AGAR SANGRE:

FUNDAMENTO, USOS Y
PREPARACIÓN
El agar sangre es un medio de cultivo sólido enriquecido, diferencial
pero no selectivo. Es utilizado para la recuperación y crecimiento de una
gran variedad de microorganismos provenientes de muestras clínicas o
para subcultivos.

El agar sangre clásico debe ser incluido para el sembrado de la mayoría

de las muestras clínicas recibidas en el laboratorio; a excepción de las
muestras de heces en el que no es útil, a menos que se prepare con
ciertas modificaciones.

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Placa de agar sangre
Este medio de cultivo se compone básicamente de un agar base
enriquecido y 5% de sangre. La base de agar puede variar de acuerdo a
las necesidades, pero principalmente estará compuesto por peptonas,
aminoácidos, vitaminas, extracto de carne, cloruro de sodio, agar, entre
otros.

En cuanto a la sangre, normalmente se requiere tener contacto con un

bioterio para la obtención de sangre de animales, tales como carnero,
conejo o caballo. Sin embargo, esto no siempre es posible y en
ocasiones se usa sangre humana.

El medio agar sangre puede ser preparado en el laboratorio o puede

comprarse ya listo a empresas que se dedican a ello. La preparación de
este medio es uno de los más delicados, cualquier descuido en su
elaboración dará como resultado un lote contaminado.

Es por ello que deben tomarse todas las precauciones posibles y al final
debe realizarse un control de calidad incubando a 37 °C 1 placa por cada
100 que se preparen.
Fundamento

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Staphylococcus aureus cultivado en agar sangre. Nathan Reading on

Flickr Nathan R. on twitter [CC BY 2.0
(https://creativecommons.org/licenses/by/2.0)], via Wikimedia
CommonsYa se ha mencionado que el agar sangre tiene como
característica ser un medio enriquecido, diferencial y no selectivo. A
continuación se explica el basamento de cada una de estas propiedades.
El agar sangre es un medio enriquecido porque lleva como aditivo
principal 5 -10% de sangre sobre una base de agar. Ambos compuestos
contienen muchos nutrientes y esta propiedad permite que en él puedan
crecer la mayoría de las bacterias cultivables.
Ese crecimiento ocurre sin restricción; por este motivo es no
selectivo. Sin embargo, si a este medio se le adicionan compuestos que
impidan el crecimiento de algunos microorganismos y favorezca el de
otros, se vuelve selectivo. Es el caso si se adicionan ciertos tipos de
antibióticos o antifúngicos.

Así mismo, el agar sangre es un medio diferencial, ya que permite

distinguir 3 tipos de bacterias: los beta-hemolíticos, alfa –hemolíticos y
gamma-hemolíticos.

Los beta-hemolíticos son aquellos que tienen la capacidad de lisar o

romper completamente los glóbulos rojos, formando un halo claro
alrededor de las colonias, por tanto producen hemólisis ß ó ß –hemólisis
y los microorganismos son llamados ß-hemolíticos.

Ejemplos de bacterias ß-hemolíticos son Streptococcus

pyogenes y Streptococcus agalactiae.

Los alfa-hemolíticos son los que realizan una hemólisis parcial, donde la
hemoglobina es oxidada a metahemoglobina, generándose una
coloración verdosa alrededor de las colonias. A este fenómeno se le
conoce como hemólisis α ó α –hemólisis y a las bacterias se les clasifica
como α – hemolíticos.

Ejemplo de bacterias α – hemolíticos son Streptococcus

pneumoniae y Streptococcus del grupo viridans.

Por último, están las bacterias denominadas gamma-hemolíticas o no

hemolíticas. Estas crecen sobre el agar sin generar cambios sobre el
mismo, efecto conocido como γ –hemólisis, y los microorganismo son γ
–hemolíticos.
Ejemplo de bacterias γ –hemolíticos: algunas cepas de Streptococcus
del grupo D (Streptococcus bovis y Enterococcus faecalis).

Usos
El medio de cultivo agar sangre es uno de los más comúnmente
utilizados en el laboratorio de microbiología.

Entre los microorganismos capaces de crecer en el medio agar sangre se

tienen: bacterias aerobias estrictas, facultativas, microaerófilas,
anaerobias, Gram positivas o Gram negativas, bacterias de crecimiento
rápido o crecimiento lento.

También crecen algunas bacterias exigentes o fastidiosas desde el punto

de vista nutricional, así como hongos y levaduras. Así mismo, es útil
para realizar subcultivos o reactivar cepas que metabólicamente estén
muy débiles.

Sin embargo, la elección del tipo de sangre y del agar base variará
dependiendo del microorganismo probable que se sospecha recuperar y
al uso que se le va a dar a la placa (cultivo o antibiograma).

ELECCIÓN DEL TIPO DE SANGRE

La sangre puede ser de cordero, conejo, caballo o humana.

La más recomendada es la sangre de cordero, salvo algunas

excepciones. Por ejemplo, para aislar especies de Haemophilus, donde la
sangre recomendada es la de caballo o conejo, ya que la sangre de
cordero posee enzimas que inhiben el factor V.

La menos recomendada es la humana, sin embargo es la más usada,

quizás por ser la más fácil de obtener.
La sangre debe ser desfibrinada, obtenida sin ningún tipo de aditivo y
proveniente de animales sanos. Para el uso de la sangre humana hay
que tener presente varios factores:

Si la sangre proviene de individuos que han padecido infecciones

bacterianas, estas poseerán anticuerpos específicos. En estas
condiciones es probable que se inhiba el crecimiento de algunas
bacterias.

Si la misma se obtiene del banco de sangre, esta contiene citrato y es

posible que ciertas bacterias no se desarrollen en su presencia. Por otra
parte, si la sangre proviene de pacientes que están tomando
antibióticos, puede inhibirse el crecimiento de bacterias susceptibles.

Y si la sangre es de una persona diabética, el exceso de glucosa

interfiere en que se desarrollen adecuadamente los patrones de
hemólisis.

ELECCIÓN DEL TIPO DE AGAR BASE

El agar base utilizado para la preparación del agar sangre puede ser muy
amplio. Entre ellos se tienen: agar nutriente, agar infusión cerebro
corazón, agar soya tripticasa, agar Müeller Hinton, agar Thayer Martin,
agar Columbia, agar Brucella, agar Campylobacter, etc.
USOS DEL AGAR SANGRE DE ACUERDO AL MEDIO
BASE UTILIZADO PARA SU PREPARACIÓN

Agar nutriente

Esta base es la menos utilizada, pues sobre él crecerán principalmente

bacterias no exigentes, como bacilos entéricos, Pseudomonas sp, S.
aureus, Bacillus sp, entre otros. No es recomendable para aislar
Streptococcus.

Agar infusión cerebro corazón (BHI)

Es uno de los más utilizados como base del agar sangre, porque posee
los nutrientes necesarios para el crecimiento de la mayoría de las
bacterias, incluyendo Streptococcus sp y otras bacterias exigentes.
Aunque no es apropiado para observar patrones de hemólisis.

Con esta base generalmente se usa sangre de cordero.

También se puede preparar variantes de agar sangre, donde se

adicionan otros compuestos para aislar determinados
microorganismos. Por ejemplo, el agar infusión cerebro corazón
suplementado con sangre de conejo, cistina y glucosa, sirve para
aislar Francisella tularensis.

En tanto que, con cistina telurito es útil para el aislamiento

de Corynebacterium diphteriae. Se puede usar sangre humana o de
cordero.

Con la primera la beta-hemólisis se verá como un halo estrecho,

mientras que con la segunda el halo será mucho más amplio.

Así mismo, esta base junto con bacitracina, almidón de maíz, sangre de
caballo y otros suplementos de enriquecimiento (IsoVitaleX), se usa para
el aislamiento del género Haemophilus sp a partir de muestras
respiratorias.

También, si se le adiciona la combinación de antibióticos cloranfenicol –

gentamicina o penicilina – estreptomicina con sangre de caballo, es
ideal para el aislamiento de hongos patógenos exigentes, incluso con un
rendimiento superior al agar Sabouraud glucosa. Especialmente es útil
en el aislamiento de Histoplasma capsulatum.

Agar soya tripticasa

Esta base es la más recomendada para una mejor observación del

patrón de hemólisis y realización de pruebas diagnósticas tales como
taxos de optoquina y bacitracina. Es el agar sangre clásico que se usa de
rutina.

Con esta base también se puede preparar el agar sangre especial

para Corynebacterium diphteriae, con cistina telurito y sangre de
cordero.

Así mismo, la combinación de este agar con sangre de cordero, más

kanamicina-vancomicina es ideal para el crecimiento de anaerobios,
especialmente Bacteroides sp.

Agar Müeller Hinton

Esta base suplementado con sangre se usa para realizar el antibiograma

de microorganismos exigentes, tal como Streptococcus sp.También es
útil para el aislamiento de bacterias como Legionella pneumophila.

Agar Thayer Martin

Este medio es ideal como base del agar sangre cuando se sospecha del
género Neisseria, especialmente Neisseria meningitidis, ya que N.
gonorrhoeae no crece en agar sangre.
También sirve para realizar las pruebas de susceptibilidad a Neisseria
meningitidis.

Agar Columbia

Esta base es excelente para sembrar muestras de biopsias gástrica en

busca de Helicobacter pylori.

El medio se prepara adicionando 7% de sangre de cordero desfibrinada

con antibióticos (vancomicina, trimetoprim, anfotericina B y cefsulodin)
para restringir el crecimiento de otros tipos de bacterias que puedan
estar presentes.

Esta misma base suplementada con sangre humana o de cordero, ácido

nalidíxico y colistina es útil para aislar Gardnerella vaginalis. También es
ideal para evaluar la susceptibilidad antimicrobiana a los antibióticos del
mismo microorganismo.

Además, sirve para la preparación de agar sangre para el cultivo de

anaerobios, adicionando aminoglucósidos y vancomicina.

Esta base permite observar adecuadamente los patrones de hemólisis.

Agar Brucella

Este medio usado como base del agar sangre junto con la adición de
vitamina K es ideal para el cultivo de bacterias anaerobias. En este caso
se recomienda el uso de sangre de cordero.

Agar Campylobacter

Agar Campylobacter suplementado con 5% de sangre de carnero y 5

antibióticos (cefalotina, anfotericina B, trimetoprima, polimixina B y
vancomicina), es el medio utilizado para aislar Campylobacter jejuni en
muestras de heces.
PREPARACIÓN
Cada casa comercial trae al reverso del envase las indicaciones para
preparar un litro de medio de cultivo. Se pueden hacer los cálculos
correspondientes para preparar la cantidad deseada, según el agar base
seleccionado.

PESAR Y DISOLVER

El agar base viene deshidratado (en polvo), por tanto debe disolverse en
agua destilada ajustada a pH 7,3.

Se pesa la cantidad que indique el agar base escogido y se disuelve en la

cantidad de agua correspondiente en una fiola, luego se calienta a fuego
moderado y se mezcla con movimientos rotativos hasta disolver todo el
polvo.

ESTERILIZAR

Una vez disuelto, esterilizar en autoclave a 121°C por 20 minutos.

AGREGADO DE LA SANGRE

Al salir del autoclave se dejar enfriar la fiola hasta que la temperatura

oscile entre 40 a 50 °C; es una temperatura que la piel humana soporta
y a la vez el agar aun no se ha solidificado.

Para ello, se toca la fiola con la mano y si el calor es tolerable, es la

temperatura ideal para agregar la cantidad de sangre desfibrinada
correspondiente (50 ml por cada litro de agar). Mezclar suavemente
para homogeneizar.El paso del agregado de la sangre es crucial, pues si
se realiza cuando el medio está muy caliente los glóbulos rojos se
romperán y el medio no servirá para observar hemólisis.

Si se agrega demasiado frío, se formarán grumos y la superficie del

medio no quedará lisa para poder hacer el estriado adecuadamente.

VERTER EN LAS PLACAS DE PETRI

Servir en placas de Petri estériles inmediatamente después de

homogeneizar la sangre. En cada placa de Petri se vierte
aproximadamente 20 ml. Este procedimiento se realiza en una campana
de flujo laminar o cerca del mechero.

Al momento de servir el agar sangre en las placas de Petri no deben

quedar burbujas de aire en la superficie de la placa. Si esto sucede se
pasa la llama del mechero de Bunsen rápidamente sobre la placa para
eliminarlas.

Las placas se dejan solidificar y se guardan en nevera (2-8°C) de forma

invertida hasta su uso. Antes de usar las placas de agar sangre se deben
atemperar (dejar que tomen temperatura ambiente) para poder ser
sembradas.

Las placas preparadas tienen una duración aproximada de 1 semana.