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Biologie Cellulaire et Moléculaire

 Les méthodes d'étude de la cellule


 Organisation et Fonctions des membranes biologiques
 Le cytosquelette et la motilité cellulaire

Les méthodes d’étude de la cellule


I. Les techniques microscopiques
A. La microscopie photonique
1. Généralités
a. Définition : examen d’objets agrandis en présence de photons
(UV & visible)
b. Domaines d’application : jusqu’à 0.2 µm
2. Le microscope à fond clair
a. Description
1. Partie mécanique
 Statif
 Tube binoculaire
 Tube porte objectif
2. Partie optique
 Source lumineuse
 Système condenseur – diaphragme
 Objectifs 4x/10x/40x/100x
 Oculaires 10x/…
b. Principe de formation de l’image
1. Objectif à image agrandie inversée réelle
2. Oculaire à image intermédiaire agrandie inversée virtuelle
c. Caractéristiques essentielles du microscope
1. Ouverture numérique : ON = n . sin a
2. Limite de séparation :

3. Pouvoir de résolution : 1/d


4. Grossissement : G = g1 . g2
d. Applications
1. Histologie
2. Hématologie
3. Parasitologie
4. Bactériologie
3. Le microscope à fond noir
a. Principe
1. Eclairage par un condenseur à fond noir
2. Aucune lumière ne pénètre dans l’objectif
3. Observations des contours de la cellule par diffraction
b. Applications
1. Bactériologie
4. Le microscope à contraste de phase
a. Principe
1. Objectif avec anneau de phase intégré
2. Modification de la phase des rayons lumineux à variation
d’intensité lumineuse
b. Applications
1. Observation de cellules vivantes
5. Le microscope à fluorescence
a. Principe de la fluorescence
1. C’est l’émission de lumière suite à l’absorption de photons
2. E = h . n = h . c/lَ l2 > l1
3. Différents types de fluorescence
 Primaire : produite naturellement par certaines
substances biologiques (ex : chlorophylle)
 Secondaire : obtenue artificiellement en liant un
composé non fluorescent avec un composé
fluorescent (fluorochromes)
b. Les microscopes à fluorescence
1. A lumière transmise
2. A lumière réfléchie (épifluorescence)
c. Applications
1. Bactériologie (cytométrie sur filtre)
2. Immunofluorescence
6. Le microscope confocal
a. Principe
1. Ce microscope permet de collecter l’image réfléchie au
niveau d’un plan focal et d’éliminer les images du dessus
(dessous) de ce plan par balayage laser
b. Applications
1. Neurobiologie
7. Préparation des échantillons en microscopie optique

B. La microsopie électronique
1. Le microscope électronique à transmission
a. Principe
1. On diminue la limite de séparation en diminuant la longueur
d’onde d’excitation à utilisation des électrons à la place des
photons
b. Caractéristiques
1. d = 1 nm
2. G = de 1400x à 500 000x
c. Description
1. Canon à électrodes
2. Accélérateur d’électrons
3. Lentille électromagnétique
4. Ecran fluorescent de visualisation
2. Le microscope électronique à balayage
a. Principe
1. Les cellules sont traitées par des sels de métaux lourds
2. Les électrons émis par la cathode vont balayer la surface de
la cellule
b. Caractéristiques
1. d = 10 nm
2. G = 20 000x
c. Applications
1. Biologie cellulaire
3. Préparation des échantillons
a. Coloration positive
1. Fixation chimique
2. Déshydratation
3. Inclusion dans la résine
4. Coupes de 50 à 100 nm
5. Dépôt de sels de métaux lourds à augmentation du contraste
b. Coloration négative
1. Les sels de métaux lourds se déposent après évaporation de
l’eau autour des particules
c. Ombrage de particules & réplication de surface
1. Réalisation de répliques quand la surface est trop épaisse
pour être traversée par les électrons
d. Cryodécapage & cryofracture
1. Cryofracture
 Congélation des organites dans l’azote liquide
 Fracture du bloc
 Réplication par ombrage
2. Cryodécapage
 Congélation ultra rapide
 Fracture de l’échantillon
 Sublmation de l’eau sous vide
 Réplication
II. Les techniques de fractionnement des constituants cellulaires
B. Préparation de l’homogénat cellulaire
1. Méthodes permettant la rupture de la membrane plasmique
a. Mécanique : broyage
b. Choc osmotique
c. Congélations décongélations successives
d. Ultra-sons
e. Attaque enzymatique
2. Précautions à respecter pour obtenir un bon homogénat
a. Liquide isotonique
b. Basse température
c. En présence d’agents réducteurs
d. PH neutre
C. La séparation des organites
1. Par centrifugation différentielle
a. Augmentation de la vitesse et du temps
2. Par centrifugation en gradient de densité (ultracentrifugation)
a. Principe : séparation des organites en fonction de leur constante
de sédimentation, fonction de leur masse molaire
1. Séparation en solution de saccharose de 5 à 20 %
2. Dépôt des organites en surface
3. Centrifugation : arrêt de la migration quand les organites
rencontrent une couche de saccharose de densité supérieure à
la leur
4. Séparation des organites en fractions ( = aliquotes)
D. Suivi de la séparation des fractions
1. Utilisation de marqueurs moléculaires des organites
a. Ce sont des enzymes caractéristiques de ces organites
b. On peut aussi évaluer la purification par microscopie
E. Applications
1. Utilisation de systèmes cellulaires
a. Ex : synthèses protéiques in vitro
III. Techniques de marquage cellulaire
. Techniques cytochimiques et immunocytochimiques ; techniques
cytoenzymologiques
1. Techniques cytochimiques
a. Mise en évidence d’un composé chimique de la cellule au
microscope optique/électronique
2. Techniques immunocytochimiques
a. En microscopie optique
b. En microscopie électronique
3. Techniques cytoenzymologiques
a. Mise en évidence dans une cellule de protéines à activité
enzymatique
A. Techniques de marquage isotopique
1. Principaux isotopes utilisés en biologie
a. X(A, Z) : A différent, Z identique
b. Isotopes non radioactifs : 15N
c. Isotopes radioactifs : a, b, g
d. 3H ; 14C ; 131I ; 32P ; 35S

e. Dosage de la radioactivité dans un compteur à scintillation


2. Détection qualitative de la radioactivité ; localisation de molécules
radioactives dans la cellule par autoradiographie
a. " pulse chase "
1. On place une coupe de tissus dans un milieu nutritif
contenant de la Leu radioactive
2. L’acide aminé est incorporé dans la protéine
3. Coupes de tissus dans un milieu contenant de la Leu froide.
4. On peut donc observer le déplacement de la Leu dans la
cellule
b. Localisation : autoradiographie
1. On recouvre la coupe cellulaire d’une émulsion photo
2. Les rayons ionisants ont dégagés
3. Apparition de grains d’argent précipités

Organisation et Fonctions des


Membranes biologiques
Comparaison Procaryote Eucaryote
Taille 1 à 10 µm 10 à 100 µm
Organismes Eubactéries Champignons

Archéobactéries Plantes

Animaux
Forme d’organisation Unicellulaire Uni ou pluricellulaire
Organites, Absent Présent, complexe,
compartimentation spécialisé
cellulaire
ADN Petit, circulaire, sans Grand, dans le noyau
introns cellulaire, nombreux introns
ARN : synthèse et Simple : dans le cytoplasme Complexe : dans le noyau
maturation cellulaire
Protéines : synthèse et Simple : couplée à la Complexe : dans le
maturation synthèse de l’ARN cytoplasme et le réticulum
endoplasmique rugueux
Métabolisme Anaérobie ou aérobie Surtout aérobie

Grande capacité
d’adaptation
Endo/exocytose Non oui

I. Aspects structuraux et fonctionnels de la membrane plasmique


A. Aspects structuraux
1. Définition
a. C’est une enveloppe qui sépare le cytoplasme du milieu
extérieur
2. Isolement des membranes
a. Cas de la membrane du globule rouge
b. Cas d’une cellule hépatique
1. Plus difficile à cause des organites
2. Centrifugation 60 min à 100 000 G
3. Composition biochimique des membranes
a. Généralités
1. Lipides +++
2. Protéines +++
3. Oses à glycolipides & glycoprotéines

Composé Lipide membranaire Protéine membranaire


Rôle Structural Fonctionnel varié
* antigène de surface

* récepteur des hormones

* canaux ioniques

* transporteurs

* enzymes
Caractères Molécules amphiphiles Essentiellement des glycoprotéines, oses fixés
côté extracellulaire
Catégories Glycérophospholipides Périphériques

Sphingolipides Intégrées (se fixent dans la couche lipidique


grâce à des interactions hydrophobes)
Cholestérol (règne
animal) * Transmembranaires

Phytostérol (règne * Partielles


végétal)

b. Architecture moléculaire de la membrane plasmique


1. Généralités
 Epaisseur : 5 nm
 Double couche lipidique avec des protéines fixées à
l’intérieur (mosaïque)
 Les molécules peuvent se déplacer dans le plan
latéral
2. Modèle de la mosaïque
3. Arguments en faveur de la mosaïque fluide
4. Propriétés de la membrane plasmique
 Fluidité
 Lipides par diffusion latérale et transversale
 Protéines par diffusion latérale uniquement
 Polarité : répartition asymétrique
c. Structures additionnelles liées à la membrane plasmique
1. Chez la cellule animale : superposition à la membrane
plasmique du glycolemne
 Définition : association d’oses présents au niveau
des glycolipides et des glycoprotéines membranaires
avec des glycoprotéines associées sur la membrane
 Rôle
 Protection des muqueuses contre l’acidité
 Présence d’enzymes intestinaux
2. Chez la cellule végétale : membrane squelettique de la paroi
pectino-celluloïque
 Epaisseur : de 0,1 à plusieurs µm
 Constitution : fibres de
 Cellulose en microfibrilles
 Hémicellulose
 Pectine = polymère d’un dérivé d’ose
 Synthèse de la paroi
 Augmentation de taille de la cellule végétale
 Elaboration d’une paroi primaire, mince et
semi- rigide
 Dépôt de nouvelle couche de cellulose (paroi
secondaire)

d. Spécialisation de la membrane plasmique


1. Les replis membranaires
2. Système de jonctions intercellulaires
 Chez les cellules animales
 Jonction serrée = occlusive
 Jonction étroite = desmosome (zonula et
macula)
 Jonction communicante
 Chez les cellules végétales
 Système de connexion = plasmoderme =
ensemble d’interruptions localisées de la
paroi squelettique tapissée par la membrane
plamsique

B. Aspects fonctionnels de la membrane plasmique


1. Transports membranaires
a. Transport des petites molécules
1. Transport passif (selon un gradient de concentration
 Diffusion simple (pas de protéase)
 Diffusion accélérée (intervention de protéines
spécifiques des ions, canaux ioniques)

 Diffusion facilitée (protéines


spécifiques des oses ou acides aminés, perméases
2. Transport actif (contre un gradient de concentration,
nécessite de l’énergie)
 Primaire : pompes ATP dépendantes de la présence
d’ions, pompe Na+K+
 Secondaire : gradient ionique de Na+, co-transport
(symport/antiport)
b. Transport des macromolécules et des particules
1. Endocytose
 Définition : entrée de particules et de
macromolécules dans la cellule
 Mécanismes : fusion des deux feuillets de la
membrane à vésicule = endosome
 Types : phagocytose, pinocytose
 Etapes
2. L’exocytose
 Définition : sortie de particule et de macromolécule
de la cellule vers l’extérieur
 Mécanisme : adhésion / fusion des feuillets
 Caractéristiques : phénomène discontinu et contrôlé
2. Transport de l’information
a. Transmission du message nerveux
b. Transmission du message hormonal
1. Définition d’une hormone : molécule produite par des
cellules endocrines, sécrétée dans le sang, qui agit à distance
sur une cellule cible
c. Action
3. Adhésion cellulaire
a. Adhésion intercellulaire
b. Adhsion entre la cellule et des protéines du tissus conjonctif

II. Les membranes internes liées à la synthèse, la sécrétion et la digestion cellulaire


A. Organisation morphologique des compartiments
1. Le réticulum endoplasmique
a. Définition : ensemble de membranes délimitant des cavités
closes
b. Catégories
1. Réticulum endoplasmique rugueux
réticulum endoplasmique granulaire = ergastoplasme
2. Réticulum endoplasmique lisse (pas de ribosome)
c. Polymorphisme
1. Fins tubules contournés pour le REL
2. Sacs aplatis et parallèles dans le RER
2. Appareil de Golgi
a. Définition : ensemble de plusieurs éléments (=dictyosomes,
empilement de 4 à 8 membranes aplaties)
b. Compartimentation dans le dictyosome
1. Compartiment Cis à proximité du RER
2. Compartiment Median : quelques saccules empilés
3. Compartiment Trans : formation de vésicules
3. Les lysosomes
a. Définition
1. Organites très petits de taille hétérogène de 0,05 à 0,5 µm
2. Contenant de nombreuses enzymes intervenant dans la
digestion cellulaire et limités par une membrane
b. Constituants
1. Enzymes : nucléases, protéases, glycosidases, lipases,
phosphatases, phospholipases
2. pH d’action de 4 à 5
c. Caractéristiques de la membrane du lysosome
1. Membrane identique à la membrane plasmique
2. Système de transports : pompe ATP au proton H+ ;
perméases
3. Résistance aux enzymes
d. Différentes catégories de lysosomes
1. Primaire : petits, natifs, pas fusionnés avec des vacuoles
2. Secondaires : fusion d’un lysosome primaire avec une
vacuole à phagolysosome
3. Tertiaire : stocke les déchets qui n’ont pas été éliminés
B. Rôles physiologiques des différents organites présentés
1. Biosynthèse et maturation des protéines post-traductionnelles
a. Protéines sécrétées / protéines lysosomales
1. Fixation de l’ARNm sur le codon AUG
2. Synthèse d’un peptide (16 à 30 acides aminés) = peptide
signal
3. La séquence signal est recouverte par une Particule de
Reconnaissance du Signal (SRP)
4. Détachement du SRP, ancrage du peptide signal dans la
membrane
5. La protéine pénètre à travers la membrane
6. Lorsque l’ARNm est traduit, une enzyme de la membrane du
RER coupe le peptide signal, la signalase
7. La protéine est libre dans la cavité et se replie
b. Protéine membranaire
1. Début de la synthèse identique
2. Présence d’une séquence d’arrêt : signal stop
3. La protéine reste ancrée dans la membrane
c. Transport et maturation des protéines
1. Mise en évidence de la migration des protéines après leur
synthèse : pulse chase*, autoradiographie*
2. Maturation des protéines = acquisition de l’état définitif de la
protéine
 Glycosylation des protéines
 Définition : fixation d’un groupement
glucidique sur la protéine grâce à une enzyme
à partir d’un donneur de groupement
glucidique
 Mécanisme : (séquentiel) transfert d’un
donneur d’oses sur la protéine par des N et O-
glycosyl-transférases
 Localisation : RER à Golgi (cis, trans)
 Repliement des chaînes
 Définition : lors de la synthèse, des protéines
chaperons contrôlent le remaniement de la
protéine
 Assemblage des chaînes : formation de ponts
disulfure
 Maturation des protéines par clivage
3. Le tri et l’adressage des protéines
 Cela consiste à envoyer une protéine au bon endroit
 Enzymes accélératrices dans le RER, marqueurs fixés
dans le Golgi (phosphorylation en M-6-P)
2. Biosynthèse des lipides
a. Au niveau du REL
b. Lipides synthétisés
1. Phospholipides (Golgi)
2. Triglycérides (REL)
3. Cholestérol (cellules du foie)
3. Digestion intracellulaire et détoxication
a. Digestion intracellulaire
1. Généralités
 Assurée par les lysosomes
 2 types
 Autophagie : auto renouvellement des
constituants de la cellule par autolyse.
Formation de vacuoles autophagiques qui
fusionnent avec le lysosome
ex : destruction des mitochondries
 Hétérophagie : concerne la phagocytose et la
pinocytose. Elle fait entrer la molécule par
endocytose qui permet la fusion avec le
lysosome.
b. Détoxication de la cellule
1. Définition : élimination par la cellule de produits, insolubles
dans l’eau, qu’elle va rendre soluble dans l’eau.
2. Effectué au niveau du REL, grâce au cytochrome-P450-
oxydase
III. Les membranes internes et la conversion de l’énergie
A. Les membranes du chloroplaste et la photosynthèse
1. La photosynthèse
a. La phase lumineuse : transformation de l’énergie lumineuse en
énergie chimique
NADP+ + H2O + ADP + Pi à ATP + NADPH,H+ + ½ O2
b. La phase obscure : assimilation par la cellule végétale du CO2
pour synthétiser des composés organiques ; utilisation des
produits formés par la phase lumineuse
nCO2 + ATP + NADPH,H+ à (CH2O)n + NADP+ +ADP + Pi
2. Le lieu de la photosynthèse
a. Ultrastructure du chloroplaste
1. Généralités
 Chez les plantes vertes
 4 à 10 µm x 1 à 4 µm
 20 à 40 par cellule
2. Structure
 Double membrane
 Contenu = stroma
b. Biochimie du chloroplaste
1. La composition globale du chloroplaste
 50 % d’eau
 25 % de protéines
 15 % de lipides
 3 % de chlorophylle
2. Le stroma
 ADN circulaire : ADNds
 Nécessite des plastoribosomes
3. La composition biochimique
 Membranes de l’enveloppe du chloroplaste
 Externe : perméable à l’ensemble des
molécules
 Interne : imperméable au CO2, molécules de
contrôle
 Membranes thlakoïdes
 Photosystème = association d’une antenne
collectrice munie d’un canal qui permet à CH
de la protéine de produire de l’ATP à partir de
l’ADP
 Il existe 3 complexes : photosystème I et II, le
complexe ATP-synthétase
c. Mécanisme de la photosynthèse
1. Cf. 2ème année
B. Les membranes mitochondriales et la phosphorylation oxydative
1. Généralités sur les mitochondries
a. Définition : organite où a lieu l’étape finale de l’oxydation des
nutriments (= molécule simple directement assimilable par la
cellule)
b. Localisation : variable suivant la cellule
c. Nombre : de 300 à 1000 (moins dans les cellules cancéreuses)
d. Forme et taille
1. Longueur : 1 à 7µm
2. Epaisseur : 0,5 µm
e. Déplacement et division
1. Elles bougent dans la cellule, sur des "rails" = fibres du
cytosquelette
2. Elles se divisent par scissiparité
2. Organisation et ultrastructure
a. Une membrane interne qui présente des replis, la crête
mitochondriale
b. Une membrane externe avec un espace intermembranaire (7
nm)
c. L’intérieur est appelé la matrice
3. Biochimie de la mitochondrie
a. Fractionnement des constituants de la mitochondrie
1. Récupération par ultracentrifugation
2. Milieu hypotonique à membrane externe rompue
3. Milieu hypertonique à récupération de la membrane externe
et de la matrice
4. Ultracentrifugation à séparation de la membrane externe
5. Milieu hypotonique à membrane interne
b. Constituants de la matrice mitochondriale
1. ADN circulaire en plusieurs copies = génome mitochondrial
2. Ribosomes
3. Fonctions :
 Réplications de l’ADN et division de la mitochondrie
par scissiparité
 Synthèse des protéines mitochondriales
c. Constituants des membranes
1. De la membrane externe : elle est très perméable, elle
contient des porines (50 % protéines, 50 % lipides)
2. De la membrane interne : elle est imperméable, sa traversée
exige des antiports (80 % protéines, 20 % lipides)
 Protéines de transport
 Protéines de la chaîne respiratoire
 ATP synthétase (complexe uniquement présent sur la
membrane interne au niveau des crêtes
mitochondriales)

Le Cytosquelette et
la Motilité cellulaire
I. Généralités
A. Définitions
1. Le cytosquelette
a. Est constitué d’un ensemble de filaments protéiques que l’on
classe en trois catégories en fonction du diamètre des filaments
2. Les microfilaments
a. 7 nm
b. Dans toutes les cellules eucaryotes (essentiellement musculaires)
c. Ex : actine
3. Les filaments intermédiaires
a. 10 nm
b. La constitution biochimique de ces filaments est très variée
c. Ex : neurofilaments, tomofilaments
4. Les microtubules
a. 25 nm
b. Présents dans toutes les cellules eucaryotes
B. Rôles
1. Morphologie de la cellule
a. Déformation du polynucléaire par émission de pseudopodes
b. Cellules nerveuses
2. Motilité cellulaire
a. Mouvements cellulaires
1. Contraction de la cellule (cellules musculaires)
2. Déplacements de la cellule (mouvements grâce aux
pseudopodes, filaments)
b. Mouvements des organites
1. Déplacements des mitochondries
2. Transport axonal
II. Les microfilaments
A. Microfilaments et cellules musculaires
1. Différents types de cellules musculaires
a. Cellules musculaires squelettiques (striées, polynuclées)
b. Cellules musculaires cardiaques (striées)
c. Cellules musculaires lisses (non striées, paroi des vaisseaux
sanguins et des intestins)
2. Microfilaments et cellules musculaires squelettiques
a. Organisation du muscle squelettique
1. Muscle squelettique = responsable du mouvement
2. Muscle squelettique à ensemble de fibres musculaires
3. Chaque cellule musculaire est constituée de
 Plusieurs noyaux
 Myofibrilles = association de filaments protéiques
(actine et myosine)
 Organites classiques d’une cellule (mitochondrie,
Golgi, Reticulum Endoplasmique)
b. Organisation de la cellule musculaire : ultrastructure
1. Les cellules possèdent plusieurs noyaux rejetés à la
périphérie
2. La taille des filaments reste constante mais celle des zones
de chevauchement est variable
c. Organisation moléculaire des myofibrilles
1. Filament mince
 Principales protéines
 Actine + tropomyosine + troponine
 L’actine résulte de la polymérisation de
molécules d’actine G (= Globulaire) : c’est
une structure dynamique : " modèle du tapis
roulant "
 La troponine est constituée de 3 sous-unités
o TnC catalytique
o TnI inhibitrice
o TnT tropomyosine
 Rôle
 L’actine est une protéine motrice : interaction
entre actimyosine et actinine
 Les autres protéines viennent s’ajouter à
l’actine, elles interviennent dans la régulation
de la contraction musculaire
 La troponine se fixe sur l’actine et empêche
l’interaction entre l’actyne et la myosine