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PROTEINAS SERICAS
Objetivos
Determinación de proteínas totales por la reacción del biuret.
Determinación de albúmina por unión al colorante Verde de Bromocresol.
Realización e interpretación de una corrida electroforética en acetato de celulosa y valoración
cualitativa de las proteínas séricas.
ETAPA PREANALITICA
1) Muestra
La muestra de elección para la determinación de proteínas totales y proteinograma electroforético es
suero. Las proteínas totales del plasma son 0.3 g/dl mas que en suero por la presencia del fibrinógeno.
Para la determinación de albúmina se puede utilizar indistintamente suero u plasma.
Los sueros con lipemia y/o hemólisis moderada o severa (Hb >0.2 g/dl) no deben procesarse. Los
sueros con bilirrubina total inferior a 10 mg/dl pueden procesarse.
Conservación de la muestra
Las proteínas totales del suero son estables durante 1 semana a temperatura ambiente y 1 mes cuando
se refrigeran. A –20 ºC las proteínas duran 2 meses y la albúmina 2 años. Para realizar electroforesis
puede refrigerase el suero hasta 48 hs.
Hora de muestreo e ingesta reciente de alimentos
No se han observado variaciones diurnas en la concentración de proteínas séricas ni por ingesta
reciente de alimentos.
Estasis venoso
La elevación de PT y albúmina por estasis venoso dependen del grado y duración del mismo, mientras
que los porcentajes de la electroforesis no se alteran. Debe minimizarse el estasis venoso durante la
venopunción.
Cambios de postura
En los individuos normales la concentración de proteínas aumenta 8 a 10 % cuando pasan de la
posición acostada a la de pie. Estos cambios de concentración proteica debidos a cambios del agua
plasmática se producen en 15 minutos.
Ejercicio
En las horas siguientes al ejercicio intenso puede haber moderada deshidratación extracelular y con
ello, hemoconcentración que eleva la proteinemia. El efecto aumenta a mayor temperatura ambiente y
nivel de ejercicio. El aumento que se registra es de magnitud semejante a los cambios causados por la
postura y requiere 30 minutos para volver a los valores basales.
Uso de anticonceptivos y embarazo
El uso de anticonceptivos orales y el embarazo disminuyen la concentración sérica de proteínas totales,
principalmente debido a disminuciones de albúmina. Las fracciones proteicas 1, 2 y aumentan
ligeramente con el uso de anticonceptivos orales y vuelven a ser normales a las 12 semanas de cesar
dicho uso.
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Los estrógenos provocan descenso de la albuminemia por inhibición de su síntesis hepática. Las dosis
habituales de 25 ug/día usadas en mujeres posmenopáusicas causan solo leves descensos. Los
progestágenos no alteran la albuminemia.
La asparaginasa usada en hemopatías causa descensos de hasta 22% luego de 4 semanas.
La dapsona, un antileproso, tras tratamiento prolongado produce descensos de hasta 40% por aumento
del catabolismo de la albúmina.
Medicamentos hepatotóxicos en tratamientos prolongados causan descensos de albúmina por
disminución de su síntesis.
ETAPA ANALITICA
1) Metodología: Cuantificación de Proteínas Totales "METODO DEL BIURET"
FUNDAMENTO
El método se desarrolló a partir de la observación de que el biuret daba un complejo de color púrpura al
reaccionar con una solución alcalina regulada de sulfato de cobre. Las proteínas y algunas aminas
reaccionan de forma semejante. Los iones cobre forman un complejo de coordinación con cuatro grupos
-NH nucleofílicos, que en la reacción con las proteínas provienen de los enlaces peptídicos de los
aminoácidos. El complejo muestra máximos de absorción a 330 y 540 nm. La absorbancia
generalmente se mide a 540 nm, pues aunque es mayor la sensibilidad a 330 nm, es más fácil que se
presenten interferencias. La absorbancia medida a 540 nm es directamente proporcional a la
concentración de proteínas totales en la muestra.
El reactivo de biuret está formado por una solución alcalina de sulfato de cobre a la que se añade
tartrato sódico-potásico para evitar que precipiten los iones cúpricos en forma de hidróxido. A veces se
añade ioduro potásico para evitar la reducción espontánea de los iones cúpricos, aunque no suele ser
necesario cuando el sulfato de cobre es puro y se utilizan concentraciones adecuadas de tartrato.
TECNICA OPERATORIA
Muestra:
Suero libre de hemólisis
Material requerido:
Espectrofotómetro o Fotocolorímetro.
Micropipetas y pipetas capaces de medir los volúmenes indicados.
Tubos de ensayo.
Tubos de fotocolorimetro o cubetas espectrofotométricas.
Baño de agua a 37 °C.
Reloj o Timer.
Reactivos: Tiene diferencias según el fabricante
Reactivo Cuproalcalino: GT Lab Wiener Biosystems
Sulfato de Cobre 12 mM 13 mM 6 mM
Tartrato sódico-potásico 32 mM
Ioduro potásico 6 mM
Hidróxido sódico 250 mM 875mM 1150mM
El Rvo Wiener tiene EDTA y alquilarilpolieter de concentración no declarada.
El Rvo Biosystems tiene un detergente, sin especificar su composición y concentración.
El reactivo cuproalcalino debe conservarse a temperatura ambiente, en lugar fresco y al abrigo de la luz.
Es corrosivo.
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PROCEDIMIENTO
En tubos rotulados colocar:
Blanco Testigo Control Muestra
Testigo de PT 50 ul
Suero 50 ul 50 ul
Rvo. Cuproalcalino 2,5 ml 2,5 ml 2,5 ml 2,5 ml
Mezclar. Incubar en baño de agua a 37 °C por 15 minutos. Leer en espectrofotómetro a 540 nm o
fotocolorimetro a 520-560 nm llevando a cero con reactivo de trabajo. Color estable 2 horas.
Cálculos:
factor de cálculo = g/dl de PT del Testigo
Absorbancia del Testigo
TECNICA OPERATORIA
Muestra:
Suero o plasma libre de hemólisis e ictericia.
Material requerido:
Espectrofotómetro o fotocolorimetro.
Micropipetas y pipetas capaces de medir los volúmenes indicados.
Tubos de ensayo.
Reloj o timer
Reactivos:
Verde de Bromo Cresol (VBC) o bromocresolsulfonftaleina (BCF)
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La concentración de VBC varía mucho según el fabricante: Wiener (300 uM), GTLab (90 uM),
Biosystems (150 uM). La concentración recomendada para máxima linealidad es de 60 uM (Kaplan -
Pesce). Buffer: Succinato 75mM, pH = 3,9. Tensioactivo no iónico: polioxietilen lauril éter al 1 %. Cloruro
de sodio 0,8 M.
Este reactivo debe conservarse a temperatura ambiente, en lugar fresco y al abrigo de la luz.
PROCEDIMIENTO
Trabajar entre 15 y 28 ºC. Ajustar el espectrofotómetro a 625 nm o fotocolorímetro a 620-650 nm
llevando a cero con reactivo de trabajo.
En tubos rotulados colocar:
Blanco Testigo Control Muestra
Testigo de Albúmina 10 ul
Suero o plasma 10 ul 10 ul
Rvo. VBC 3,5 ml 3,5 ml 3,5 ml 3,5 ml
Mezclar por inversión suave. Leer dentro de los 15 a 30 segundos para evitar la interferencia positiva de
las demás proteínas plasmáticas. Por ejemplo la ceruloplasmina y el orosomucoide reaccionan con el
VBC a los 5 minutos.
Cálculos:
factor de cálculo = g/dl de Albúmina del Testigo
Absorbancia del Testigo
Método de referencia:
Ha sido propuesto el electroinmunoanálisis, el cual se basa en la migración de las proteínas del suero
por un campo eléctrico en un medio con agarosa conteniendo antialbúmina humana. La altura del pico
de precipitación es proporcional a la concentración de albúmina en el suero. Presenta elevada
especificidad y recuperación, y aceptable precisión. Otros métodos inmunoquímicos de alta
performance son: Inmunodifusión radial, Inmunoturbidimetría, Inmunonefelometría, Radioinmunoanálisis
y Enzimoinmunoanálisis. Todos ellos tienen la limitación del costo y la exigencia de alta calidad del
anticuerpo utilizado.
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El método con púrpura de bromocresol mostró mejor correlación con el electroinmunoanálisis que el
método con VBC.
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En la electroforesis se mantiene un pH constante, habitualmente con un buffer de pH 8,6. A este pH la
mayoría de las proteínas están cargadas negativamente en distinta magnitud según su punto
isoeléctrico y migran hacia el ánodo con diferente movilidad.
La fracción Albúmina es la que posee mayor movilidad, le siguen las fracciones alfa1, alfa2, beta y en la
zona de siembra la fracción gamma.
Efecto de la fuerza iónica: A mayor fuerza iónica, mayor competencia entre los iones y con ello
migración más lenta, dando bandas menos separadas pero más nítidas.
Efectos del potencial, la temperatura y el tiempo: A mayor potencial, mayor carga eléctrica y velocidad
de migración pero también mayor generación de calor. Si éste no se disipa adecuadamente, se puede
producir desnaturalización de las proteínas de la muestra. El calor puede controlarse reduciendo la
fuerza iónica del buffer o refrigerando la cámara de migración. A mayor tiempo de migración, mayor
separación de las bandas pero también mayor difusión radial de las proteínas y con ello, bandas menos
nítidas.
Efecto de los soportes: En la EF sobre papel, acetato de celulosa gelificado, o gel de agarosa la
separación de las proteínas séricas en 6 fracciones se realiza principalmente por las diferencias de
carga eléctrica neta (soportes clase I). En la EF sobre almidón o sobre gel de poliacrilamida, la
separación se realiza por las diferencias de carga, de tamaño y de forma, por lo cual tienen mayor poder
de resolución. Con almidón se obtienen 25 bandas y con poliacrilamida hasta 100 bandas (soportes
clase II).
A los fines de interpretar diferentes estados patológicos, es suficiente la EF sobre soportes clase I en la
gran mayoría de las veces.
TECNICA OPERATORIA
Es aplicable a suero, orina, y líquido cefalorraquídeo.
Muestra:
Suero libre de hemólisis. No utilizar plasma puesto que el Fibrinógeno presente en este último
interfiere en la interpretación del proteinograma electroforético.
Soporte:
Acetato de Celulosa gelificado. Conservar las tiras en solución de Metanol 40%. No dejar secar
al aire las tiras porque se pierden las dimensiones y las características del gel.
Material requerido:
Pinza (para cejas), tubos de ensayo y papel de filtro común.
Cuba y Fuente de poder para electroforesis de 60 a 160 V
Micropipeta, capilar o aplicador especifico para realizar la siembra de la muestra.
Espectrofotómetro.
Reactivos:
Buffers:
Aconsejable: Veronal Sódico (Dietilbarbiturato de Sodio 0.04M) 8,24 g/l, pH= 8.6
Alternativa: Veronal Sódico 10,30 g/l + Veronal ácido 1,34 g/l.
Soluciones Colorante y Decolorante:
Aconsejable: Colorante Amido Schwart 0,5 g en 45 ml de Metanol + 45 ml de Agua + 10 ml de Ácido
Acético.
Decolorante: 475 ml de Metanol + 475 ml de Agua + 50 ml de Ácido Acético.
Alternativa: Colorante Rojo Ponceau S 0,5 g en 100 ml de Ácido Tricloroacético 5%.
Decolorante: Ácido Acético 5%
Solución Eluyente:
Aconseiable: Ácido Acético 80 %.
Alternativa: Trabajar al 60 % con calentamiento posterior.
Deshidratante: Metanol puro.
Transparentador: 8,5 ml de Metanol + 1,4 ml de Ácido Acético + 0,1 ml de Glicerol.
PROCEDIMIENTO
Es esencial correr un suero normal junto con los desconocidos, para una adecuada interpretación de los
electroforetogramas.
1) Tomar las tiras siempre con una pinza y eliminar el exceso de metanol colocando las tiras entre dos
hojas de papel de filtro. Sumergirlas en el buffer durante 15 minutos (máximo una noche).
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2) Colocar el buffer en los compartimientos de la cuba.
3) Eliminar el exceso de buffer con papel absorbente, como se realizó en el paso 1. Extender las tiras
sobre el puente de la cuba con la superficie activa penetrable por las proteínas hacia arriba (es la
superficie más opaca, después de secar la tira entre hojas de papel de filtro, aunque también puede
reconocerse poniendo la tira con el ángulo achaflanado abajo y a la derecha). La tira debe quedar bien
tiesa y plana. Cuidar que los extremos de la tira se compriman firmemente contra los puentes de papel
de filtro utilizados para conseguir una perfecta transmisión de la corriente eléctrica. Conviene operar
rápidamente para evitar evaporaciones.
4) Utilizar Azul de Bromofenol como marcador de frente de corrida: Unos 5 ul de una solución alcohólica
del mismo se dejan secar sobre placas de plástico, se coloca una gota de suero sobre el colorante y se
mezcla con la punta del tip de la micropipeta.
5) Efectuar la siembra del suero (aproximadamente 3 a 5 ul) con capilar, micropipeta o sembrador,
dibujando una línea recta paralela al borde inferior (catódico) de la tira a 2 cm del mismo. Estos últimos
permiten hacer una siembra mas precisa.
6) Tapar la cuba cuidadosamente, obteniendo un buen cierre.
7) Efectuar la migración electroforética a un potencial entre 150 - 200 V ajustado para tener 1 mA por
cm de tira. Controlar la migración por el frente coloreado de albúmina, que es la más veloz.
8) Se deja el sistema en esas condiciones de 35 a 50 minutos.
9) Finalizar la corrida cuando el frente se acerque al borde anódico de la tira, desconectar el aparato,
sacar las tiras y sumergirlas en solución colorante 3 minutos.
10) Colocar luego las tiras en sucesivos baños de solución decolorante, agitando durante 10 minutos en
cada baño, hasta obtener una clara visualización de las fracciones proteicas con un fondo
perfectamente claro.
Por Densitometría (Técnica práctica para analizar muchas corridas por día, pero requiere un
densitómetro, aparato de elevado costo): Para realizar el registro densitométrico se debe
transparentar previamente la tira. Para ello, acabada la decoloración de la forma habitual, se
deben sumergir las tiras en metanol puro anhidro durante 5 minutos como mínimo en cubeta
seca, luego en solución transparentadora durante 10 minutos como mínimo. A continuación
colocar las tiras sobre una placa de vidrio cuidando que no queden burbujas de aire entre la tira
y el vidrio. Calentar la placa unos minutos colocándola bajo una lámpara de luz fuerte (100-
200V) a 5-10 cm de distancia, o en estufa a 60 - 70 ºC unos 10 minutos hasta transparencia
total. Conviene operar rápidamente con las tiras una vez que salen del baño transparentador
para evitar evaporaciones de la solución transparentadora. Luego invertir la placa sobre papel de
filtro y dejar enfriar durante unos 20 minutos como mínimo. Se puede seguidamente separar la
tira de la placa de vidrio, conservándola en sobre de plástico o entre papeles. Efectuar la lectura
con el densitómetro. Las tiras se conservan indefinidamente y se las puede cortar, pegar y
archivar.
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Valores e Intervalos de Referencia en suero sanguíneo:
En g/dl En % dentro de las proteínas
Fracción
Proteica Promedio Límites Promedio Límites
normales normales
Cada laboratorio debe obtener sus propios valores de referencia, o utilizar los obtenidos en otro
laboratorio de la misma cuidad, que atienda población de similar nivel socioeconómico y con la misma
metodología preanalítica y analítica.
BIBLIOGRAFIA
Gradwohl- Sonnerwirth- Jaret "Métodos y Diagnósticos del Laboratorio Clínico" 8ª Edición 1983.
Capítulos 9 y 12. Editorial Panamericana.
Pesce - Kaplan "Química Clínica. Métodos". Edición 1990. Capítulos 12 y 17. Editorial Panamericana.
Todd - Sanford "Diagnóstico clínico por el laboratorio” I. Davidson y J. B. Henry. Editorial Salvat.
Enrique E. Heer, Ricardo A. Margni y colaboradores. "Electro e Inmunoelectroforesis". Manual de
Laboratorio e Interpretaciones fundamentales. 1ª Edición 1971. Capitulo 1. Gumersindo Fernández
Editor Argentina.
Alfonso Balcells "La Clínica y el Laboratorio". 17ª Edición 1997. Parte 1. Capitulo 3. Editorial Masson S.
A. Barcelona (España).
D. J. Holme, H Peck. "Bioquímica Analítica". Edición 1983. Capitulo 3. Editorial ACRIBIA SA. Zaragoza
(España).
Facultad de Ciencias Bioquímicas. Universidad Nacional de Rosario. "Guía de Trabajos Prácticos".
Bioquímica Clínica Cuantitativa. Edición 1977. Servicio de Publicaciones de la Universidad Nacional de
Rosario. Argentina.