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Un antibiogramme avec des produits de

substitution
mercredi 21 décembre 2011, par Bruno Boucher

Liaison avec le programme

Niveau
1ère S
concerné :
Pratiquer une démarche
scientifique.

Manipuler et expérimenter.
Thème 3 : corps humain et santé - 3B –
Variation génétique et santé Sous-partie
Concevoir et mettre en place un
3-B-c : Variation génétique bactérienne
protocole permettant de montrer la
et résistance aux antibiotiques
sensibilité de microorganismes à
Partie du
différents antibiotiques.
programme : Des mutations spontanées provoquent
une variation génétique dans les
Recenser, extraire et organiser des
populations de bactéries. Parmi ces
informations pour :
variations, certaines font apparaître des
identifier la sensibilité ou la
résistances aux antibiotiques
résistance de microorganismes à
différents antibiotiques,
calculer le taux d’apparition de
résistances dans une population.

Problème à résoudre

Comment identifier une souche résistante ? Comment expliquer son apparition ?

Pourquoi des produits de substitution ?

Deux raisons à cela :


la manipulation de souches de microorganismes ne doit se faire que dans des conditions
bien contrôlées. Or tous les laboratoires de lycée ne sont pas formés et/ou équipés pour
exercer ce contrôle, en particulier pour la destruction des souches après manipulation,
l’exposition à des antibiotiques contribue au développement de souches résistantes (c’est
ce que le programme demande de montrer). Il y en a bien assez comme cela sans que toutes
les 1ères S de tous les lycées de France exposent des bactéries à des antibiotiques. On pourra
d’ailleurs après coup discuter avec la classe des raisons qui ont amené l’enseignant à choisir
des produits de substitution plutôt que de vraies souches de bactéries et de vrais antibiotiques.

Deux avantages supplémentaires par rapport à la réalisation d’un antibiogramme, en plus de la


sécurité :
le coût,
le temps : le résultat est visible au bout de seulement quelques minutes.

Protocole de substitution
Ce protocole est adapté à partir de celui proposé sur le site e-Bug dans la partie collège (sur

lequel se trouve aussi une activité ludique sur la transmission des IST)

Principe

Un indicateur coloré sensible au pH remplace les bactéries. De l’acide chlorhydrique


remplace l’antibiotique.

Matériel :

 Boîtes de Pétri (le nombre dépend de la construction de la séance)


 Acide chlorhydrique
 Marqueur
 Gélose (agar)
 Tubes à essai
 Pinces fines
 Portoirs
 Pastilles de papier filtre (préparées par exemple avec un perforateur de bureau sur du
papier filtre plié pour avoir plus d’épaisseur)
 Rouge phénol à 2-4%

Préparation des boîtes de gélose (agar)

1. Préparer la gélose (agar) selon les instructions du fabricant.


2. Lorsqu’il est légèrement refroidi, mais pas encore solidifié, verser dans une boîte
(pour pouvoir montrer aux élèves la couleur indiquant l’absence de croissance
bactérienne).
3. Ajouter ensuite suffisamment ( 10 gouttes) de rouge phénol à 2-4% pour que l’agar
prenne une couleur rouge orangée (représentant la croissance bactérienne) et bien
mélanger.
4. Verser dans chaque boîte de Pétri et laisser refroidir.

A la place du rouge phénol, on peut utiliser de la phénolphtaléine : 2,5g pour 100mL


d’éthanol 95° additionné de rouge Congo.

Manipulation élèves : Les élèves disposent de tubes à essais portant le nom de différents
antibiotiques et contenant en réalité de l’acide chlorhydrique (5%) ou de l’eau. Avec la pince
fine, une pastille de papier filtre est trempée dans un des tubes à essai puis déposé sur la
gélose en suivant le schéma ci-dessous :

Le protocole initial du site e-bug propose de trouer la gélose à l’emporte pièce et de déposer
l’antibiotique/HCl avec une pipette compte-gouttes (un peu comme dans le protocole
d’Ouchterlony). Nous proposons de déposer une pastille de papier filtre imbibée d’HCl pour
que le geste se rapproche davantage de la réalisation d’un véritable antibiogramme.

Mise en situation et place dans la démarche

1ère proposition : mettre l’élève en situation de choix de traitement de patients. Chaque


boîte correspond à un patient et il faut par l’antibiogramme déterminer quel traitement sera
efficace, c’est à dire à quel(s) antibiotique(s) la bactérie résiste ou non.

Chaque binôme pourra avoir un patient différent. Il suffit de changer ce qui est noté sur les
tubes avec HCl ou avec l’eau selon le cas.

On est ici au début de la démarche, dans l’observation d’un phénomène (l’apparition de


résistances aux antibiotiques) qu’il s’agira d’expliquer.

2ème proposition (adaptée à partir du livre de 1ère S Belin) : mettre l’élève en situation de
vérification de l’hypothèse qu’il s’est produit une ou des mutations qui sont à l’origine des
résistances aux antibiotiques. Les résistances doivent donc apparaître aléatoirement au fil des
générations successives.

L’expérience est la suivante : on prend une souche de bactérie non résistante. Une partie est
congelée pour conservation. Le reste est divisé en plusieurs lots (un par binôme) qu’on laisse
se multiplier. Le jour du TP on teste la résistance aux antibiotiques des différents lots pour
voir si des résistances sont apparues. On fait aussi le test sur la souche initiale, décongelée.

Le binôme chargé de la souche initiale aura de l’HCl dans tous ses tubes : la souche est
sensible à tous les antibiotiques. Pour les autres binômes, un ou plusieurs tubes contiendront
de l’eau pour montrer l’apparition d’une résistance. La concentration en HCl pourra être
différente (par exemple un tube à 5% et un autre à 0,5%), ce qui laissera une tache plus ou
moins large, montrant une sensibilité plus ou moins grande.

Pour illustrer le caractère aléatoire de la mutation et donc de l’apparition de la résistance,


certains binômes pourront avoir des souches restées sensibles à tous les antibiotiques. La
résistance apparue ne sera pas la même pour tous les binômes.

On est ici dans le test d’une hypothèse. La résistance aux antibiotiques a déjà été défini et on
cherche à valider l’explication donnée (apparition par mutation).

Exemples de boîtes obtenues

Prolongements

on peut utiliser différentes concentrations en HCl qui laisseront une décoloration plus ou
moins étendue sur la gélose, témoignant d’une sensibilité plus ou moins grande des bactéries à
l’antibiotique. Une capture d’image permettra la mesure du diamètre de chaque zone dans le
logiciel Mesurim, par une mesure de surface.

Utilisation de Rastop et Anagène :

 fichier montrant la céfotaxime sur la betalactamase


 fichier .edi donnant la séquence du gène de la betalactamase d’une souche d’E. Coli
sensible et d’une souche résistante à la céfotaxime.
Sources :

 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ pour les séquences génétiques


 http://www.pdb.org/pdb/home/home.do pour les structures spatiales

Voir aussi : Mettre en œuvre un protocole pour déterminer le taux de mutation chez E. Coli

F. Redon, B. Boucher

Annexes associées à cet article :


 fichiers (Zip – 23.1 ko)

L'antibiogramme par diffusion en milieu


gélosé
Principe général :

L'antibiotique est présent en quantité connue dans un disque de papier filtre. Lorsque le
disque est déposé à la surface du milieu de culture, l'antibiotique diffuse en créant un gradient
de concentration.

Diffusion de l'antibiotique dans le milieu de culture. La création du gradiant de concentration est visualisé par le dégradé d
couleur.
Diffusion en milieu gélosé (vue de côté) Diffusion en milieu gélosé (vue de dessus)
Voir cette animation en plein écran ou la télécharger : vue Voir cette animation en plein écran ou la télécharger : vue de
de côté.swf dessu.swf

La bactérie ensemencée sur ce milieu va entrer en contact avec des concentrations variables
d'antibiotique. Pour une concentration en antibiotique supérieure à la CMI sa croissance sera
donc arrêtée. L'inhibition se traduira donc par une zone circulaire où il n'y a pas de croissance
visible (absence de colonies). Le diamètre de cette zone est proportionnel à la sensibilité de la
souche vis à vis de cet antibiotique.

Réalisation

La technique doit être standardisée

 milieu: Muller-Hinton de 4 mm d'épaisseur


 disque d'antibiotique : papier filtre contenant une concentration précise d'antibiotique.
 inoculum : souche pure de 18 heures. Concentration de l'ordre de 500 000UFC par mL
 temps de préincubation : il faut laisser le temps à l'antibiotique de diffuser avant de
permettre aux germes de se multiplier.
Voir cette animation en plein écran ou la télécharger "vue de dessu dev.swf "

Lecture et interprétation

La lecture est effectué à l'aide d'abaques. Chaque antibiotique dispose d'un abaque qui
présente le rapport entre le diamètre de la zone d'inhibition de culture autour du disque et la
concentration de l'antibiotique.

L'abaque permet :

- d'évaluer la CMI ;

- de conclure sur l'efficacité potentielle de l'antibiotique lors d'un traitement. Pour cela il faut
comparer la CMI aux concentrations critiques fournies par l'abaque.

Concentration critique :

 concentration critique inférieure c : taux sanguin moyen obtenu aux posologies


habituelles.
 concentration critique supérieure C : taux sanguin maximal obtenu aux posologies
habituelles.

Ces concentrations permettent de définir les catégories : sensible, intermédiaire et résistant :

 sensible: la CMI de l’antibiotique pour le germe étudié est plus faible que la
concentration critique inférieure (CMI<CCI). Cet antibiotique peut être utilisé pour
éliminer in vivo ce germe.
 germe de sensibilité intermédiaire : la CMI est comprise entre les deux concentrations
critiques (CCI<CMI<CCS)
 germe résistant : la CMI est supérieure à la concentration critique supérieure
(CMI>CCS). Il n’est pas possible d’éliminer, in vivo, ce germe avec cet antibiotique.

Par Rémi Moreda -Lycée Docteur Lacroix - Narbonne

Techniques de Prélèvements : Interprétation d'un antibiogramme

INTRODUCTION
Il permet de mesurer la capacité d'un ATB à inhiber la croissance bactérienne in vivo.

Il doit être réalise selon des méthodes standard.

REALISATION

Méthode de diffusion des disques imprègne d'antibiotiques et la mesure des


diamètres (méthode de Kirby Bauer recommandée par l'OMS).

Matériel et réactifs :

Milieu de culture en fct des germes :

Milieu de Mueller Hinton pour les entérobactéries, pyo et staph

Milieu de Mueller Hinton additionné de 5% de sang de mouton pour les strepto

Gelose chocolat + isovitalex pour Haemophilus et Neisseria

Disques en papier impregnes d'ATB

Étalons de turbidité ou echelle de Mac Farland

Écouvillons stériles ou pipettes

Préparation de l'inoculum :

Prélever une colonie d'entérobactérie pseudomonas ou staph ou strepto

Transvaser dans un tube contenant 2,5mL de l'eau physiologique : émulsionner les


colonies sur le bord du tube ensuite agiter.

Ajuster la densité de l'inoculum celle de l'étalon 0,5 Mac Farland en y ajoutant soit un
fragment de colonie soit de l'eau physio. Les 2 tubes doivent être de même type et
place côte à côte et éclairés de la même façon.

Ajustement de la turbidité de l'inoculum :

Ensemencement des boîtes :

Écouvillonnage

Tremper un écouvillon stérile sec dans l'inoculum

Éliminer l'excès d'inoculum


Ensemencement stries sur toute la surface de la boîte à 3 reprises

Passer enfin l'écouvillon sur le bord de la gélose

Laisser sécher la boîte pendant qq. minutes à température ambiante, le couvercle


étant ferme

Incuber à 35-37°C

Choix et disposition des disques d'ATB :

Choix d'antibiotiques est fait selon le genre de la bactérie

La disposition des ATB est faite selon leur classification : B-lactamines, aminosides,
quinolones et FQ, macrolides, lincosamides, streptogramines...permettant ainsi
l'interprétation de l'antibiogramme

Disposition des disques d'antibiotiques :

Déposer les disques d'ATB a l'aide d'une paire de pinces steriles ou d'un distributeur
de disques

Respecter 25 à 30mm entre les disques (sur une boîte de 90mm, max 7 disques)

Appuyer doucement sur chaque disque pour assurer un contact uniforme avec le
milieu

Mettre les boîtes à incuber à 37°C dans les 30mn qui suivent la préparation pendant
16 à 18h

Lecture :

Le lendemain, mesurer et noter le diamètre de chaque zone d'inhibition en m

Les résultats seront interprètes en fct des diamètres critiques figurant dans des
tableaux d'interprétation fournis par les fabricants des disques

Principales causes d'erreur :

Inoculum (non standardisé, présence d'un contaminant, inondation irrégulière,


ensemencement tardif)

Disques d'ATB (mauvaise stabilité, mauvaise conservation, date de péremption


dépassée, mauvaise application des disques a la surface de la gélose)

Milieu de culture (milieu inapproprié, lot défectueux, mauvaise conservation du


milieu, mauvaise présentation, mauvaise concentration, teneur élevée en thymidine)

Conditions d'incubation (trop longue ou trop courte, température trop basse,


atmosphère particulière)

Lecture et interprétation (lecture prématurée, erreur de mesure, erreur


d'interprétation)

Contrôle de qualité (absence de contrôle de qualité, mauvaise conservation


des souches de référence)

INTERPRETATION ANTIBIOGRAMME

Toutes les familles d'antibiotiques sont à tester

Mécanismes de résistance :

Inactivation enzymatique : prod enz

Imperméabilise ou mauvaise perméabilité membranaire

Modification de la cible

Systèmes d'efflux actif

La résistance acquise est une adaptation de la bactérie aux nouveaux ATB

L'antibiothérapie nécessite la prise en compte de nbx paramètres comme la


sensibilité des germes et les caractéristiques de l'hote.

Propriétés principales des familles d'ATB : spectre, pharmacocinétique, précautions


d'utilisation, contre-indications, effets indésirables, indications, présentations et
posologies.

CMI= concentration minimale inhibitrice de la croissance bactérienne in vitro

CMB= concentration minimale bactéricide laissant un nb de survivants < 0,01 % de


l'inoculum bactérien de départ

Espèce habituellement sensible : CMI < concentration critique inférieure


Espèce modérément sensible : CCI < CMI < CCS (concentration critique sup.) < 10%

Espèce inconstamment sensible : 10-50% souches résistantes

Espèce résistante : CMI > CCS

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