Universidade Federal de São Carlos

Campus de Sorocaba

Licenciatura em Ciências Biológicas 2015

CINÉTICA ENZIMÁTICA
Relatório apresentado ao Prof. Dr.
Vadim Viviani, da disciplina de
Bioquímica.
Aula Prática IV realizada no
laboratório de Química Orgânica e
Bioquímica no dia 22 de setembro
de 2015.

Gabriela Cristina Vieira Diver - 619060

Gabriela Liria Freddo - 619213

Ingrid Alapone – 619280

Luna Peres Guimarães – 619310

Sorocaba, 29 de setembro de 2015.

 1. Introdução

As reações químicas conduzidas pelos organismos vivos são, na sua

maioria, catalisadas por enzimas, tornando a velocidade das mesmas compatíveis
com as exigências metabólicas. (LEHNINGER, 2000).

Conhecendo-se por colorimetria a quantidade de açúcar redutor formado

por cálculo estequiométrico, pode-se determinar a quantidade correspondente de
sacarose hidrolisada. Podemos determinar a afinidade de determinada enzima
pelo substrato da reação catasilada através de seu Km (concentração de substrato
necessária para atingir metade da velocidade máxima da reação catalisada pela
enzima em questão). A união da enzima com o substrato forma o complexo
enzima-substrato, reação reversível, podendo voltar a liberar a enzima e o
substrato ou liberando a enzima na mesma proporção em que foi utilizada mais o
produto. Michaelis e Menten, desenvolveram então a expressão:

Onde [S] é a concentração de substrato e Vmáx é a velocidade máxima da

reação, em mol (de produto formado) por unidade de tempo. (LEHNINGER, 2000).

Assim, a levedura por intermédio da “invertase” hidrolisa a sacarose,

resultando numa mistura equimolecular de glicose e frutose, açúcares esses que
são absorvidos pela célula. A membrana plasmática é impermeável à sacarose e a
levedura acaba excretando a invertase para a hidrólise ocorrer fora da célula da
levedura. (LEHNINGER, 2000).

Se colocará a enzima frente à diferentes concentrações de substrato

(sacarose), resultando em diferentes velocidades de reação enzimática,
permitindo determinar graficamente os valores de Km e Vm para a reação
enzimática da levedura. (LEHNINGER, 2000).

2. Objetivos

 Estudar as influências da variação da concentração do substrato e da

enzima na velocidade da reação enzimática da invertase, bem como a
influência da temperatura, variação de pH.
  Examinar as curvas obtidas, calcular alguns parâmetros cinéticos (K M e
Vmax) e discutir seus valores e importância.

3. Parte experimental
3.1. Materiais utilizados
 3,5-DNS (acido 3,5 dinitrosalicílico);
 Tartarato de sódio e potássio;
 Acetato de sódio 20mM pH4.8;
 Fosfato de sódio;
 Sacarose;
 Tubos de ensaio;
 Pipeta graduada;
 Pera.

3.2. Método

A. Efeito da Concentração de substrato sobre a atividade da enzima

1. Numeraram-se sete tubos de ensaio, onde foram colocados no gelo e

adicionaram-se os reagentes segundo a tabela abaixo (a enzima deve ser o
ultimo reagentes a ser adicionado):

Tabela 1:

Sacarose [Sacarose] Tampão Sol.

5% (mL) (mM) (mL) Enzima
Tubos (1/10)
(mL)
Br. ------------- 1.5 0.5
1 0.05 1.45 0.5
2 0.1 1.4 0.5
3 0.3 1.2 0.5
4 0.5 1.0 0.5
5 0.7 0.8 0.5
Obs.: As soluções de
6 1.0 0.5 0.5
sacarose e enzima deverão
ser preparadas em tampão acetato de sódio 20 mM pH 4,8 [Enzima] = 20 mg/500 mL

2. Após a adição da enzima, agitou-se suavemente. Levou-se a caixa de gelo

com os tubos até o banho-maria. Retirou-se os tubos do gelo (0 oC) e colocou-
 os imediatamente em banho-maria a 37 oC por 5 min. Após este tempo, os
tubos retornaram imediatamente para o gelo.
3. Ainda no gelo, adicionou-se 2 ml de DNS a cada tubo.
4. Transferiu-se os tubos para o banho-maria a 95 oC por 10 min. Após
esse tempo, esfriou-se os tubos em tigela com água e adicionou-se 16 ml de
água destilada em cada tubo. Homogeneizou-se bem por inversão total dos
tubos 4 x.
5. Leram-se as absorbâncias a 540 nm contra o branco.
6. Foi feito o gráfico da velocidade inicial V 0 (mol de sacarose
hidrolisada/min.) vs. concentração inicial do substrato (M de sacarose) com os
valores obtidos para os tubos 1-6.
7. Foi feito um gráfico de Lineweaver-Burk e calculou-se os valores de V máx
e KM para a sacarose com os valores obtidos para os tubos 1-6. Comparou-se
o valor de KM com o encontrado na literatura científica.

B. Efeitos da concentração de enzima, temperatura e pH na atividade

enzimática

1. Numeraram-se os tubos de ensaio e adicionaram-se os reagentes

conforme a tabela 2.
2. Antes de começar a pipetar as soluções de enzima nos tubos, separou-
se 1 mL de amostra de enzima 1/10 num tubo de ensaio separado, levou-se a
banho maria a 95ºC por 5 min, e colocou-se de volta no gelo. Esta preparação
de enzima aquecida foi utilizada somente no Tubo 3.
3. No tubo 4, a reação inteira procedeu-se no gelo.
4. Após a adição das enzimas aos respectivos tubos, agitou-se
suavemente. Retirou-se os tubos Br, 1,2,3 e 5 do gelo (0 oC) e colocaram-se
simultaneamente em banho-maria a 37 oC por 5 min. Após este tempo, os tubos
retornaram imediatamente para o gelo.
5. Ainda no gelo, adicionou-se 2 ml de DNS em todos os tubos.
6. Transferiram-se os tubos para banho-maria a 95 oC por 10 min. Findo
este tempo, esfriou-se em tigela com água corrente e adicionaram-se 16 ml de
 água destilada em cada tubo. Homogeneizou-se bem por inversão total dos
tubos 4 x.
7. Leram-se as absorbâncias a 540 nm contra o branco.
8. Calcularam-se as atividades enzimática em U, e utilizando a
concentração de proteínas totais do extrato de levedura não-diluído (preparação
de enzima não diluída), calcularam-se as atividades específicas das amostras.

Tabela 2:

Sacarose 5% Tampão Sol. Enzima

(mL) (mL) (mL)
Tubos
Br. ------------- 1.5 0.5 (1/10)
1 1.0 0.5 0.5 (1/10)
2 1.0 0.5 0.5 (1/100)
3 1.0 0.5 0.5 (1/10
pré-fervida)
4 (manter 1.0 0.5 0.5 (1/10)
sempre
em gelo)
5
1.0 0.5 (+ 0.5 (1/10)
NaOH)

C. Dosagem de proteína total para cálculo da atividade enzimática (usar

curva-padrão e fator da aula anterior)

1. De acordo com a Tab.3, adicionou-se no tubo do branco 2,5 ml de

reagente de biureto e 1,5 ml de água, e no tubo 1 adicionou-se 2,5 ml de
biureto, 1ml de extrato de levedura e 0,5 ml de água, agitou-se levemente,
levou-se em banho-maria a 37ºC por 15 min, e mediu-se a absorbância a 550
nm.

Tabela 3

Biureto Água Sol. Enzima

Tubos
(mL) (mL) (mL)

Br. 2,5 1.5 ___

1 2,5 0.5 1,0 (1x)
2. Baseado na [Proteína total], calculou-se: as atividades e as atividades
específicas da enzima invertase do extrato de levedura relativa aos tubos 1,2 e 3
da Tabela 3, de acordo com as fórmulas:

A (Atividade) = numero de U (unidades)/mL

1 U= quantidade de enzima necessária para a produção de 1 Mol de produto/L

min

Aesp= A/[proteína total] (U/mg)

4. Resultados e discussão

Baseado nas absorbâncias obtidas na aula prática passada, e calculando o

fator, obteve-se:

Δx/Δy = 0,6/0,1 = 6
Tabela 1:

Sacarose [Sacarose Tampão Sol. A540 [Glicose] V0

5% (mL) ] (mL) Enzima (nm) (uM) Sacarose
Tubos (mM) (1/10) Hidrol
(mL) (mol/min)
Br. ------------- 0 1.5 0.5 0 0 0
1 0.05 0,365 1.45 0.5 0,25 1,265 5,06.10-3
3
2 0.1 0,73 1.4 0.5 0,45 2,375 9,5.10-3
7
3 0.3 2,19 1.2 0.5 1,01 5,095 0,02
9
4 0.5 3,65 1.0 0.5 1,31 6,58 0,026
6
5 0.7 5,11 0.8 0.5 1,51 7,57 0,03
4
6 1.0 7,30 0.5 0.5 1,62 8,13 0,032
6

Através dos resultados da tabela acima, pode-se construir um gráfico do inverso

da velocidade inicial x inverso da concentração de sacarose.

250

200
f(x) = 63.97x + 20.84

150

Linear ()
100 Linear ()

50

0
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3
1/Vmax: 20,837 1/Km: 0,32

Vmax: 0,047 Km: 3,06

Tabela 2:

Sacarose 5% Tampão Sol. Enzima A540 V0

(mL) (mL) (mL) (nm) Sacarose Hidrol
Tubos (mol/min)
Br. ------------- 1.5 0.5 (1/10) --------
1 1.0 0.5 0.5 (1/10) 0,801 C=1,77=0,354
2 1.0 0.5 0.5 (1/100) 0,063 C=0,139=0,0278
3 1.0 0.5 0.5 (1/10 0,014 C=0,031=6,2.10-3
pré-fervida)
4 (manter 1.0 0.5 0.5 (1/10) 0,219 C=0,486=0,0972
sempre
em gelo)
5
1.0 0.5 (+ 0.5 (1/10) 0,096 C=0,213=0,0426
NaOH)
Biureto Água Sol. Enzima A550 A Proteina Aesp
(mL) (mL) (mL) (nm) (U) Total (U/mg)
Tubos
(mg/mL)
Br. 2,5 1.5 ___ 0 1,26
1 2,5 0.5 1,0 (1x) 0,150 1,26

5. Conclusão
Nota-se uma eficiência catalítica admirável das enzimas devido ao seu alto
grau de especificidade por seus substratos, acelerando reações químicas
específicas. Observa-se que tais reações ocorrem em condições necessárias para
que ocorra uma boa atividade da enzima, já que elas funcionam em condições
suaves de temperatura e pH.

6. Referências Bibliográficas
LEHNINGER, A.B.; NELSON, D. L.; COX, M. Princípios de bioquímica. 2.ed.
São Paulo: Sarvier, 2000.