Vous êtes sur la page 1sur 10

Penetapan Kadar Levofloksasin Generik dan Paten

Dalam Plasma Manusia Secara In Vitro


Menggunakan Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

Pri Iswati Utami1, dan Susanti1


1. Fakultas Farmasi, Universitas Muhammadiyah Purwokerto, Jalan Raya Dukuhwaluh PO BOX
202 Purwokerto, 53182
Penulis untuk korespondensi, Tel 0281-636751, Fax 0281-637239, E-mail : utami_pie@yahoo.com.

ABSTRACT
Levofloxacin, the L-isomer of ofloxacin has a broad spectrum activity and has been
shown to be more active than ofloxacin. The aim of this research is to develop an
analytical method to determine in vitro human plasma concentration of generic and
branded levofloxacin by HPLC with Uv detector
The stationary phase was Octadesyl silane (ODS) in a stainless steel column,
25 cm x 4.6 mm (5 m particle size). The mobile phase was 0.16% ortho-phosphoric
acid, adjusted to pH 3 with sodium hydroxide 0.2 N : acetonitrile (85:15). Detector
ultraviolet (λ 295 nm) was used. The flow rate was 1.0 ml/min. Plasma sample (475
µL) spiked with 2.5 µg Levofloxacin and 500 µl 0.16% orto-phosphoric acid was
added. The mixture was vortexed, add 5 ml of isopropyl alcohol : diclormethan (1:9),
and the mixture was roller mixer for 30 minute, and ultracentrifuge at 3000 rpm.
Residue of 4 ml organic layer was reconstitution with mobile phase. The filtrate (20
µL) was injected in the HPLC system.
The chromatogram shows good selectivity, no chromatographic peaks that
could potentially interfere with that of levofloxacin. Branded and Generic
Levofloxacin plasma concentration found 3.24±0.12 and 3.18±0.26 µg/ml
respectively. The percentages of branded and generic recoveries were 96.36±6.98%
and 95.75±15.80% respectively. The repeatability of the assay, expressed as the
percentage coefficient of variation (% CV) were 3.70 and 8.36 %. The conclusion of
this research that the method describes here is specific and sensitive assay for in vitro
human plasma concentration of generic and branded levofloxacin.

Key words : HPLC, Branded and generic Levofloxacin, human plasma.

PENDAHULUAN
Levofloksasin adalah antibiotika golongan fluorokuinolon yang merupakan
isomer ofloxacin. Levofloksasin merupakan antibiotika spektrum luas yang memiliki
aktivitas in vitro terhadap bakteri Gram positif dan negatif seperti Streptococcus
pneumoniae, Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Haemophilus
influenzae, Moraxella catarrhalis, Escherichia coli, Enterobacter cloacae, Klebsiella
pneumoniae, dan Pseudomonas aeruginosa. Senyawa tersebut aktif pula terhadap
beberapa bakteri anaerob dan patogen lain seperti Legionella pneumophila,
Mycoplasma pneumoniae, dan Chlamydia pneumoniae (Chien et al., 1998, El-Brashy
et al., 2004).
Levofloksasin yang dikenal di Amerika Serikat pada tahun 1996 dan saat ini
sudah ada produk levofloksasin baik paten maupun generik yang beredar di Indonesia
belum banyak diteliti diantaranya belum masuknya Levofloksasin di dalam monografi
Farmakope Indonesia Edisi IV 1995 maupun Farmakope Amerika (United State
Pharmacopeia, USP) Edisi XXVIII tahun 2005. Hal tersebut menjadi masalah
tersendiri khususnya yaitu masih sedikitnya data hasil penelitian yang memberikan
informasi tentang konsentrasi levofloksasin baik paten maupun generik dalam cairan
biologis seperti plasma. Penetapan konsentrasi obat dalam plasma sangat penting,
karena jumlah obat dalam plasma akan berpengaruh langsung pada tercapainya efek
terapi yang diharapkan.
Metode penetapan kadar levofloksasin yang telah dikembangkan ada beberapa
macam yaitu metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) dengan detektor
fluoresensi, photo diode array, dan spektrometer massa (Tobin et al., 1999), metode
spektrofluorometri (Salem, 2005; Ming et al., 2006), spektrofotometri visibel
(Momani, 2006; Darwish, 2006; Sivasubramanian et al., 2004), spektrofometri
serapan atom (Salem, 2005) serta spektrofometri luminesensi (Ocana et al., 2000).
Masih jarang dilakukan penelitian penetapan kadar levofloksacin dalam plasma dengan
menggunakan metode KCKT dengan detektor Ultraviolet (Uv), padahal detektor
inilah yang paling umum dimiliki oleh laboratorium-laboratorium analisis, sehingga
penting dilakukan penelitian untuk menggunakan metode ini dalam penelitian ini untuk
menetapkan kadar levofloksasin dalam plasma manusia.
Penentuan kadar obat dalam darah merupakan pilihan ideal dalam pengujian
ketersediaan hayati (bioavailabilitas) suatu obat. Saat ini uji bioavailabilitas dan
bioekivalensi antara produk paten dan generik menjadi syarat wajib yang ditetapkan
pemerintah. Untuk dapat melaksanakan uji Bioavailabilitas dan Bioekivalensi
diperlukan metode analisis obat dalam plasma yang memiliki selektivitas tinggi,
sensitivitas dan gangguan yang sesedikit mungkin dari zat pengganggu. Metode
penetapan kadar levofloksasin menggunakan KCKT telah dilakukan, akan tetapi perlu
dilakukan validasi metode untuk penetapan kadar levofloksasin produk paten dan
generik dalam plasma secara in vitro agar diperoleh metode yang spesifik dan sensitif
sehingga dapat diaplikasikan pada uji bioavailabilitas dan bioekivalensi levofloksasin
yang nantinya dapat menjamin mutu, khasiat dan keamanan obat levofloksasin.

METODE PENELITIAN
A. Bahan dan Alat
1. Alat yang digunakan:
Seperangkat alat KCKT (Shimadzu LC-10 AT VP) yang dilengkapi detektor
Uv-vis SPD-10A, Shimadzu system controller SCL- 10A, Rheodyne loop
injector, kolom KCKT= Shim- pack CLC-ODS (M); panjang 15 cm; diameter
4,6 mm; ukuran partikel 5 µm, filtration unit for HPLC (Whatman),
spektrofotometer Uv-vis (Shimadzu UVPC-1601), pH meter, Ultrasonic Bath
(Branson 1510), sentrifugator, timbangan analitik, vortex, mikropipet dan alat
gelas yang biasa digunakan di laboratorium analisis.
2. Bahan yang digunakan :
Baku pembanding levofloksasin (PT. Indofarma), tablet levofloksasin paten
(PT.Dankos Laboratories Tbk) , tablet lefofloksasin generik (PT. Kimia Farma),
asam Orto-fosfat p.a (E.Merck), asetonitril derajat KCKT (PT.Samarth
Chemicals Indonesia), diklormetan p.a (E. Merck), isopropil alkohol p.a (E.
Merck), NaOH (E. Merck), membran filter 0,40-0,45 µm, aquabidestilata (PT.
Otsuka), plasma manusia.
B. Cara Kerka
1. Kondisi KCKT untuk penetapan kadar Levofloksasin
Sistem KCKT yang digunakan mengacu pada Tobin, et al (1999) dan Harmita, dkk.
(2004) adalah sebagai berikut :
Fase diam : Silica RP-18 (Octadecyl silane/ODS) yang diikatkan pada
pendukung silika berdiameter 5 µm dalam kolom baja tahan
karat berdiameter dalam 4,6 mm dan panjang 25 cm.
Fase gerak : Campuran Asam ortho-fosfat 0,16 % pH dibuat 3 dengan
penambahan natrium hidroksida 0,2 N dan asetonitril
dengan perbandingan 85:15.
Kecepatan alir : 1,0 ml/menit.
Volume injeksi (loop) : 20 µl
Detektor : Uv 295 nm

Uji kesesuaian sistem


Larutan baku levofloksasin 10x10-3 dan 30x10-3 mg/ml dibuat enam replikasi.
Masing-masing diinjeksikan sebanyak 30 µl ke alat KCKT. Diperoleh kromatogram
yang akan digunakan untuk menentukan keberulangan penyuntikan larutan baku yang
dinyatakan dalam simpangan baku relatif (Koefisien Variansi/KV = Relative Standard
Deviation/RSD). Akan ditentukan pula faktor ikutan, T, untuk membatasi asimetri
yang diperbolehkan (Anonim, 1995).

2. Pembuatan Larutan Sampel Levofloksasin


Sampel tablet levofloksasin (10 tablet) ditimbang seksama satu per satu
kemudian digerus sampai halus dan homogen. Hasil gerusan ditimbang seksama
sejumlah tertentu atau setara dengan 100 mg levofloksasin, dilarutkan dalam 100
mL campuran asam orto fosfat dan asetonitril (85:15), didapat konsentrasi 1000
µg/mL levofloksasin. Kemudian dilakukan pengenceran sehingga didapatkan
konsentrasi 100 µg/mL.
3. Penetapan kadar Levofloksasin dalam plasma secara KCKT

Sebanyak 0,4750 mL plasma ditambah dengan 0,025 mL larutan sampel


levofloksasin dengan konsentrasi 5 µg/mL dimasukkan ke dalam tabung
sentrifuge ditambah larutan asam orto phospat 0,16 % pH 3 sebanyak 500 µL,
vortex 3 detik. Setelah itu masukkan 5 mL campuran isopropil alkohol :
diklormetan (1:9). Roller Mixer selama 30 menit, kemudian disentrifuge 20
menit dengan kecepatan 3.000 rpm. Diambil 4 mL supernatannya lalu diuap
keringkan dan rekonstitusi residu dengan 500 µL campuran asam orto fosfat pH
3 dan asetonitril (85:15), divortex 3 detik dan diinjeksikan ke alat KCKT
sebanyak 100 µL ( yang masuk kealat KCKT 20 µL). Percobaan diulangi 6X.

HASIL DAN PEMBAHASAN


Penentuan kadar obat dalam darah merupakan pilihan ideal dalam pengujian
ketersediaan hayati suatu obat. Untuk menguji kadar levofloksasin produk paten dan
generik dalam plasma secara in vitro diperlukan metode analisis yang tepat agar dosis
obat tersebut sesuai dengan kebutuhan. Penetapan kadar levofloksasin produk generik
dalam plasma secara in vitro membutuhkan metode dengan selektivitas tinggi,
sensitivitas dan gangguan yang sesedikit mungkin dari zat pengganggu oleh karena itu
digunakan KCKT.
Analisis levofloksasin pada sediaan tablet levofloksasin paten dan generik
menggunakan KCKT fase terbalik dimana fase diam yang digunakan bersifat non polar
yaitu octadesyl silane dan fase gerak yang bersifat relatif lebih polar dari fase diamnya
yaitu campuran asam ortho fosfat 0,16 % pH 3 dengan penambahan NaOH 0,2 Ndan
Asetonitril ditambahkan dengan perbandingan (85:15). Fase gerak dibuat pH 3 yang
berada pada rentang pH yang diijinkan untuk kolom C18 yaitu 2 – 8. Penambahan
basa kadang-kadang diperlukan untuk menetralkan residu SiOH bebas agar
levofloksasin tidak terionkan. Jika terbentuk ion dikhawatirkan ion tersebut akan
berikatan dengan SiOH bebas yang ada pada kolom C 18 (fase diam) yang akan
menyebabkan terjadinya gangguan pada waktu retensi, yaitu levofloksasin akan
tertahan lebih lama didalam kolom. Asetonitril bersifat polar dan viskositasnya rendah
sehingga mudah mengalir serta asetonitril tidak menyerap intensitas cahaya pada
daerah Uv antara 200- 400 nm.
Cairan hayati yang digunakan adalah plasma manusia. Plasma diperoleh
dengan cara sampel darah yang diperoleh dari probandus ditambahkan antikoagulan
yaitu EDTA karena lebih baik bila dibandingkan dengan heparin dan EDTA digunakan
khusus untuk analisis dengan sampel plasma secara in vitro (Lam et al.,2004).
Kemudian ditambahkan TCA 10 % (1:5) untuk memisahkan komponen darah dan
protein dari plasma. Kemudian disentrifuge dengan kecepatan 2500 rpm untuk
memperoleh plasma yaitu bagian filtrat yang jernih pada bagian atas setelah proses
sentrifuge ( Clevelandclinic, 2007).
Detektor yang digunakan adalah Detektor multiplayer chip dengan
menggunakan sumber energi Uv 295 nm. Pemilihan detektor ini didasarkan pada
levofloksasin yang memiliki ikatan rangkap terkonjugasi sehingga dengan adanya
ikatan ini menjadikan levofloksasin dapat terdeteksi pada daerah Uv dengan λ 200-400
nm.
Pada Gambar 1,2, dan 3 terlihat bahwa tidak ada gangguan di sekitar waktu
analisis levofloksasin. Kromatogram ekstrak plasma yang mengandung larutan
levofloksasin paten dan generik dapat dilihat pada Gambar 2 dan 3. Pada
kromatogram tampak puncak levofloksasin yang tajam pada waktu retensi 4,767 dan
4,800 menit, sedangkan kromatogram ekstrak plasma (Gambar 1) tidak menunjukkan
adanya puncak di sekitar waktu retensi levofloksasin. Hasil kromatogram
levofloksasin baik yang paten maupun generik menunjukkan waktu retensi yang
hampir sama dan pada daerah sekitar waktu retensi levofloksasin tidak ada gangguan.
Hasil perhitungan daya resolusi (Rs) diperoleh sebesar 3,43 dan 3,35. Apabila nilai
resolusi (Rs) sama dengan satu atau lebih besar dari satu maka pemisahan berlangsung
hampir sempurna (Snyder,et al., 1997). Hasil ini memperlihatkan bahwa metode
analisis yang digunakan cukup selektif untuk analisis levofloksasin.
Channel A
0.04 0.04
levofloksasin
blanko levofloksasin a.180707
Retention Time

0.02 0.02

V olts

V olts
2.392
1.483
0.00 0.00

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0
Minutes
Gambar 1. Kromatogram ekstrak plasma kosong (blangko).

Channel A
0.015 levofloksasin 0.015
recovery levofloksasin 5 mcr gr per ml.a.180707
Retention Time

0.010 0.010
Volts

Volts
0.005 0.005
1.500

4.767
0.000 0.000

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Minutes

Gambar 2. Kromatogram levofloksasin paten dalam plasma

0.02 Chan nel A 0.02


levofloksasin
recov ery levo floksas in 3 mc r gr pe r ml.b.180707
Retention Time
4.800
V olts

V olts
0.01 0.01
1.483

0.00 0.00

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Min utes

Gambar 3. Kromatogram levofloksasin generik dalam plasma

Pada penetapan kadar tablet levofloksasin paten dan generik dalam plasma
manusia secara in vitro dilakukan dengan menambahkan sebanyak 25 μL larutan
sampel ke dalam 475 μL plasma dan dilakukan replikasi sebanyak 6 X. Setelah

dilakukan perhitungan dengan taraf kepercayaan 95 % ( X ± SD ), maka hasil yang
diperoleh untuk kadar levofloksasin paten dan generik dalam plasma rata-rata berturut
– turut sebesar 3,24±0,12 µg/mL dan 3,18±0,26 µg/mL. Perolehan kembali
levofloksasin paten dan generik dalam plasma manusia diperoleh hasil berturut-turut
96,36±6,98% dan 95,75±15,80%. Ketelitian metode cukup baik ditunjukkan dengan
nilai Relative Standard Deviation (RSD) atau Koefisien Variasi (KV) sebesar 3,70
dan 8,36 % (Harmita, 2004). Dari hasil yang diperoleh maka dapat dikatakan bahwa
metode ini valid untuk penetapan kadar tablet levofloksasin paten dan generik dalam
plasma secara in vitro. Data uji penetapan kadar levofloksasin paten dan generik dapat
dilihat pada tabel 1.
Tabel. 1. Hasil penetapan kadar levofloksasin dalam plasma manusia
No Ulangan Levofloksasin Paten Levofloksasin Generik
Kadar % Perolehan Kadar % Perolehan
(µg/mL) kembali (µg/mL) Kembali
1 3,34 97,75 3,70 111,04
2 3,18 98,35 2,99 89,71
3 3,02 99,51 3,07 92,11
4 3,29 89,80 3,18 95,47
5 3,30 97,90 3,00 90,22
6 3,28 94,86 3,14 94,18
Rata-rata 3,24 96,36 3.18 96,75
Rata-rata ± 1,96 SD 3,24±0,12 96,36±6,98 3,18±0,26 95,75±15,80
RSD 3,70 3,70 8,36 8,45

SIMPULAN DAN SARAN


SIMPULAN
Dari hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa metode KCKT dengan detektor UV
yang digunakan dalam penelitian ini adalah spesifik dan sensitif serta dapat
diaplikasikan untuk penetapan kadar levofloksasin dalam plasma manusia secara in
vitro.

SARAN
1. Perlu dilanjutkan dengan penetapan kadar levofloksasin dalam darah secara in vivo
dengan metode yang sama
2. Perlu dicoba metode penetapan kadar levofloksasin dalam plasma menggunakan
metode spektrofotometri UV Vis.

DAFTAR PUSTAKA
Anonim, 1995, Farmakope Indonesi, Edisi IV, Departemen Kesehatan RI, Jakarta,
hal 1009, 1016
Chien, S.C., Wong, F.A., Fowler, C.L., Callery-D’Amico, S.V, Williams, R.R.,
Nayak, R & Chow, A.T., 1998, Double-Blind Evaluation of the Safety and
Pharmacokinetics of Multiple Oral Once-Daily 750-Milligram and 1-Gram
Doses of Levofloxacin in Healthy Volunteers, Antimicrob Agents and
Chemother, 42 (4), 885-888.
Clevelandclinic,2007. Specimen Collection, Handling and Transportation.
http://referencelab.clevelandclinic.org/spesimentcollection.htm.p.1.
Diakses tanggal 29 Juni 2007 pukul 11.00 WIB.
Darwish, I.A., Refaat, I.H., Askal, H.F., & Marzouq M.A., Generic Nonextractive
Spectrophotometric Method for Determination of 4-Quino-Naphthollone
Antibiotics by Formation of Ion-Pair Complexes with β-Naphthol, 2006,
Journal of AOAC International, 88 (2), 334-340.
El-Brashy, A.M., Metwally, M.E., & El-Sepai, F.A., 2004, Spectrophotometric
Determination of Some Fluoroquinolone Antibacterials through Charge-
transfer and Ion-pair Complexation Reaction, Bull.Korean Chem. Soc., 25
(3), 365-372
Harmita, 2004, Petunjuk Pelaksanaan Validasi Metode dan Cara Perhitungannya,
Majalah Ilmu Kefarmasian, 1 (3),117-134, Departemen Farmasi FMIPA,
Universitas Indonesia, Jakarta.
Harmita, Mansur U., dan Firnando, 2004, Metode Penetapan Kadar Meloxicam
Dalam Darah Manusia In Vitro Secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi,
Majalah Ilmu Kefarmasian, 1 (2), 79-92.
Lam,N.Y.L, Timoty,H.R,Rossa W.K, Chiu dan Y.M.Rennis L.2004. EDTA is a
betterantikoagilant than Heparin or Citrate for Delayed Bood Procesising
for plasma DNA analysis.http:// medical pharmacology.
Org/EDTA.HTM.P.1.
Ming, D.L., Lin, A.P., & Yang, Y.Q., 2006, Spectrofluorimetric Determination of
Certain Fluoroquinolone Through Charge Transfer Complex Formation,
Abstract, Taylor & Francis Publ.
Momani, I.F.A., 2006, Flow Injection Spectrophotometric Determination of the
Antibacterial Levofloxacin in Tablets and Human Urine, Abstract, Taylor
& Francis Publ.
Ocana, J.A., Callejon, M., & Barragan, F.J., 2000, Terbium-sesitized determination of
levofloxacin in tablets and human urine and serum, Analyst, 125, 1851-
1854.
Salem, H., 2005, Spectrofluorimetric, Atomic Absorpstion Spectrometric and
Spectrophotometric Determination of Some Fluoroquinolones, Am. J.
Appl. Sci., 2 (3), 719-729.
Sivasubramanian, L., Shankar, K., Sivaraman, V., Kumar, K.,S., Muthukumaran, A.,
& Raja, TK., 2004, Visible Spectrophotometric Determination of
Levofloxacin in tablet dosage forms, Indian Journal of Pharmaceutical
Sciences, 66, 799-802.
Snyder, L.R., Kirkland, J.J., dan Glajch, J.L., 1997, Practical HPLC Method
Development, 2nd edition, p 687-688, 690, 691, 695, John Wiley & Sons,
Inc., New York.
Tobin, C.M., Sunderland, J., White, L.O., & MacGowan, A.P., 1999, A Reverse
phase, Isocratic High Performance Liquid Chromatography Assay for
Levofloxacin, J. Antimicrob Chemother, 43, 434-435.