Laboratorio: Actividad enzimática en procesos de transformación
OBJETIVOS
 Medir la velocidad de reacción de la fosfatasa ácida extraída del germen de trigo bajo diferentes condiciones.
 Estimar los parámetros cinéticos Km y Vmáx a partir de los datos experimentales con y sin inhibición.
 Identificar factores experimentales que resultan críticos para la estimación de los parámetros cinéticos de la enzima.
INTRODUCCIÓN
Cinética enzimática
Las reacciones metabólicas conforman un cuerpo de
reacciones químicas que ocurren en condiciones muy
particulares y que son necesarias para que los seres
vivos cumplan con sus funciones biológicas. Estas
condiciones particulares en las que las reacciones
metabólicas deben darse son características de los
organismos, órganos, tejidos o células, y en ausencia de
un catalizador, no suelen permitir que se generen los
productos a la velocidad requerida. Ciertas proteínas han
evolucionado entonces como catalizadores biológicos
(enzimas) cuya función es aumentar la velocidad de las
reacciones químicas en los seres vivos. Es importante
recordar que este aumento en la velocidad de reacción
se logra mediante la disminución de la energía de
activación de los reactantes y que nada tiene que ver con
el cambio de energía libre que ocurre al convertirse los
reactantes en productos.
Las enzimas son generalmente, moléculas proteicas que
tienen la capacidad de catalizar reacciones químicas.
Debido a la naturaleza proteica, son inestables y pueden
ser desnaturalizadas por cambios en el medio. Como la
desnaturalización afecta las propiedades biológicas de
las proteínas, la actividad de las enzimas se afecta por
muchas variables como temperatura, pH, concentración
de sustrato y de enzima y la presencia de inhibidores.
Las condiciones óptimas varían de una enzima a otra.
En términos simples, la relación entre la velocidad de la
reacción y la concentración de sustrato (S, reactante) en
una reacción catalizada por una enzima (E) está dada
por la ecuación de Michaelis y Menten de acuerdo al
esquema siguiente:
𝑘+1 𝑘2
𝐸+𝑆 ← → 𝐸𝑆 → 𝐸+𝑃
𝑘−1
𝑘+1 , 𝑘−1 𝑦 𝑘2 : 𝑐𝑜𝑛𝑠𝑡𝑎𝑛𝑡𝑒𝑠 𝑑𝑒 𝑣𝑒𝑙𝑜𝑐𝑖𝑑𝑎𝑑
1
𝑉𝑚𝑎𝑥 [𝑆]
𝑣=
𝐾𝑚 + [𝑆]
Donde, en condiciones de estado estable
𝑣𝑒𝑙𝑜𝑐𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑑𝑒 𝑓𝑜𝑟𝑚𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒 𝐸 𝑆
= 𝑣𝑒𝑙𝑜𝑐𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑑𝑒 𝑑𝑒𝑠𝑐𝑜𝑚𝑝𝑜𝑠𝑖𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒 𝐸 𝑆
𝑉= velocidad de reacción a una determinada
concentración de sustrato
[𝑆] = concentración de sustrato
𝑉𝑚𝑎𝑥 = velocidad máxima alcanzable a la concentración
de enzima dada
𝐾𝑚 = constante de disociación aparente de E S = (k –1 +
k2) / k+1
Los valores de Km y Vmáx son útiles para caracterizar el
funcionamiento de una enzima con un sustrato
específico. El Km mantiene un relación inversa con la
afinidad de la enzima por el sustrato, y si se conoce la
concentración de la enzima, [E], la Vmax permite el cálculo
de la constante de catálisis de ésta (kcat = k2 = Vmax/ [E]).
La kcat es equivalente al número de reacciones que un
sitio activo de la enzima cataliza por unidad de tiempo. El
cociente kcat/Km toma en cuenta ambos parámetros para
estimar la eficiencia catalítica de la enzima, entendida
ésta como la frecuencia en que la enzima transformará el
sustrato en producto cada vez que se encuentre con él (a
mayor kcat [mayor velocidad] y menor Km [mayor afinidad],
mayor eficiencia).
En la práctica, los valores de Km y Vmax pueden estimarse
a partir de gráficas de funciones derivadas de la ecuación
de Michaelis y Menten. Una primera ecuación derivada
es la de Lineweaver y Burk:
1 𝐾𝑚 1 1
= × +
𝑣 𝑉𝑚𝑎𝑥 [𝑆] 𝑉𝑚𝑎𝑥
Graficando la inversa de las velocidades de reacción que
se obtienen experimentalmente (eje “y”) versus la inversa
de las concentraciones de sustrato respectivas (eje “x”),
se obtiene una recta cuya intersección con el eje “y” da la
inversa de Vmax y cuya pendiente es equivalente a
Km/Vmax.
Una ecuación derivada alternativa es la de Eadie y
Hofstee:
𝑣
𝑣 = −𝐾𝑚 × + 𝑉𝑚𝑎𝑥
[𝑆]
En este caso, graficando las velocidades de reacción que
se obtienen experimentalmente (eje “y”) versus el
cociente entre dicha velocidad y la concentración de
sustrato correspondiente (eje “x”), se obtiene una recta
cuya intersección con el eje “y” es directamente el valor
de Vmax y cuya pendiente es – Km.
Hay dos formas generales de seguir el curso de una
reacción enzimática: Medir la cantidad de sustrato que
“desaparece” o determinar la cantidad de producto
formado.
Las fosfatasas ácidas y alcalinas son un grupo de
enzimas de amplia distribución en la naturaleza. Su
especificidad también es amplia, aunque se presentan
algunas diferencias de acuerdo con el origen de las
enzimas. Todas actúan sobre monoésteres de ácido
ortofosfórico, tanto alifáticos (glicerol–1–fosfato y
glicerol–2–fosfato) como aromáticos (4–fenilofosfato). No
actúan sobre diésteres o triésteres de fosfato. La
fosfatasa alcalina purificada de diversas fuentes también
puede hidrolizar fosfocreatina, fosfato inorgánico y
polifosfatos como el ATP.
Recibe el nombre sistemático de monoéster ortofosfórico
fosfohidrolasa y la reacción general que cataliza se
presenta así:
𝑓𝑜𝑠𝑓𝑎𝑡𝑎𝑠𝑎
𝑚𝑜𝑛𝑜é𝑠𝑡𝑒𝑟 𝑜𝑟𝑡𝑜𝑓𝑜𝑠𝑓ó𝑟𝑖𝑐𝑜 + 𝐻2 𝑂 → 𝑎𝑙𝑐𝑜ℎ𝑜𝑙 + 𝑜𝑟𝑡𝑜𝑓𝑜𝑠𝑓𝑎𝑡𝑜
Las fosfatasas son específicas para el fosfato de la
molécula, de manera que la ruptura ocurre cerca del
átomo de fósforo.
𝐶−𝑂 ↭ 𝑃
Entonces el primer requerimiento para estudiar una
enzima es disponer de un método cuantitativo
conveniente para medir su actividad. Para la fosfatasa
2
ácida, objeto de esta práctica, la determinación de la
actividad se fundamenta en la cuantificación del fosfato
liberado, lo cual se hace por el método de Fiske-
Subbarow:
𝑃𝑂4 −3 + á𝑐𝑖𝑑𝑜 𝑚𝑜𝑙í𝑏𝑑𝑖𝑐𝑜 → á𝑐𝑖𝑑𝑜 𝑓𝑜𝑠𝑓𝑜𝑚𝑜𝑙í𝑏𝑑𝑖𝑐𝑜
Á𝑐𝑖𝑑𝑜 𝑓𝑜𝑠𝑓𝑜𝑚𝑜𝑙í𝑏𝑑𝑖𝑐𝑜 + á𝑐𝑖𝑑𝑜 𝑎𝑠𝑐ó𝑟𝑏𝑖𝑐𝑜 → ó𝑥𝑖𝑑𝑜𝑠 𝑑𝑒 𝑚𝑜𝑙𝑖𝑏𝑑𝑒𝑛𝑜
Este es un método colorimétrico, basado en la reacción
del fosfato con ácido molíbdico para obtener ácido
fosfomolíbdico. Posteriormente, éste reacciona como un
reductor en medio alcalino (ácido ascórbico), formando
una mezcla de óxidos de molibdeno, de color azul.
La velocidad inicial de una reacción enzimática depende
de los siguientes factores:
Concentración de sustrato
Para una cantidad fija de enzima, la velocidad de
reacción aumenta cuando se incrementa la
concentración de sustrato. Hasta alcanzar un valor límite
cuando la velocidad ya no aumenta más. En esta
condición, la enzima se encuentra saturada con el
sustrato y se ha llegado a la velocidad máxima.
Concentración de enzima
En presencia de un exceso de sustrato, la velocidad de
reacción es proporcional a la concentración de enzima.
Algunas enzimas son inhibidas por los productos de la
reacción.
pH
La concentración de protones en el medio influye en la
actividad de las enzimas, ya que se afectan los grupos
ionizables en la enzima y en el sustrato (si los hay).
Generalmente las enzimas son activas en un rango
limitado de pH. El valor que permite lograr la mayor
velocidad, se conoce como pH óptimo. Se debe tener en
cuenta que este valor puede variar con la temperatura, el
buffer usado y la presencia de activadores o inhibidores.
Temperatura
Las reacciones enzimáticas se afectan por el calor como
se afecta en general cualquier reacción química. Es
decir, un aumento en la temperatura se refleja en
aumento en la velocidad de reacción. No obstante, la
naturaleza proteica de las enzimas hace que éstas sufran
desnaturalización a altas temperaturas, lo que conlleva
pérdida de la actividad y por lo tanto disminución en la
velocidad de reacción.
La temperatura óptima es la resultante de estos dos
efectos, y es la temperatura que permite lograr la máxima
velocidad. La temperatura óptima puede variar con el
tiempo de reacción. Si la incubación es de unos pocos
segundos, la temperatura óptima puede ser tan alta como
60 o 70°C.
Productos de la reacción
La acumulación de productos puede retardar la actividad
de algunas enzimas. Esto puede deberse a combinación
del producto con el sitio activo se la enzima, impidiéndole
combinarse con el sustrato, o puede deberse a que se
promueve la reacción inversa, con disminución en la
velocidad global de reacción.
Medida de la velocidad de reacción
Las curvas de progreso de la mayoría de las reacciones
enzimáticas muestran una caída de velocidad con el
tiempo. Esto puede obedecer a varias causas, por
ejemplo los productos de la reacción pueden inhibir la
enzima, el grado de saturación de la enzima con el
sustrato puede disminuir a medida que la reacción
trascurre, porque disminuye la concentración de sustrato,
la reacción inversa puede volverse más importante a
medida que la concentración de productos aumenta, la
enzima (o la coenzima) puede sufrir alguna inactivación
a la temperatura o un pH de reacción debido a
inestabilidad. Varias de estas causas pueden operar al
mismo tiempo.
Por estas razones, en el estudio de la actividad
enzimática se emplean medidas de velocidad inicial, ya
que solamente al inicio de la reacción, cuando las causas
mencionadas anteriormente no han tenido tiempo de
operar, se conocen con exactitud las condiciones. Para
obtener la velocidad de la reacción y dibujar la tangente
en el origen. Usualmente las curvas son prácticamente
líneas rectas siempre que la cantidad de cambio no
exceda el 20% de total. La cantidad de sustrato
transformado en un período de tiempo desde el
comienzo de la reacción, es una medida de la velocidad
solo si este límite no se sobrepasa.
Aislamiento de las enzimas
Las enzimas se encuentran en la naturaleza en mezclas
complejas, usualmente en las células, que contienen
cientos de enzimas diferentes. Para estudiar
adecuadamente las propiedades y el comportamiento de
una enzima, debe estar pura. Sin embargo, en algunos
casos es posible, mediante el uso de técnicas muy
específicas, estudiar una enzima aunque esté impura.
Elegido el método para medir la actividad, es importante
investigar cuáles son las fuentes más abundantes de la
enzima, a menos que haya razones para utilizar una
fuente específica.
3
Seleccionado el material de partida, es necesario obtener
la enzima en solución. Para este propósito usualmente
se debe romper la membrana celular, lo cual se puede
lograr por métodos químicos (detergentes, solventes),
enzimáticos (lisozima), físicos (ultrasonido) o mecánicos
(homogenizador o moler con arena). El extracto se puede
preparar con agua, solución salina o con un buffer. El
extracto crudo contiene la enzima y numerosas otras
sustancias de alto y bajo peso molecular. Las moléculas
pequeñas se pueden remover por diálisis o por filtración
por gel, dejando en solución las moléculas grandes que
son predominantemente proteínas, aunque también
pueden estar presentes en algunos polisacáridos.
Los procesos de purificación consisten en una serie de
fraccionamientos por medio de los cuales la enzima se
separa de las otras proteínas presentes. La purificación
se fundamenta en las diferencias en solubilidad, tamaño,
carga y actividad biológica de las proteínas. En esta
práctica se trabajará con un extracto crudo de fosfatasa
alcalina. (El tema de la purificación de proteínas es objeto
de otra práctica de laboratorio).
La actividad de las enzimas se expresa en unidades de
actividad, que se definen como micromoles de sustrato
transformados por minuto (a las condiciones del ensayo).
En los procesos de purificación es usual emplear como
referencia la actividad específica, que se define como
unidades de actividad por miligramo de proteína. A
medida que aumenta la pureza de la enzima, debe
aumentar la actividad específica.
MATERIALES Y REACTIVOS
 10g Germen de trigo
 5 Vasos de precipitados
 Pipetas
 Centrífuga
 11 Tubos de ensayo
 Vortex
 Colorímetro
 pH-metro
 Gradillas
PROCEDIMIENTO
Extracción de la fosfatasa ácida
Pesar 10 gramos de germen de trigo y agregar 50 ml de
agua fría. Luego agitar la mezcla hasta que obtener una
suspensión uniforme. Dejar en reposo por 30 min,
decantar por 15 min y filtrar el sobrenadante a través de
algodón, los residuos se descartan. Esta solución
constituye el extracto crudo de fosfatasa ácida. pueden tener baja actividad. Adicionalmente, las enzimas
(Mantener en hielo). en extractos crudos o purificados, pueden perder
actividad durante el almacenamiento. Por tanto es
Preparación de curva de calibración de fosfato necesario determinar el tiempo de reacción conveniente
inorgánico para obtener una cantidad de fosfato tal que, por
Realizar las siguientes soluciones, de acuerdo a como se colorimetría, se obtengan valores de %T entre 20 y 80
muestra en la tabla 1. (absorbancias entre 0.1 y 1) y adicionalmente
correspondan a la parte recta de la curva de progreso de
Tabla 1: Volúmenes de reactivos utilizados en la preparación de la la reacción.
curva de calibración
Patrón de
Agua Ácido molíbdico Prepare la siguiente mezcla de reacción:
Tubo fosfato mg/ml
(ml) (ml)
(ml) Tabla 3: Volúmenes de reactivos para prueba de tiempo óptimo
B – 4.0 0.5 Buffer
β-glicero Extracto
citráto 0.1 Agua
1 0.1 3.9 0.5 Tubo
M de pH 5.3
fosfato de
(ml)
enzimático
sodio (ml) (ml)
2 0.2 3.8 0.5

Mezcle bien los tubos y agregue

(ml)
Blanco buffer
3 0.3 3.7 0.5 (BB) 5.6 – 2.4 –

a continuación
4 0.4 3.6 0.5
Blanco sustrato
5 0.5 3.5 0.5 (BS) 5.6 1.6 0.8 –
Blanco enzima
Agitar bien los tubos y dejar en reposo durante 3 minutos. (BE) 5.6 – 1.6 0.8
Posteriormente adicionar 0.5 ml de la solución de ácido
Tiempo
ascórbico a cada tubo. reacción (TR) 5.6 1.6 – 0.8
Agitar las soluciones de los tubos y dejar en reposo
durante 10 minutos para que se desarrollara el color. Agitar bien e incubar a temperatura ambiente; el blanco
Determinar absorbancia a 660 nm. de buffer (BB) y el blanco de sustrato (BS) se dejan
reaccionar 30 minutos. Pasado este tiempo se toman
A.1 Procedimiento para determinación de cantidad de alícuotas de 1 ml y se reciben sobre ácido tricloroacético
fosfato producido por acción de fosfatasa acida al 10% tanto de BB como de BS.
Nota: En todos los casos la mezcla de reacción se
Adicionalmente, durante los 30 minutos que se
prepara como se indica a continuación, agregando los
mantienen en incubación BB y BS, tomar muestras de 1
reactivos en el orden mostrado:
ml de BE y TR a los 2, 5, 10, 15, 20 y 30 minutos. Dichas
Tabla 2: Volúmenes de sustancias utilizadas en mezcla de reacción alícuotas se reciben en tubos que contienen 1 ml de
para determinación de fosfato ácido tricloroacético al 10%. Agitar y centrifugar a 4000
Sobrenadante de la reacción rpm durante 3 minutos.
0.5 ml
enzimática
Agua destilada 3.5 ml Determine en el sobrenadante la cantidad de fosfato
Ácido molíbdico 0.5 ml producido, ajustando el 100% de T (cero en ABS) con el
tubo BB y siguiendo el procedimiento A1.
Agitar bien y dejar en reposo por 3 minutos; después se -----------------------------------------------------------------------------
adicionaron 0.5 ml de ácido ascórbico. Agitar bien, dejar NOTA: DE AQUÍ EN ADELANTE DEBEN PARAR LA
en reposo por 10 minutos y leer absorbancia a 660nm. REACCIÓN EN CADA TUBO A LOS 10 MINUTOS DE
Dichos valores de absorbancia, se emplean en la curva ADICIONADA LA ENZIMA, ES DECIR CADA TUBO DE
de calibración preparada con el fin de determinar la CADA ENSAYO DEBER TENER SIEMPRE 10 MIN DE
cantidad de fosfato. REACCIÓN CON LA ENZIMA POR LO QUE SE DEBE
ADICIONAR EL ACIDO TRICLOROACETICO PARA
A. Determinación del tiempo óptimo de incubación PARAR LA REACCIÓN CON EL MISMO INTERVALO
Los extractos enzimáticos tienen actividades variables, DE TIEMPO QUE SE ADICIONA LA ENZIMA
algunos pueden resultar muy activos mientras que otros
4
B. Efecto del pH, Determinación del pH óptimo 37 Termostato
Sustrato: Solución de β-glicerofosfato de sodio 0.1 M 60 Termostato
Buffer: Soluciones de buffer de citrato 0.1 M, diferentes 98 Agua en ebullición
pHs
Enzima: Extracto enzimático crudo Tabla 6: Volúmenes de reactivos utilizados en prueba de temperatura
óptima
Tiempo de reacción: 10 minutos Tubo BB BS BE 1 2 3 4 5
Buffer (ml) 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4
Tabla 4: Volúmenes de reactivos utilizados en prueba de pH óptimo
Sustrato (ml) – 0.4 – 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4
Tubo BB BS BE 1 2 3 4 5 6
Sustrato Agua (ml) 0.6 0.2 0.4 – – – – –
– 0.4 – 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 Temperatura
(ml) 18 18 18 0 18 37 60 92
°C
Buffer
2.0 1.6 1.8 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4
(ml)
pH del Mezclar bien y enseguida agregar la enzima, a intervalos
5.3 5.3 5.3 3.0 4.0 5.0 5.3 5.6 6.2
buffer de 30 segundos, es decir, pasados 30 segundos de
agregar la enzima al primer tubo, se le agregan al
Mezclar bien y enseguida agregar la enzima, a intervalos segundo y así hasta completar los tubos, de la siguiente
de 30 segundos, es decir, pasados 30 segundos de forma:
agregar la enzima al primer tubo, se le agregan al
segundo y así hasta completar los tubos, de la siguiente Enzima
– – 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
forma: (ml)

Enzima Agitar y dejar en incubación durante 10 minutos

– – 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
(ml) exactamente. Al final adicionar a todos los tubos 2 ml de
ATA al 10% y se centrifugar a 4000 rpm durante 3
Mezclar el contenido de cada tubo y dejar incubando a minutos. (Tener en cuenta la misma recomendación
temperatura ambiente durante 10 minutos. Es importante hecha en el procedimiento de pH para los 10 minutos)
que los 10 minutos se le cuenten a cada tubo, es decir,
después de agregada la enzima al tubo, se empiezan a El precipitado se descarta y en el sobrenadante de todos
contar los 10 minutos y pasado este tiempo, se le los tubos se determina la concentración de fosfato
agregan 2 ml de ATA10% a cada tubo. Mezclar y inorgánico, por medio del procedimiento A1.
centrifugar a 4000 rpm durante 3 minutos.
D. Efecto de la concentración de la enzima en la
El precipitado se descarta y en el sobrenadante de todos velocidad de reacción
los tubos se determina la concentración de fosfato
inorgánico, por medio del procedimiento A1.
Buffer: Solución de buffer de citrato, 0.1 M, pH 5.3
C. Efecto de la temperatura, Determinación de la Sustrato: Solución de -glicerofosfato de sodio 0.1 M
Enzima: Extracto enzimático crudo
temperatura óptima Tiempo de reacción: 10 minutos
Temperatura: temperatura ambiente
Buffer: Solución de buffer de citrato, 0.1 M, pH 5.3
Sustrato: Solución de -glicerofosfato de sodio 0.1 M Tabla 7: Volúmenes de reactivos utilizados en la determinación del
Enzima: Extracto enzimático crudo efecto de la concentración de la enzima
Tubo BB BS BE 1 2 3 4 5
Tiempo de reacción: 10 minutos Buffer (ml) 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2
Temperatura: Se hará la incubación a diferentes Sustrato
– 0.4 – 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4
temperaturas como se muestra a continuación: (ml)
Agua (ml) 0.8 0.4 0.75 0.35 0.30 0.25 0.10 –
Tabla 5: Temperaturas utilizadas en determinación de temperatura
óptima Mezclar bien y enseguida agregar la enzima, a intervalos
Temperatura, °C Medio de 30 segundos, es decir, pasados 30 segundos de
0 Agua – Hielo agregar la enzima al primer tubo, se le agregan al
18 Temperatura ambiente

5
 segundo y así hasta completar los tubos, de la siguiente Enzima
forma: (ml)
– – 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2

Enzima (µl) – – 50 50
Agitar y dejar en incubación durante 10 minutos
exactamente. Al final adicionar a todos los tubos 2 ml de
ATA al 10% y se centrifugar a 4000 rpm durante 3
minutos. (Tener en cuenta la misma recomendación
hecha en el procedimiento de pH para los 10 minutos)
100 150 300 400 Agitar y dejar en incubación durante 10 minutos
exactamente. Al final adicionar a todos los tubos 2 ml de
ATA al 10% y se centrifugar a 4000 rpm durante 3
minutos. (Tener en cuenta la misma recomendación
hecha en el procedimiento de pH para los 10 minutos)
El precipitado se descarta y en el sobrenadante de todos
los tubos se determina la concentración de fosfato
inorgánico, por medio del procedimiento A1.

El precipitado se descarta y en el sobrenadante de todos F. Efecto de la presencia de un inhibidor en la

los tubos se determina la concentración de fosfato velocidad de reacción
inorgánico, por medio del procedimiento A1.
Buffer: Solución de buffer de citrato, 0.1 M, pH 5.3
E. Efecto de la concentración de sustrato,
Sustrato: Solución de –glicerofosfato de sodio de
determinación de la constante de Michaelis (Km) diversas concentraciones en el rango 5–100 mM.
Enzima: Extracto enzimático crudo
Buffer: Solución de buffer de citrato, 0.1 M, pH 5.3 Tiempo de reacción: 10 minutos
Sustrato: Solución de -glicerofosfato de sodio de Temperatura: temperatura ambiente
diversas concentraciones en el rango 5 – 100 mM. Inhibidor: HgCl2 5 mg/ml
Enzima: Extracto enzimático crudo
Tiempo de reacción: 10 minutos Tabla 9: Volúmenes de reactivos para la determinación del efecto de la
Temperatura: temperatura ambiente concentración del sustrato con inhibidor en la velocidad de reacción
Tubo

BB BS BE 1 2 3 4 5 6 7 8
Tabla 8: Volúmenes de reactivos para la determinación del efecto de la
concentración del sustrato en la velocidad de reacción
Buffer (ml)
Tubo

BB BS BE 1 2 3 4 5 6 7 8 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2
Buffer (ml)

Sustrato a
adicionar*

1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4
(ml)

– 0.4 – 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.8

Sustrato a
adicionar*

concen*
[ S ] mM
(ml)

– 0.4 – 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.8 – 5 – 5 10 20 40 60 80 100 100
Agua (ml)
concen*
[S} mM

– 5 – 5 10 20 40 60 80 100 100 1.2 0.6 0.8 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 –
Inhibidor
Agua
(ml)

1.0 0.6 0.8 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 –
(ml)

– 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2

*Es el volumen a adicionar del recipiente de la *Es el volumen a adicionar del recipiente de la
correspondiente concentración (esas dos filas de la tabla correspondiente concentración (esas dos filas de la tabla
se deben mirar en conjunto)
se deben mirar en conjunto)
Mezclar bien y enseguida agregar la enzima, a intervalos Mezclar bien y enseguida agregar la enzima, a intervalos
de 30 segundos, es decir, pasados 30 segundos de de 30 segundos, es decir, pasados 30 segundos de
agregar la enzima al primer tubo, se le agregan al agregar la enzima al primer tubo, se le agregan al
segundo y así hasta completar los tubos, de la siguiente segundo y así hasta completar los tubos, de la siguiente
forma: forma:

6
Enzima
ácido sulfúrico 10 N y complete el volumen a 100 ml
(ml)
– – 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
con agua.
2. Solución patrón de fosfato, (recién preparada). Diluya
2 ml de la solución stock, hasta 10 ml con agua.
Agitar y dejar en incubación durante 10 minutos 3. Solución de ácido molíbdico (requerido por práctica
exactamente. Al final adicionar a todos los tubos 2 ml de 35 ml), Agregue 84 ml de H2SO4 concentrado (grado
ATA al 10% y se centrifugar a 4000 rpm durante 3 analitico, libre de fosfatos y silicatos) sobre 300 ml
minutos. (Tener en cuenta la misma recomendación de agua, agite y enfríe. Aparte disuelva 25 g de
hecha en el procedimiento de pH para los 10 minutos) molibdato de amonio en agua, luego mezcle las 2
soluciones y complete a un litro con agua. Es
El precipitado se descarta y en el sobrenadante de todos importante verificar que los reactivos estén libres de
los tubos se determina la concentración de fosfato fosfatos.
inorgánico, por medio del procedimiento A1. 4. Solución de ácido ascórbico, 1.5 mg/ml (recién
preparada).
5. Solución de ácido tricloroacético (ATA), 10%
6. Solución de β–glicerofosfato de sodio, 0.1 M
7. Soluciones de β–glicerofosfato de sodio, de diversas
concentraciones según la siguiente Tabla:

Concentración,  Agua, ml
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procedure and stability characteristics. The journal of
biological chemistry: 224:621-635 1957
8. Solución de ácido cítrico 0.1 M. Prepare 250 ml.
Pese 4.8 g y disuélvalos en agua, complete a 250 ml
en balón aforado
9. Soluciones buffer: La solución de ácido cítrico 0.1 M
tiene un pH inicial 2.25. A partir de ella, mida
volúmenes de 20 ml en vasos de precipitados y
ajuste el pH a 3.4, 5.0, 5.6 y 6.2 mediante la adición
de NaOH. A los 150 ml restantes, ajuste el pH a 5.3
de la misma manera.
10. Solución de inhibidor HgCl2 20 mM. Prepare 5 ml.
Pese 25 mg y disuélvalos en 5 ml de agua.
Corregido por: Diana Ximena Hurtado Varela
Jorge Cortázar

ANEXOS
1. Solución stock de fosfato. Pese 87.9 mg de KH2PO4
(RA), disuelva en 75 ml de agua, agregue 1 ml de
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