungan nilai kapasitas vektorial ini, dapat
diprediksi kapan terjadinya penularan, di
samping ber una untuk memonitor potensi
penularan (45. Nilai kapasitas vektorial
(VC) diperoleh dari beberapa parameter
tertentu di antaranya sebagai berikut: (1)
mengukur kepadatan vektor (m), (2) meng-
(p), (3) kekerapan menggigit orang (a), (4)
lamanya sporogony (n), dan (5) proporsi
Ano heles spp dengan sporozoit infektif
(b)&. Risiko penularan malaria dihitung
sebagai nilai dari kapasitas vektorial (VC)
yang secara teoritis apabila VC=O,Ol maka
baru dapat terjadi penularan secara alami
(4). Kepadatan populasi nyamuk vektor
yang tinggi disebabkan karena memiliki
sifat keanekaragaman yang lebih berva-
riasi, sehingga nyamuk akan mudah
lulus hidup dan berkembang biak dari
generasi ke generasi. Sedangkan nya-
muk yang tingkat polimorfismenya ku-

'puslitbang Ekologi Kesehatan, Badan Litbangkes

2
FMIPA, lnstitut Teknologi Bandung
Bul. Penel. Kesehatan, Vol. 32, No. 1,2004: 1-16
rang bervariasi cenderung tidak mudah
untuk lulus hidup (',@. Hal ini disebab-
kan karena adanya korelasi antara ke-
anekaragaman dengan adaptasi untuk
lulus hidup ('). Kemungkinan lain
dengan banyaknya variasi genetik pada
vektor akan menyebabkan vektor tahan
terhadap tekanan lingkungan. Dengan
demikian daya kemampuan lulus hidup
makin tinggi yang pada akhirnya po-
pulasi vektor menjadi ting i dan pre-
valensi malaria meningkat t . Keaneka-R
ragaman di antara individu dapat terjadi
karena adanya perbedaan variasi ge-
netik, keanekaragaman genetik ini se-
lalu ditemukan pada semua mahluk
hidup . '*'
Menurut Tabachnik dan William ( I )
terdapat korelasi yang positif antara tingkat
polimorfisme genetik pada populasi Ano-
pheles dengan prevalensi malaria. Hal ini
menunjukkan adanya hubungan kepadatan
populasi vektor dapat diprediksi melalui
pengamatan polimorfisme/variasi genetik
dari desa-desa yang mempunyai tingkat
prevalensi yang berbeda. Tingkat poli-
morfisme genetik dapat dianalisis me-
lalui pola larik DNA dengan meng-
gunakan metode Randon1 Amplified
Polyntorphic DNA (RAPD), sehingga
akan diperoleh larik-larik DNA yang
bersifat polimorfisme dan monomor-
fisme(9J" 1)
Secara umum peningkatan popu-
lasi nyamuk dapat terjadi karena nya-
muk mempunyai daya kelangsungan
hidup yang lebih tinggi. Populasi Ano-
pheles yang tinggi dapat juga terjadi
karena memiliki keanekaragaman indi-
vidu. Metode RAPD ini untuk meng-
identifikasi polimorfisme DNA secara
cepat, dan dapat dengan mudah meng-
hasilkan polimorfisme yang sangat
tinggi dari DNA yang diamplifikasinya
(I2). Dalam metode ini oligonukleotida
yang pendek bertindak sebagai primer
melalui pengikatan daerah yang kom-
plemen dan memulai proses amplifika-
si daerah yang spesifik dari genom
dengan menggunakan reaksi Pol me-
rase Chain Reaction (PCR) h . 1 ,
Semakin banyak variasi daerah genom
yang diamplifikasi oleh primer semakin
tinggi pula tingkat polimorfik nyamuk
vektor. Dengan adanya perbedaan dan
persamaan dari pola larik DNA Ano-
pheles spp yang diamplifikasi oleh se-
tiap primer dimungkinkan untuk dapat
menghitung persentase pola larik DNA
yang bersifat polimorfisme dan mono-
morfisme (15,16,17) , sehingga dapat dihi-
tung persentase polimorfisme genetik
dari setiap Anopheles spp. Tingkat poli-
morfisme genetik pada populasi nya-
muk dapat diketahui dengan menggu-
nakan analisa DNA (I8.l9). Dengan mem-
bandingkan tingkat polimorfisme DNA
nyamuk vektor maka dapat diketahui
keanekaragaman genetik dari nyamuk
vektor ( ' I ) . Metode RAPD yang meng-
hasilkan polimorfisme DNA dapat
mengidentifikasi keanekaragaman pada
individu secara langsung pada tingkat
DNA (I9). Keanekaragaman atau variasi
genetik juga disebut polimorfisme apa-
bila primer mengamplifikasi daerah ge-
nom yang bervariasi, sebaliknya mono-
morfisme jika primer mengamplifikasi
daerah genom tidak bervariasi.
Tingkat polimorfisme di antara in-
dividu dapat terwujud melalui beberapa
proses yaitu: (1) perubahan nukleotida
yang mencegah amplifikasi, (2) bebe-
rapa nukleotida hilang (dilesi) pada
-tempat pelekatan primer, (3) penam-
bahan nukleotida (insersi) mengakibat-
kan daerah pelekatan primer terlalu
jauh untuk mendukung terjadinya am-
plifikasi, (4) insersi maupun dilesi me-
rubah ukuran produk amplifikasi. Tipe
polimorfisme ini membuat penanda

RAPD cocok diterapkan dalam pene-
litian keanekaragaman genetik (I7). Ke-
anekaragaman individu tersebut dapat
dideteksi dengan berbagai metode di
antaranya SSLPs (Simple Sequence
Length Polymorphisms), RFLP (Re-
striction Fragment Length Polymor-
phism) dan RAPD (9'"'20).
BAHAN DAN METODA
Prevalensi malaria
Untuk memperoleh nilai preva-
lensi malaria maka dilakukan pengam-
bilan darah secara deteksi kasus pasif
(Passive Case Detection, PCD) deteksi
kasus aktif (Active Case Detection) dan
cara MBS(Mass Blood Survey) dari 10
desa di Kecamatan Cineam Tasikma-
laya. Pengambilan sampel darah pada
manusia dengan tujuan untuk meng-
evaluasi persentase kehadiran Plasmo-
dium yang menginfeksi manusia. Preva-
lensi malaria adalah persentase pendu-
duk yang terinfeksi Plasmodium spp
baik yang baru maupun yang lama.
Menentukan tingkat polimorfisme
genetik
Isolasi DNA Anopheles
Untuk mempelajari hubungan poli-
morfisme genetik Anopheles spp kaitan-
nya dengan tingkat prevalensi malaria
digunakan metode yang dilakukan oleh
Grosberg et a1 (I0);Hill dan Crapton (''I
dan Wilkerson et a1 (I9). Perhitungan
untuk memperoleh persentase tingkat
polimorfik dan monomorfik dari Ano-
pheles spp terlebih dahulu melakukan
isolasi DNA genom. Dalam penelitian
ini, DNA genom diisolasi dari bagian
kaki Anopheles spp yang ditangkap dari
sepuluh desa dengan tingkat prevalensi
Polimorfisme Genetika dari.. ..........(Munif e t . 4
yang berbeda di Kecamatan Cineam,
Tasikmalaya.
Proses isolasi DNA dilakukan
dengan metode 7ang digunakan oleh
Beebe dan Saul ( 3). Williams et al. (21)
Wilkerson, et a1 (i9), Gracia et a1 (I6)
yang dimodifikasi dengan metode yang
dipakai di NAMRU-2 yaitu penam-
bahan proteinase K ke dalam larutan
buffer lisis. Sodium asetat diganti
dengan amonium asetat. Volume laru-
tan buffer lisis dikurangi dari 500 p1
menjadi 100 p1 sesuai dengan larutan
buffer ekstraksi DNA nyamuk dengan
metode (SDS). Sebanyak 100 pl larutan
buffer lisis dipanaskan dalam waterbath
60' C selama 10 menit. Buffer lisis ini
terdiri dari 0,2 M NaC1, 10 mM Tris
HCl (pH 8,25), 1 mM EDTA dan 0,5%
sodium dodecyl sulfate. Pasangan kaki
Anopheles dimasukkan ke dalam tabung
volume 1,s ml yang telah terisi 100 pl
buffer lisis. Kemudian bagian kaki nya-
muk dan buffer lisis digerus dengan
hand grinder agar kaki nyamuk hancur
merata. Sebanyak 1 p1 2-merkaptoeta-
no1 ditambahkan ke dalamnya.
Pada tahap ini EDTA pada larutan
buffer lisis berguna untuk mengikat
ca2+ dan M ~ ~ sehingga
+ , dapat ber-
tindak sebagai inhibitor nuklease. Sam-
pel divortex hingga menjadi homogen
dan kemudian ditambahkan 5 p1 pro-
teinase K (20 mgll ml air deion). Pro-
teinase K berguna untuk melisis protein
dan melepaskan asam nukleat ke dalam
larutan lisis sel. Campuran larutan di-
inkubasi pada suhu 55' C sampai 56' C
selama dua jam. Ke dalam tabung di-
tambahkan 200 p1 larutan TE (50 mM
Tris, 10 mM EDTA), untuk meng-
hindari banyaknya DNA yang terbuang
dalam proses purifikasi. Purifikasi
DNA dilakukan dengan penambahan
100 p1 fenol:kloroform:isoamil alkohol
Bul. Penel. Kesehatan, Vol. 32, No. 1,2004: 1-16
(25 : 24 : 1). Campuran tersebut sebagai
deproteinisasi untuk mengeluarkan pro-
tein dari asam nukleat dan isoamyl al-
kohol bertindak sebagai anti busa.
Sampel disentrifugasi dengan ke-
cepatan 13.000 rprn selama 15 menit.
Lapisan atas dari larutan diambil dan
dipindahkan ke tabung baru. Kemudian
ke dalam tabung ditambahkan kembali
100 p1 campuran fenol: kloroform: iso-
amil alkohol ( 25 : 24 : 1). Campuran
larutan disentrifugasi kembali dengan
kecepatan 13.000 rpm selama 15 menit,
kemudian fasa bagian atas dipindahkan
ke tabung baru. Kemudian dilakukan
penambahan 67 p1 Isopropanol untuk
presipitasi pada suhu -20°C selama
semalam. Tabung disentrifugasi pada
kecepatan 14.000 rpm selama 15 menit.
Selanjutnya supernatan dibuang sehing-
ga hanya tinggal pelet DNA. Pelet
DNA dilarutkan kembali dengan 200 pl
TE. (50 mM.Tris/lO mM EDTA).
Presipitasi dilakukan sekali lagi dengan
menambahkan 20 p1 ammonium asetat
( 7 3 M) dan 500 pl etanol absolut dan
diinkubasi selama 2 jam pada suhu -20"
C yang kemudian disentrifugasi pada
kecepatan 10.000 rpm selama 5 menit.
Supernatan dibuang dan pelet dicuci
dengan 500 p1 etanol 70%. Pelet di-
keringkan dengan desicator vakum se-
lama 30 menit, selanjutnya pelet DNA
dilarutkan dengan 50 pl TE. Konsen-
trasi yang diperoleh dari hasil ektraksi
DNA yang berasal dari kaki nyamuk
tidak dihitung tetapi diamati melalui
proses elektroforesis dengan meng-
gunakan gel agarosa 0,8%. Pada isolasi
DNA dari 3 pasang kaki dapat diper-
oleh sebanyak 0,s-6,s ng DNAIindi-
vidu(''). Kebutuhan DNA genom untuk
PCR sebanyak 0,3 sampai 5,O ng (I6).
Polymerase Chain Reaction (PCR)
DNA genom yang diperoleh dari
hasil isolasi, selanjutnya diamplifikasi
dengan PCR. Reaksi PCR terdiri dari
dNTP, enzim Tag-Polimerase, buffer
PCR, MgClz , dHzO, dan primer dalam
konsentrasi dan komposisi tertentu. Se-
mua komponen reaksi PCR kecuali enzim
Tag-polimerase dibuat dalam bentuk ali-
quot untuk memperkecil terjadinya kon-
taminasi. Masing-masing aliquot tidak
lebih untuk 5 kali reaksi. Total volume
reaksi PCR adalah 25 pl. DNA genom
diamplifikasi dengan menggunakan pri-
mer OPE17; SYCTACTGCCGGT3' dari
produk teknologi operon, Alameda CA.
Primer yang digunakan ini secara tetap
untuk semua sampel Anopheles spp dari
10 desa. Pemilihan primer ini berdasarkan
hasil produk amplifikasi yang jelas dan
mudah terbaca untuk menganalisis DNA
hasil amplifikasi. Sebelum tabung Eppen-
dorf yang berisi komponen-komponen
PCR dimasukkan ke dalam mesin thermal
cycler merk Perkin Elmer Gene Amp
PCR 2400, terlebih dahulu disentrifugasi
selama 5 detik. Primer OPE 17 merupakan
komponen penentu daerah genom yang
diamplifikasi melalui reaksi PCR. Juga
primer berperan menentukan berapa ba-
nyak variasi genetik yang dapat diiden-
tifikasi. Siklus temperatur PCR yang
dipakai untuk denaturasi pada temperatur
94' C selama 1 menit, annealing pada
suhu 3S°C selama 1 menit, polimerisasi
pada suhu 72OC selama 2 menit dan
polimerisasi akhir selama 5 menit ke-
mudian tabung ditempatkan pada suhu
4OC selama 24 jam. Total siklus yang
digunakan yaitu 45 siklus 02*23). Hasil
produk PCR ini kemudian dielektrofore-
sis.

Elektroforesis
Hasil amplifikasi DNA dipisahkan
pasangan basanya dengan menggunakan
elektroforesis gel agarosa 1,4% pada
larutan TAE IX (40 mM Tris-asetat ,1
mM EDTA) ('I. Sampel DNA yang te-
lah diamplifikasi melalui reaksi PCR
ditambahkan 5 p1 loading buffer 5X se-
lanjutnya disentrifugasi selama 5 menit
agar DNA bercampur dengan loading
buffer .Sampel DNA diambil sebanyak
20 p1 dimasukkan ke dalam sumur gel
elektroforesis. Ke dalam alat elektro-
foresis di masukkan TAE IX . Standar
berat molekul yang dipakai adalah
DNA "ladder" 123 pb. Kemudian alat
elektroforesis dihidupkan dengan beda
potensial 70 Volt selama 2,5 jam. DNA
hasil amplifikasi yang telah dielektro-
foresis direndam larutan etidium bro-
mida dengan konsentrasi 2 pglml sela-
ma 5 menit. Gel dicuci dengan akua-
bides selama 2 jam (I8). Pengamatan
pola larik DNA dilakukan di bawah si-
nar ultra violet dan difoto dengan film
Polaroid 667.
Perhitungan Produk RAPD
Hasil amplifikasi dihitung berda-
sarkan ada atau tidaknya larik DNA.
Fragmen yang ada dinilai 1 sedangkan
yang tidak ada 0. Untuk menganalisis
data ini digunakan program NTSYS-pc
dengan analisis secara kualitatif dan
kuantitatif, berat molekul larik hasil
amplifikasi dihitung pasangan basanya
dengan berpedoman pada mi rasi DNA
standar (DNA ladder 123 pb) $2,24)
Perhitungan Pola Larik DNA
Untuk memperoleh komposisi dari
persentase pola larik DNA pada Anopheles
dihitung melalui kehadiran pola lariknya.
Polimorfisme Genetika dari............(Munif et.al)
Larik DNA yang selalu muncul pada se-
mua sampel Anopheles spp yang diban-
dingkan disebut larik DNA yang mono-
morfik. Sebaliknya larik DNA yang hanya
hadir pada beberapa sampel Anopheles spp
yang dibandingkan disebut larik DNA
yang polimorfik ( 2 5 ) , Perhitungan persen-
tase pola larik DNA monomorfik dan poli-
morfik dilakukan dengan cara yaitu:
membandingkan pola larik DNA mono-
morfik dan polimorfik antara sampel nya-
muk pada nyamuk antar desa yang ber-
sangkutan, masing-masing desa diambil
dua sampel Anopheles dengan masing-
masing Anopheles spp dalam setiap per-
lakuan dan dihitung persentasenya. Juga
Perbandingan pola larik DNA monomorfik
dan polimorfik berdasarkan keseluruhan
sampel. Perbandingan dilakukan dengan
menghitung semua larik yang selalu hadir
dan tidak hadir pada keseluruhan sampel
Anopheles. Dengan cara ini diperoleh
persentase pola larik DNA dari masing-
masing spesies di setiap lokasi. Persentase
pola larik DNA dari masing-masing
spesies pada setiap lokasi dapat diper-
hitungkan dan dikorelasikan dengan ting-
kat prevalensi dalam ha1 ini sediaan darah
positif (Slide Positif Rate, SPR) di setiap
desa.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Polimorfisme genetik
Produk Amplifikasi DNA Anopheles
barbirostris
Tingkat polimorfisme diperoleh dari
kehadiran lank-larik DNA yang tidak
selalu ditemukan pada seluruh individu
yang diamati. Sebaliknya larik DNA yang
selalu ditemukan dan konstan pada semua
individu merupakan larik non polimorfik
atau disebut juga monomorfisme. Sedang-
kan larik DNA yang polimorfik untuk
tingkat spesies, kalau larik itu hanya
ditemukan pada spesies tersebut dan pada
Bul.Penel. Kcwhatan, Vol. 32,No. 1,2004:1-16
spesies lain tidak ditemukan. Namun jika
membandingkan larik DNA dari individu
dalam spesies yang sama, maka larik yang
selalu ditemukan pada semua anggota
spesies tersebut biasanya dilakukan untuk
mengidentifikasi anggota spesies tersebut.
Perhitungan polimorfisme secara ku-
alitatif dilakukan dengan menganalisis se-
mua lank DNA yang diperoleh dari hasil
amplifikasi. Tingkat polimorfisme dianta-
ra dua individu diskor atas dasar ditemu-
kan atau tidaknya lank DNA yang diampli-
fikasi. Untuk memperoleh ukuran larik
DNA yang telah diamplifikasi dilakukan
perhitungan dengan analisis regresi. Pada
salah satu PCR sampel An. barbirostris
yang berasal dari Nagara Tengah tidak
ditemukan larik DNA. Kejadian ini mung-
kin disebabkan akibat tidak adanya DNA
template atau karena dilesi dan insersi pada
tempat pelekatan primer. lnsersi DNA
dapat mengakibatkan perubahan ukuran
dari h g m e n DNA, melalui perubahan
basa sederhana maupun yang terikat pada
hgmen
- DNA. (I0)
Pada elektroferogram hasil PCR
menggunakan primer OPE 17 terdapat
lank DNA hasil amplifikasi antara 0,38 kb
sampai 1,66 kb (Gambar 1 dan Tabel 1).
Pemakaian primer OPE 17 terhadap
sampel An. barbirostris yang berasal
dari desa Pasirmukti menghasilkan larik
yang monomorfik, yaitu yang beru-
kuran 0,42 kb, 0,46 kb, 0,51 kb, 0,72 kb
dan 0,92 kb. Pada sampel An. barbiros-
tris desa Cikondang ditemukan larik
yang berukuran antara 0,46 kb-0,92 kb,
dengan larik monomorfik pada ukuran
0,57 kb. Sampel An. barbirostris yang
berasal dari desa Radjadatu diperoleh
larik berukuran diantara 0,38 kb-1,30
kb dengan larik monomorfik 0,57 kb
dan 0,72 kb. Larik monomorfik ini
berguna untuk identitas spesies sebagai
penanda genetik(26).
Sampel An. barbirostris mempunyai
larik-larik DNA dengan ukuran yang ber-
beda pada elektrofmgram menunjukkan
lokus yang berbeda pula. Menurut
Grosberg et a1 (I0) bahwa intensitas larik-
larik tersebut dapat bervariasi &'bat
variasi dalam ha1 jumlah kopi lokus yang
diamplifikasi melalui kombinasi tenrpfate
primer. Hasil amplifikasi sampel An. bar-
birostris yang 1- dari desa Ciampa-
nan mempunyai lank yang berukuran di-
antara 0,57 kb-1,50 kb dengan mono-
morfik pada ukuran 0,57 kb, 0,63 kb, 0,76
kb dan 1,02 kb. Sarnpel An. barbirostris
yang berasal dari desa Cineam mempunyai
lank-lank DNA hasil amplifikasi diantara
0,57 kb sampai 1,36 kb, dengan ukuran
larik yang sama pada sampel lainnya yaitu
0,57 kb, 0,63 kb, 0,69 kb, 0,76 kb dan 0,92
kb. Sampel An. barbirostris yang berasal
dari Nagara Tengah diperoleh produk am-
plifikasi pada ukuran larik diantara 0,52
kM),72 kb.
Hasil pemeriksaan larik DNA pada
sampel An. barbirostris yang berasal dari
de& Cisarua, Ancol, Mediasari, Nagara
Tengah, Pasirmukti dan Cijulang dapat
dilihat pada Gambar 2 dan Tabel 2 dengan
larik amplifikasi diantara 0,26 kb- 1,57 kb.
Hasil PCR pada sampel An. barbirostris
dari desa Ancol memperoleh larik DNA
berukuran diantara 0,40kb- 1,10 kb, larik
yang berukuran sama ditemukan pada indi-
vidu lain berukuran 0,42 kb, 0,47 kb, 0,52
0,63 kb, 0,77 kb dan 0,86 kb. Anopheles
barbirostris yang berasal dari desa Cisarua
diperoleh larik yang berukuran diantara
0,26 kb -0,38 kb, larik yang mempunyai
ukuran sama pada larik 0,35 kb dan 0,38
kb (Gambar 2). Sedangkan hasil PCR sam-
pel asal Mediasari menghasilkan lank yang
berukuran diantara 0,26 kb-1,42 kb dengan
ukuran larik yang sama pada 0,70 kb, 0,77
kb, 0,86 kb, 0,90 kb, dan 0,95 kb. Hasil
pemeriksaan larik DNA pada sampel An.
barbirostris yang berasal dari desa Ciju-
 Polimorfisme Genetika dari.. ..........(Munif et.a[)

lang dengan larik amplifikasi diantara 0,57
kb-1,57 kb. Nyamuk asal desa ini meng-
hasilkan larik monomorfik pada ukuran
0,57 kb dan 0,7 kb. Anopheles barbirostris
yang berasal dari desa Pasirmukti dengan
larik amplifikasi diantara 0,42 kb-1,42 kb.
Nyamuk asal desa ini mempunyai larik
DNA yang berukuran yang sama pada 0,52
kb, 0,57 kb, 0,70 kb dan 0,77 kb. Ano-
pheles barbirostris yang berasal dari desa
Nagara Tengah dengan larik amplifikasi
diantara 0,32 kb-0,86 kb, dengan larik
monomorfik pada ukuran 0,38 kb, 0,42 kb
dan 0,57 kb. Dari hasil ini diperoleh
persentase tingkat polimorfisme tertinggi
ditemukan pada sampel nyamuk An.
barbirostris berasal dari desa Cikondang
(88,9%), Cijulang (8 1,8%) dan Radjadatu
(77,8%). Terjadinya perbedaan tingkat po-
limorfisme tersebut karena primer me-
ngamplifikasi DNA genom yang berva-
riasi. Semakin banyak variasi daerah DNA
genom yang diamplifikasi oleh primer
semakin tinggi ju a tingkat polimorfisme
F
suatu organisme ( O). Anopheles barbiros-
tris dari desa Cikondang, Cijulang dan
Rajadatu memiliki tingkat polimorfisme
yang tinggi dibanding sampel nyamuk dari
desa Pasirmukti, Cisarua dan Ancol.

DNA Ladder

Gambar 1. Elektroferogram Hasil PCR dengan Primer OPE 17 pada An. barbirostris Berasal
dari Enam Desa.

Keterangan : Kolom I DNA Ladder 123 pb; 2-3 Sampel Pasirmukti, 4-5 Cikondang; 6-7 Rajadatu 8-9
Ciampanan, 10-1 1 Cineam ; 12-13 Negara Tengah
Bul.Pmel.Kesehatan, Vol. 32,No. 1,2004:1-16

Tabel 1. Pengamatan Larik DNA pada An. barbirostris dari Enam Desa
Berdasarkan Ada atau Tidaknya Larik yang Diamplifikasi dengan
Primer OPE 17

Larik DNA Sampel An. barbirostris

(kb) 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2 1 3

Keterangan: 2-3 sampel Pasirmukti, 4-5 sampel Cikondang, 6-7 sampel Rajadatu, 8-9 sampel Ciampanan,
10-1 1 sampel Cineam, 12- 13 sampel Nagara tengah.
Skor 1 = adanya larik DNA ; Skor 0 = tidak ada larik DNA
 Polimorfisme Genetika dari.. ........ ..(Munif e1.01)

Keanekaragaman atau variasi genetik ter-
sebut disebabkan karena hilangnya be-
berapa urutan gen akibat adanya seleksi,
mutasi, erkawinan dan pertemuan dua po-
P
pulasi (9 . Desa yang mempunyai polimor-
fisme tinggi mempunyai geografis yang
berbeda, sehingga populasi satu atau bebe-
rapa urutan DNA yang mengakibatkan
urutan DNA nyamuk An. barbirostris
menjadi bervariasi. Hal ini sesuai dengan
hasil penelitian Kambhapati et a1 (27)
bahwa isolasi geografis menyebabkan per-
bedaan DNA itu sendiri bagi spesies yang
sama.

DNA Ladder
pb123 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1 2 1 3

Gambar 2. Elektroferogram Hasil PCR dengan Primer OPE 17 pada An. barbirostris
Berasal dari Lima Desa.

Keterangan: Kolom 1 DNA Ladder 123 pb; 2-3 Anco1 4-5 Cisarua; 6-7 Mediasari; 8-9
Cijulang; 10 - 1 1 Pasirmukti; 12-1 3 Nagara Tengah
Bul. Penel. Keschatan, Vol. 32, No. 1,2004: 1-16

Tabel '2. Pengamatan Larik DNA pads An. barbtrostris Berasal dari 6
Desa Berdasarkan Ditemakan ataa Tidaknya Larik yang
Diamplifikasi dengan Primer OPE 17

Larik DNA Sampel An. barbtrostris

(kb) 2 3 4 5 6 7 8 91011 12 13
137 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0
1.42 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 0 0
1.28 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0
1.15 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0
1,lO 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
1.05 0 1 0 0 1 0 0 1 1 0 0 0
0.95 O O O O l l O l l O O O
0.90 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0
0.86 l l O O I l l O l O l O
0.8 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
0,77 1 1 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0
0.70 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 0 0
0.63 1 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0
0.57 1 0 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1
0,52 1 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0
0.4 7 l l O O l O O O l O O O
0.42 1 1 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1
0,40 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0
0,38 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 1
0.35 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0
0,32 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1
0.28 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0
0.26 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0

Ketmngm: 2-3 sampel Ancol; 4-5 sampel Cisarua; 6-7 sampcl Mediasari; 8-9 sampel Cijulmg;
10- 1 1 sampel Pasirmukti; 12- 13 Nagan tcngah
Skor 1 = adanya larik; skor O= tidak ada larik

Hubungan Tingkat Polimorfisme
dengan Prevalensi Malaria
Tingkat polimorfisme genetik dari
An. barbirostris ditemukan selalu tinggi,
sehingga ada kecenderungan untuk lulus
hidup (survival) tinggi pada tingkat po-
limorfisme tinggi. Hal ini sesuai hasil
enelitian Roderick, dan William et a1
bahwa kepadatan populasi nyamuk
vektor yang tinggi disebabkan karena
memiliki sifat keanekaragaman yang le-
bih bervariasi sehingga nyamuk akan
mudah lulus hidup dan berkembang dari
generasi ke generasi.
Sedangkan nyamuk yang tingkat
polimorfismenya kurang bervariasi cen-
derung tidak mudah lulus hidup. Tingkat
polimorfisme genetik dari An. barbiros-
tris berpengaruh terhadap prevalensi
malaria. Karena mudah lulus hidup dan
berkembang maka populasi akan tinggi,
tingginya populasi akan memberikan pe-
luang dan menentukan derajat kontak
gigitan n amuk yang infektif terhadap
manusia (Y6 ) . Dengan adanya peluang An.
barbirostris untuk menularkan malaria
maka tingkat prevalensi akan meningkat.
Perbedaan dan persamaan dari larik
DNA pada spesies An. barbirostris hasil
amplifikasi dengan primer OPE 17 me-
mungkinkan untuk dapat dihitung per-
sentase larik DNA yang polimorfik dan
monomorfik melalui kehadiran lariknya.
Tabel 3 memperlihatkan hubungan
antara tingkat polimorfisme dengan pre-
valensi malaria (SPR) di setiap desa.
Desa Cisarua, Pasirmukti dan Cikondang
merupakan sumber gametosit yang setiap
tahunnya termasuk daerah SPR yang
tinggi. Namun pada tahun 1999 hanya
diketemukan dua desa dengan "SPR
tinggi" yaitu Cikondang dan Cijulang
dengan SPR masing-masing 22,7% dan
3 1,2%. Desa yang dikelompokkan dalam
strata "SPR sedang" yaitu desa Ciampa-
Polimorfisme Genetika dari............(Munif e t . 4
nan (21,7%) Rajadatu (23,2%) dan
Ancol (20,1%), sedangkan yang SPR
rendah yaitu desa Cisarua (6,5%), Cine-
am (2,6%) dan Nagara Tengah (3,8%).
Secara geografis desa Cikondang dan
Cijulang ini saling berdekatan sehingga
mempunyai tipe lingkungan hampir sama
dengan ketinggian untuk Pasirmukti
mencapai 680 m dari permukaan laut
(dpl) sedangkan Cikondang 600 m dpl
dan Cisarua tertinggi mencapai 750 m
dpl.
Berdasarkan perbandingan presen-
tase larik DNA yang monomorfik dan
polimorfik antar individu An. barbiros-
tris dalam setiap lokasi terlihat bahwa
tingkat polimorfisme larik sampel nya-
muk menunjukkan tingkat polimorfisme
berbeda-beda yaitu; desa Cikondang
(88,9%), Cijulang (81,8%), Cisarua (50
%), Pasirmukti (50%), Rajadatu (77,8%),
Mediasari (64,3%), Ancol (SO%), Ciam-
panan (63,6%), Cineam dan (44,5%),
Nagara Tengah (69,2%). Tingkat poli-
morfisme genetik yang tinggi ternyata
merupakan daerah dengan strata "SPR
tinggi" pula pada tahun 1999. Karena
tingginya tingkat polimorfisme dapat
memprediksi keadaan tingkat populasi
vektor yang tinggi sehingga memberikan
peluang yang besar nyamuk dapat kontak
untuk menggigit manusia. Menurut
Tabachnick dan lack(') bentuk variasi
genetik dalam spesies vektor juga ber-
pengaruh terhadap kapasitas vektorial
dan vector competence. Hasil penga-
matan larik DNA dari An. barbirostris
yang berasal dari desa yang berdekatan
memiliki tingkat persentase polimor-
fisme hampir sama. Kemungkinan ini
karena masih dalam jangkauan distribusi
nyamuk dalam melakukan aktivitasnya.
Sedangkan tingkat polimorfisme
sampel nyamuk An. barbirostris yang
berasal dari daerah dengan strata "SPR
 Bul. Penel. Kesehatan, Vol. 32, No. 1,2004: 1-16

sedang" masing-masing mempunyai lihatkan tingkat polimorfisme akan di-

tingkat polimorfisme 63,694 desa Ciam-
panan dan 69,2% desa Nagara Tengah.
Tingkat polimorfisme terendah dikete-
mukan pada sampel nyamuk An. barbi-
rostris yang berasal dari desa Pasirmukti
(50%), Cisarua (50%) dan Cineam (44,5
%). Hasil penelitian menunjukkan di-
mana tinggi rendahnya SPR akan diikuti
dengan meningkat dan menurunnya per-
sentase polimorfisme genetik dari An.
barbirostris. Hubungan variasi genetik
pada An. barbirostris yang dibandingkan
berdasarkan seluruh lokasi sampel nya-
muk dengan prevalensi malaria (SPR)
pada setiap desa di Kecamatan Cineam
tertera dalam Gambar 3 yang memper-
ikuti tingkat prevalensi malaria (SPR) di
masing-masing desa pengamatan.
Hasil analisis regresi diperoleh
persamaan hubungan antara tingkat
polimorfisme genetik pada An. barbi-
rostris yang dibandingkan seluruh lo-
kasi sampel dengan prevalensi malaria
(SPR) adalah Y = 0,692~+3,2,r =0,58,
P>0,05, makin tinggi tingkat polimor-
fisme maka makin tinggi pula persen-
tase SPR (Gambar 4).
Kejadian tersebut di atas tentunya
ada keterkaitan antara tingkat populasi An.
barbirostris dengan tingkat polimorfisme.

! % Polimrfisme W % SPR /

Garnbar 3. Hubungan yang Menunjukkan Tingkat Polimorfisme Genetik dari An.

barbirostris dengan Prevalensi (SPR) Malaria di Kecamatan Cineam,
Tasikmalaya.
Keterangan : % polimorfisme = jumlah larik yang hadir pada semua sempel di desa yang sama
 Polimorfisme Genetika dari............(Muif et.@

100-

% polimorfism
A n . barbirostris

90 -

80 -

70 -

60 1

0 10 20 30 40

% SPR

Gambar 4. Regresi yang Menunjukkan Hubungan Antara Tingkat Polimorfisme

Genetik An. barbirostris yang Dibandingkan Seluruh Lokasi Sampel dengan
Prevalensi Malaria (SPR) di Kecamatan Cineam, Tasikmalaya.
Y= 0,692 X + 3,20 : R = 0,578 (P>0,05)

Tingkat polimorfisme genetik pada
Anopheles dapat memprediksi tingginya
populasi nyamuk. Hasil penelitian menun-
jukkan An. barbirostris mempunyai tingkat
populasi paling tinggi pada setiap bulan
maupun pada setiap lokasi penelitian.
Dengan tingginya populasi An. barbiros-
tris tentunya dipengaruhi oleh keadaan
variasi/polimorfisme genetik karena spesi-
es yang mempunyai keanekaragaman yang
tinggi akan menyebabkan tahan terhadap
goncangan lingkungan sehingga dapat suk-
ses hidup (survive) dan pada akhirnya ting-
kat populasi menjadi tinggi. Tingginya
tingkat populasi ini akan memberikan pe-
luang Yang c u k u ~ menghisa~darah
manusia. Pada saat menghisap darah ma-
nusia parasit masuk ke tubuh nyamuk dan
berkembang biak sampai mencapai bentuk
parasit yang infektif (sporozoit). Hal ini
juga tergantung dari umur nyamuk. Bila
umur nyamuk pendek maka Plasmodium
tidak dapat berkembang lebih lanjut se-
hingga nyamuk tersebut tidak mungkin
sebagai vektor malaria. Kajian hubungan
tingkat polimorfisme genetik dengan pre-
valensi malaria, tingkat polimorfisme ge- .
netik dari An. barbirostris ditemukan se-
lalu tinggi pada daerah dengan SPR tinggi.
Kepadatan populasi nyamuk vektor
yang tinggi disebabkan karena memiliki si-
fat keanekaragaman yang lebih b a r i a s i ,
Bul. Penel. Kesehatan, Vol. 32, No. 1,2004: 1 - 16
Tabel 3. Hubungan Tingkat Polimorfisme Genetik An. barbirostris dengan Prevalensi
Malaria di Setiap Desa, Kecamatan Cineam ( Tahun 1999 S/D 2000)
No Desa
1. Pasirmukti
Cikondang
Rajadatu
Ciampanan
Cineam
Nagara Tengah
Mediasari
Ancol
Cisarua
Cijulang
sehingga nyamuk akan mudah lulus hi-
dup dan berkembang dari generasi ke
generasi ( 6 , 5 ) .
SIMPULAN
Berdasarkan hasil penelitian dan
hasil analisis pola larik DNA yang berhasil
diamplifikasi dari An. barbirostris terdapat
jumlah polimorfisme yang berbeda di seti-
ap desa. Tingkat polimorfisme genetik dari
An. barbirostris tertinggi ditemukan nya-
muk yang berasal dari desa Cikondang
(88,9%) dan Cijulang (81,2%) dan Raja-
datu (77,8%), ketiganya merupakan desa
dengan tingkat SPR tinggi. Analisa regresi
menunjukkan hubungan variasi genetik
pada AN. barbirostris dengan prevalensi
malaria memperlihatkan korelasi positif
dengan persamaan regresi Y = 0,692 X +
3,2, R = 0,58, p >0,05, dimana tingkat
polimorfisme berpengaruh terhadap tinggi-
nya tingkat prevalensi malaria (SPR).
Tingkat polimorfisme tinggi maka makin
tinggi pula tingkat prevalensi (SPR).
Kejadian ini didukung dari hasil perhi-
tungan kapasitas vektorial, kemampuan
Jumlah larik Jumlah larik SPR Malaria
monomorfik polimorfik
(%) (%)
5 (50) 5 (50) 5,9
hidup harian ,kepadatan populasi dan hasil
uji ELISA.
Evaluasi dari hasil elektroferogram
dengan menggunakan primer OPE 17
terhadap An. barbirostris menunjukkan
larik DNA amplifikasi diantara 0,38-1,6
kb. Larik berukuran 0,56 kb selalu ditemu-
kan pada sampel yang berasal dari desa
lainnya. Hasil pemeriksaan larik DNA
pada sampel An. barbirostris yang berasal
dari desa Cisarua, Ancol, Mediasari dan
Cijulang dengan larik amplifikasi diantara
0,25-1,9 kb. An. barbirostris dari desa
Cisarua diperoleh larik DNA amplifikasi
berukuran 0,35 kb-0,4 kb, lank ini selalu
ditemukan pada setiap individu. Anopheles
barbirostris yang berasal dari desa Ancol
mempunyai larik monomorfik 5 larik
dengan ukuran 0,70 kb selalu diketemukan
pada sampel asal Cijulang, Mediasari dan
Nagaratengah merupakan larik yang mono-
morfisme.
Persentase tingkat polimorfisme ter-
tinggi ditemukan Anopheles barbirostris
yang berasal dari desa Cikondang, Ci-
julang dan Rajadatu. Tingkat polimor-
fisme terendah ditemukan pada An. bar-

birostris berasal dari desa Pasirmukti dan
Cisarua. Hubungan tingkat polimorfisme
genetik dengan prevalensi malaria me-
nunjukkan hubungan korelasi positif dima-
na tingginya polimorfisme An. barbirostris
diikuti tingginya SPR.
Tingkat polimorfisme genetik dari
An. barbirostris ditemukan lebih bervariasi
dibandingkan dengan An. aconitus, sehing-
ga ada kecenderungan untuk lulus hidup
(survival) tinggi pada tingkat polimorfis-
me tinggi. Kepadatan populasi nyamuk
vektor yang tinggi disebabkan karena
memiliki sifat keanekaragaman yang lebih
bervariasi, sehingga nyamuk akan mudah
lulus hidup dan berkembang dari generasi
ke generasi. Populasi vektor yang tinggi
memberikan peluang nyamuk menggigit
yang tinggi pula sehingga transmisi dapat
berlangsung
DAFTAR RUJUKAN
1. Tabachnick,W.J. and William, C.B, Popu-
lation genetics in vector biology. Paper
Training Course, The Biology of Disease
vectors, New Delhi. 1998,417- 437.
2. Dietz, R, Mathematical Models for Trans-
mission and Control of Malaria. Churc-hill,
Livingstone,
- 1998, 1052-1 133.
3. Wernsdorfer,W.H. and Megregor,I.S., Malaria
Principles and Practice of Malariology 2,
Churchil-Livingstone. New York, 1998.
4. WHO. (1975) Manual on Practical Entomology
in Malaria, Part 1., Geneva.
5. Roderick, G. K. ,Geographic structure of
insect populations: gene flow, phylo-
geography, and their uses. Ann.Rev. Entomol.
1996,41 ,325 - 352.
6. Wiliam,C., Black Nancy,H., RAPD-PCR and
SSCP analysis for Insect Population Genetic
StudiesMolecular Biology of Insect Disease
Vectors, Chapman and Hall, 1997.
7. Wallis,G.P., Tabachnick, W.J., Powell, J.R.,
Genetic heterogencity among Caribbean
"Population of Aedes aegypti, Am.J.
Trop.Med.Hyg, 1984, 33(3) ;492 - 498.
Polimorfisme Genetika dari............(Munif et.al)
8. Nusantara,S., Fujie,M., Yamada,T., Malek,W.,
Inaba,M., Kaneko,Y and Yoshikatsu, M,
Phylogenitic position of Mesorhizobium
huakui subsp rengei, a symbiont of Astragus
sinicus cv.Japan. J.Bio.Bioengineering, 1999,
87 (1),49-53
9. Haymer, B.S., Genetic analysis of laboratory
and willd srain of the melon fly (Diptera: Tep-
ritidae) using Random Amplified Polymorphic
DNA Polymerase Chair Reaction, Ann.
Entomol. Soc, 1995, 88 (5), 705-710.
10. Grosberg, R.K., Levitan, D,R ,Cameron,B.B,
Characterization of genetic structure and
Genealogies using RAPD-PCR markers: A
random primer for the Novice and Nervous, in
Ferraris,J.D., Palumb, S.R., Moleculer
Zoology, Advances, Strategies and Protocols,
John Willey & Sons, Inc. Pub,New York,
1996,67 -132.
11. Schriefer, M.E., Sacci, J.B., Wirth, R. A,, and
Azad, A. F., Detection of polymerase chain
reaction amplified malaria DNA in infected
blood and individual mosquitoes. Exp.
Parasitol., 1991, 73 , 31 -316.
12. Hugh,G.G. and Annette,M.G. PCR Technology
Current 1nnovations.CRC Press, Boca Raton,
Ann Arbor, London, Tokyo. 1994,
13. Beebe,N.W. and Saul,A, Discrimination of All
Members of Anopheles punculatus complex by
Polymerase Chain Reaction, Restriction
~ r a b e n t Length Polymorphism Analysis.
Am.J.Trop. Med. Hyg, 1995,478-481.
14. Kambhapati,S., Black,W.C. and Rai,K.S.,
Random Amplified Polymorphic DNA of
Mosquito Spesies and population (Dipte-
ra:Culicidae): Techniques, Statistical Analysis
and Application, J. Med. Ento., 1996, 29 (6 )
15. Hill, S. M and Crapton, J.M., DNA based
methods for the identification of insect vectors,
Annals of Tropical Medicine and Parasitology.
1994, 88 (3), 227-254.
16. Garcia, A.I., Corrasco, H.I., Scholfield,C.J.,
Russell,J., Frame,I.A., Valents,A.S. and
Mils, M., Random amplification of poly-
morphic DNA as a tool for taxonomic studies
of triatomime bug (Hemiptera: ~eduvidak9
J.Med. Entomol., 1998 35 ( I ) , 38-45.
17. Leslie,A.R., Ecological genetics. Princeton
University Press, New Yersey. 1994
Bul. Penel. Kesehatan, Vol. 32, No. 1,2004: 1-16
18. Hill, S. M., Urwin, R., Knapp, T.F. and
Crampton, J. M., Synthetic DNA probes for
the identification of sibling species in the
Anopheles gambie. Complex. 1991
19. Wilkerson,R.C., Parsons,T.J., Klern,T.A.,
Diagnosis by random Amplified Polymorphic
DNA Polymerase Chain Reaction of four
cryptic species related to Anopheles (Nyssor-
hynchus) albitarsis (Diptera : Culicidae) from
Paraguay, Argentina, J.Med.Entomo1, 1993,
32 (5), 697-704.
20. Walton,C.J., Hanley,C., Kuvangkadilok,F.H.,
Collin, R.E., Haebach,V.,Baimai,N. and
Butlin,R. K., Identification of five species of
the Anopheles dirus complex from Thailand,
using allele specific Polymerase Chain Reac-
tion. Medical and Viterinary Entomology.
1999, 13,24-32.
21. Williams,J.G.K., Kubelik,A.R., Livak,K.J.,
Rafalski,J.A. and Tingey,S.V., DNA Poly-
morphism~Amplified by Arbitrary Primers are
Useful as Genetic Markers, Nuc. Acd.Resr.,
1990, I 8 (22), 653 1-6534
22. Yuwono, T. Petunjuk Laboratorium Reaksi
rantai Po1imerase.Universitas Gajah Mada,
Yogjakarta. 1998,
23. Beebe,N.W., Foley,H.D., Saul,A.L., Bryan,J.H.
and Burkot,T., DNA probe for identifying
members of the An.punculatus Complec in
Papua, New Guinea. Am.J.Med.Hyg. 1994,50,
229-234.
24. Wilkerson.R.C., Parsons,T.S., Albright,D.G.,
Klein,T.A. and Braun,M.J., Random amplified
polymorphic DNA (RAPD) markers readly
distinguish Cryptic mosquito Spesies (Diptera
:Culicidae: Anopheles), Insect Molecular
Biology. 1,1993, (4), 205-21 1
25. Scott,J.A., Brogdon, W.G. and Collin, F.H.,
Identification of single specimens of the
Anopheles gambiae complex by Polymerase
Chain Reaction.. Am J. Trop. Hyg., 1993, 49
(4), 520-529.
26. Gilles, H. M., and Warrel, D. A., Bruce-
chwaatt's Essential Malariology. Third Edit.
Edward Arnold. London, Boston Melbourne
Auckland., 1993, 12-34.
27. Kambhapati, S, Black,W.C. and Rai,K.S..
Random Amplified Polymorphic DNA of
Mosquito spesies and population (Diptera;
Culicidae). Techniques Statistical Analysis and
Application, J.Med.Ento, 1966,29 (6) 939-949