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Méthode immuno-enzymatique ELISA

Une plaque de microtitrage à 96 puits, couramment utilisée pour les tests ELISA

Microbiologiste utilisant un test ELISA pour le dépistage du VIH

La méthode immuno-enzymatique ELISA (de l'anglais enzyme-linked immunosorbent assay,


littéralement « dosage d'immunoabsorption par enzyme liée », c'est-à-dire dosage immuno-enzymatique
sur support solide) est un examen de laboratoire. Cette méthode est principalement utilisée en
immunologie pour détecter la présence d'un anticorps ou d'un antigène dans un échantillon.

Ce test entre dans le cadre plus général des EIA (enzyme immunoassays), dans lequel le dosage est
couplé à une réaction catalysée par une enzyme qui libère un composant coloré suivi par une
spectroscopie, par opposition aux RIA (radio immunoassays) dans lesquels l'anticorps est marqué par
un radioélément et dont le dosage mesure un nombre de désintégrations par secondes.

L'ELISA est une technique biochimique utilisant un ou deux anticorps. L'un de ceux-ci est spécifique de
l'antigène, tandis que l'autre réagit aux complexes immuns (antigène-anticorps) et est couplé à une
enzyme. Cet anticorps secondaire, responsable du nom de la technique, peut aussi causer l'émission d'un
signal par un substrat chromogène ou fluorogène.
L'ELISA pouvant être utilisé tant pour évaluer la présence d'un antigène que celle d'un anticorps dans un
échantillon, c'est un outil efficace à la fois pour déterminer des concentrations sériques d'anticorps
(comme pour le test HIV ou le virus du Nil), que pour détecter la présence d'un antigène. Il a également
trouvé des applications dans l'industrie alimentaire, pour détecter des allergènes alimentaires, comme le
lait, les cacahuètes, les noix et les œufs. C'est un test simple, facile d'emploi et peu coûteux. Il est limité
par la disponibilité en anticorps spécifique.
Sommaire
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 1 Méthodes
o 1.1 ELISA indirecte
 1.1.1 Applications
 1.1.1.1 Essais quantitatifs (dosages)
 1.1.1.2 Essais qualitatifs : test VIH par ELISA
o 1.2 ELISA en sandwich
o 1.3 ELISA par compétition
 2 Voir aussi
o 2.1 Bibliographie
o 2.2 Articles connexes

o 2.3 Liens externes

Méthodes
ELISA indirecte

Les étapes de l'ELISA dite indirecte, la plus couramment utilisée, pour déterminer la concentration en
anticorps du sérum sont :

1. l'application d'un échantillon d'un antigène connu sur une surface, le plus souvent celle d'un puits
d'une plaque de microtitration. L'antigène est fixé à la surface, de façon à le rendre immobile.
2. le recouvrement des puits (ou toute autre surface) par les échantillons de sérum à tester (ou tout
autre solution à tester), dont la concentration en anticorps est, par définition, inconnue, et
habituellement diluée dans le sérum d'une autre espèce. L'utilisation de sérum non-humain
empêche la liaison à l'antigène par des anticorps non-spécifiques contenus dans le sang du
patient.
3. le rinçage de la plaque, de façon à retirer les anticorps non-liés. Après rinçage, seuls les
complexes antigène-anticorps demeurent attachés à la surface du puits.
4. l'ajout aux puits des anticorps secondaires qui se lieront à l'anticorps primaire, (il s'agit dans ce
cas d'une antiglobuline). Ces anticorps secondaires sont couplés à l'enzyme modificatrice de
substrat qui permet de suivre l'évolution de la réaction.
5. le second rinçage de la plaque, de sorte à éliminer les anticorps non liés.
6. l'application d'un substrat qui, s'il est converti par l'enzyme, émet un signal chromogénique ou
fluorescent.
7. la quantification du résultat, à la vue ou, le plus souvent, par spectrophotométrie ou tout autre
appareil d'optique.

L'enzyme agit comme amplificateur : quand bien même peu d'anticorps conjugués à l'enzyme seraient
attachés, l'enzyme catalyserait la formation de nombreux signaux, ce qui rend ce test très sensible, mais
augmente également le nombre de faux positifs. Il faut donc, comme d'habitude, prévoir des puits
« contrôle ».

L'ELISA peut être réalisé à visée quantitative ou qualitative :

 un résultat qualitatif indiquera la présence ou l'absence d'un antigène dans l'échantillon. Les
valeurs-seuil sont déterminées par l'analyste et peuvent être basées sur la statistique. Deux ou
trois écarts-types sont généralement utilisés pour distinguer l'échantillon positif du négatif.
 dans l'utilisation quantitative de l'ELISA, la densité optique ou les unités de fluorescence de
l'échantillon sont interpolées sur une courbe d'étalonnage, en général une dilution sérielle de la
cible.

Applications[modifier]

Essais quantitatifs (dosages)[modifier]

On utilise l'ELISA direct pour le dosage de protéines variées. Quelques exemples tirés d'application en
pharmacologie médicale : hormones thyroïdiennes, concentration en médicaments (pour évaluer
l'observance et/ou adapter la posologie), etc. Dans le domaine de la recherche, les tests ne sont limités
que par l'imagination du chercheur.

Essais qualitatifs : test VIH par ELISA[modifier]

Article détaillé : Test VIH.

L'application la plus connue du grand public est le dépistage en première ligne du VIH.

La technique ELISA permet la détection d'anticorps anti-VIH dans le sérum sanguin (d'où le terme de
séropositivité ou de séronégativité). La technique présente comme indiqué une grande sensibilité (c'est-
à-dire que la plupart des cas sont détectés, et que les « faux négatifs » - les tests négatifs alors que le
patient est en réalité séropositif - sont quasi à exclure, du moins si le test est réalisé dans un délai de trois
mois après le contact infectant) et une spécificité acceptable (c'est-à-dire un taux assez faible de « faux
positifs » - le test est positif parce que l'anticorps a réagi à un antigène non spécifique). Toutefois, en cas
de sérologie anti-VIH positive, les échantillons doivent être soumis à des tests de confirmation, comme
le western blot, qui utilise une technique basée sur l'électrophorèse et dont le taux d'erreur est
extrêmement faible.

ELISA en sandwich[modifier]

Un ELISA en sandwich. (1) La plaque est recouverte avec un anticorps de capture ; (2) l'échantillon est
ajouté, et tout antigène présent se lie à l'anticorps de capture ; (3) l'anticorps de détection est ajouté, et se
lie à l'antigène ; (4) L'anticorps secondaire lié à l'enzyme est ajouté, et se lie à l'anticorps de détection ;
(5) Le substrat est ajouté et est converti par l'enzyme en une forme détectable (colorée ou fluorescente).

L'ELISA en sandwich est une variante moins commune (en clinique) de cette technique, utilisée afin de
détecter un échantillon d'antigène dans le sérum ou tout autre échantillon. Cette technique est par contre
d'un usage très courant en recherche.

Le procédé se déroule, dans ses grandes lignes, comme suit :


1. Une surface est préparée et une quantité connue d'anticorps dit de capture y est liée.
2. L'échantillon contenant l'antigène est appliqué à la plaque.
3. La plaque est rincée, de façon à éliminer l'antigène non-lié.
4. Les anticorps conjugués à l'enzyme sont ajoutés.
5. La plaque est rincée une deuxième fois.
6. Le substrat convertible par l'enzyme en signal fluorescent est ajouté.
7. Le résultat est analysé « à l'œil » ou dans un spectrophotomètre spécialement conçu pour
accepter directement les plaques de 96 puits.

Toutefois, ainsi qu'illustré, il existe le plus souvent une étape supplémentaire, l'addition d'anticorps de
détection, afin d'éviter de créer des anticorps conjugués à l'enzyme pour chaque antigène. L'utilisation
d'une enzyme couplée reconnaissant la fraction Fc des autres anticorps permet de l'utiliser dans une
variété de situations et de réduire le coût de la procédure.

ELISA par compétition[modifier]

Une troisième utilisation de l'ELISA se fait par compétition de liaison. Elle permet le dosage d'un
antigène :

1. Une plaque est préparée sur laquelle sont fixés des anticorps (en défaut).
2. Un mélange d'antigènes marqués et des antigènes à doser (non marqués) est déposé sur la
plaque.
3. La plaque est rincée, de sorte que les antigènes non liés aux anticorps sont éliminés.

La compétition joue donc entre les antigènes marqués (en quantité connue) et non marqués (en quantité
à déterminer) pour leur liaison aux anticorps, qui sont en défaut. Ainsi plus les antigènes à doser sont
nombreux, plus leur proportion parmi les antigènes retenus par les anticorps est grande, et plus le signal
sera faible. Inversement, si la concentration initiale de l'antigène est faible, le signal sera fort.

Voir aussi[modifier]
Bibliographie[modifier]

 E. Engvall et P. Perlman, « Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of


immunoglobulin G », Immunochemistry, vol. 8, pages 871-874, 1971. PMID : 5135623.
 R. A. Goldsby, T. J. Kindt, B. A. Osborne et J. Kuby, « Enzyme-Linked Immunosorbent Assay »,
in Immunology, 5e édition, pages 148-150, W. H. Freeman, New York, 2003.

Articles connexes[modifier]

 Test
 ELISPOT

Liens externes[modifier]

 (fr) Processus d'ELISA


 (fr) Explications et mécanismes Elisa et Western Blot avec figures

Définition
Le terme ELISA vient de Enzyme-Linked Immunosorbent Assay. Il s'agit d'un procédé (immuno
absorption enzymatique) qui permet de doser les antigènes (corps considéré comme étranger par
l'organisme) et les anticorps grâce à l'utilisation d'un marqueur (molécule dont la détection permet
d'identifier ces éléments). Dans la méthode ELISA, ces marqueurs sont des enzymes.

Généralités
Cette méthode permet de détecter les immunoglobulines (anticorps) qui sont dirigées contre un virus ou
une bactérie. Autrement dit, le test d'ELISA va permettre de savoir si une personne est affectée ou pas
par un micro-organisme.L'individu est considéré comme séropositif quand il existe une infection, et
séronégatif dans le cas inverse.Le test ELISA sert notamment à mettre en évidence une séropositivité
quand un individu a été au contact du VIH (virus du sida).Le test ELISA doit être vérifié par la réaction
de Western Blot. La réaction de Western Blot est une technique qui permet de rechercher dans le sérum
sanguin (partie liquidienne du sang), des protéines antigéniques et tout particulièrement des protéines
issues d'un virus ou encore des anticorps dirigés contre ces protéines. La technique de Western Blot se
déroule en trois étapes. La première étape consiste à isoler les protéines contenues dans le sang grâce à
une électrophorèse, c'est-à-dire un déplacement des particules soumises à un champ électrique. Ceci
s'effectue sur un support chimique (le gel de polyacrylamide). On voit alors les protéines se déplacer
(migrer) à une distance en relation directe avec leur poids moléculaire. C'est-à-dire que plus le poids
moléculaire est faible, plus la protéine va migrer loin. La deuxième étape consiste à accrocher les
molécules ainsi séparées sur une membrane de nitrocellulose. La troisième étape est destinée à mettre en
évidence les protéines grâce au dépôt d'anticorps mariés à une enzyme qui elle-même a été radio-
marquée sur la membrane de nitrocellulose. La mise en évidence des protéines est possible grâce à la
fixation de ces enzymes marquées sur les protéines précédemment individualisées.

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Sommaire
B.Cell B.Dev B.Mol B.V. Gen Phy.V. T.P Zoo Web Electrophorèse Spectrochimie Dosages
Chromatographie

MÉTHODES PHYSIQUES DE SÉPARATION ET D'ANALYSE ET MÉTHODES DE DOSAGE


DES BIOMOLÉCULES

D-Techniques de dosage

3-TECHNIQUES IMMUNOLOGIQUES

3-1-Méthodes qualitatives

On les utilise en cytologie (ICC = immunocytochimie) ainsi qu'en biochimie p. ex. après électrophorèse
(immunoblots). Le principe consiste à fixer un anticorps spécifique sur l'antigène d'intérêt puis à révéler
la présence de cet anticorps, soit avec un second anticorps anti-anticorps accroché sur des
microparticules d'or ("immunogold") ou sur lequel est fixée une enzyme (ex. peroxydase).

3-2-Méthodes quantitatives : Principes de base


Méthodes par compétition et méthodes sans compétition : on distingue deux grands types
d'immunodosages utilisant un marqueur, selon que le réactif (anticorps) est limitant ou en excès par
rapport à l'antigène à doser.

Dosages avec un excès de réactif : méthodes immunométriques ou


méthodes directes

La totalité de l'antigène à doser se lie à l'anticorps fixé. Il est ensuite révélé


par un anticorps marqué. On mesure la fraction liée qui augmente avec la
concentration en antigène à doser (linéairement pour de faibles
concentrations).
Cette méthode est plus spécifique que la précédente, car elle utilise deux
épitopes (sites antigéniques) différents de l'antigène ; elle est donc inutilisable
pour les haptènes. Elle est aussi plus sensible.
Dosages avec réactif limitant : méthodes par compétition ou méthodes
indirectes

L'antigène à doser entre en compétition avec l'antigène marqué pour la liaison


à l'anticorps ; la totalité des sites anticorps disponibles est liée. On mesure la
fraction liée qui diminue exponentiellement avec la concentration en Ag à
doser. On peut procéder en phase liquide homogène ou en phase solide
hétérogène ; dans ce dernier cas, la séparation des fractions libre et liée est
facilitée.
Cette méthode s'applique à tous les antigènes quelle que soit leur taille, y
compris les haptènes.

Les méthodes par compétition nécessitent l'emploi d'un traceur, qui est un analogue de l'antigène
repérable par diverses méthodes : la molécule de traceur peut porter un atome radioactif (tritium iode),
une enzyme, être chimioluminescente voire être accrochée à un virus.

La mesure de la liaison du traceur lié à l'anticorps nécessite l'utilisation d'une méthode adéquate de
séparation du traceur libre et du traceur lié :
• la fraction liée peut être précipitée par du polyéthylène glycol (PEG) ou un alcool après avoir
éventuellement rajouté des protéines comme entraîneur.
• la fraction libre peut être adsorbée sur du charbon actif ("dextran-coated charcoal" - la couche de
dextran, un polymère de sucres qui entoure les grains de charbon évite que les protéines, et bien sûr les
anticorps ne soient également adsorbés).

Ces méthodes ne peuvent être utilisées que lorsqu'on travaille sur des petites molécules, comme par
exemple des hormones stéroïdes et elles ne s'appliquent pas à des hormones protéiques.
Il existe bien d'autres méthodes que nous ne pouvons pas toutes mentionner ici. Ce qui est important
tient plus au principe-même de ces séparations. Il est assez évident que cette étape est assez longue, et
c'est la raison pour laquelle des méthodes évitant le recours à la centrifugation ont été développées.

Classification des méthodes de dosage immunologiques

Dosage avec compétition Dosage sans compétition


Traceur
(anticorps limitant) (anticorps en excès)

Radiomarqué Radioimmunoassay (RIA) Immunoradiometric assay (IRMA)

Enzyme Enzymoimmunoassay Enzyme-labeled immunosorbent assay


(EIA) (ELISA)

Fluorescent Fluoroimmunoassay (FIA) Immunofluorometric assay (IFMA)

Luminescent Luminoimmunoassay Immunoluminometric assay (IFLA)


(LIA)
3-3-Exemples montrant la diversité des méthodes utilisables

3-3-1-Méthodes avec excès de réactif = immunoenzymométrie

Ces techniques nécessitent toutes une étape de séparation ; elles sont donc réalisées en phase
hétérogène.

Dosage d'un antigène par méthode sandwich (ELISA sandwich)

L'antigène doit posséder deux épitopes différents; il est pris en "sandwich"


entre deux anticorps.
Dosage d'un antigène par la méthode du double sandwich

Dans ce cas, la fixation de l'antigène est révélée grâce à un anticorps anti-


immunoglobuline marqué, qui se lie sur l'anticorps spécifique qui a reconnu
l'antigène. Les anticorps anti Ig marqués sont disponibles dans le commerce ;
cela facilite le travail de l'utilisateur car le marquage est une opération
délicate à réaliser au laboratoire.
Dosage direct d'un antigène (ELISA direct)
Il est possible de fixer la totalité de l'antigène présent dans l'échantillon à
doser sur la paroi du tube ou de la cupule de réaction, puis de révéler cet Ag
par l'Ac marqué :

ou par l'Ac spécifique lui-même révélé par un Ac anti-Ac marqué :


Dosage d'un anticorps

L'anticorps à doser est pris en "sandwich" entre l'antigène et un anticorps anti-


anticorps marqué.

Dosage immunoenzymométrique au sens strict (IEMA = immuno


enzymometric assay)

Dans cette technique, la première étape a lieu en phase homogène : l'antigène


à doser est mis en présence d'un excès d'anticorps marqué. On met ensuite le
milieu en présence de l'antigène fixé sur un support solide (phase hétérogène)
de manière à révéler l'anticorps marqué qui ne s'est pas lié à l'antigène lors de
la première étape. Ici, A diminue avec [Ag].

3-3-2-Méthodes avec réactif limitant = méthodes par compétition

Méthodes en phase hétérogène :

Ce sont les techniques ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay). La


phase hétérogène est constituée par une phase solide (paroi du tube, de la
microplaque, billes magnétiques…) sur laquelle est fixé l'anticorps ou
l'antigène (ou haptène). La fixation peut être faite par simple adsorption (sur
le plastique) ou par différents types de liaisons plus spécifiques.
Ces méthodes nécessitent une étape de lavage pour éliminer l'excès de
marqueur qui ne s'est pas fixé.
Dosage d'un antigène (ELISA compétition)

N.B. Cette technique est la technique ELISA "vraie". On appelle aussi ELISA
les autres techniques immunoenzymatiques en phase hétérogène, par
extension.
Dosage d'un anticorps (ELISA compétition)

Méthodes en phase homogène

Conjugué haptène-enzyme : technique EMIT (Enzyme Multiplied


Immunoassay Technique) Dans ces méthodes (toutes trois servent à doser des
antigènes), il n'y a pas de phase de lavage. Dans les deux premiers cas, le
signal augmente avec [Ag], dans le troisième il diminue lorsque [Ag] croît.

L'antigène à doser entre en compétition avec l'haptène marqué pour la


fixation sur l'anticorps. Deux cas possibles :
- masquage du site actif de l'enzyme lors de la fixation de l'anticorps : activité
diminuée. A augmente avec [Ag].
- restauration de l'activité qui avait été diminuée par la conjugaison : activité
augmentée. A diminue avec [Ag].
N.B. Il existe de nombreuses variantes avec un conjugué haptène-substrat ou
haptène-inhibiteur…

Les enzymes utilisées en EIA

Elles doivent être faciles à obtenir et purifier, stables, et mettre en jeu une réaction produisant un
composé coloré (cas le plus fréquent).
Enzyme Source

Blanc d'œuf de poule


Lysozyme
Mitochondries de cœur de porc
Malate déshydrogénase
Bactérienne (Leuconostoc mesenteroides)
Glucose-6P déshydrogénase
Raifort
Peroxydase
Aspergillus niger
Glucose oxydase
Escherichia coli ou intestin de veau
Phosphatase alcaline
Escherichia coli
-Galactosidase
Organes électriques de torpille
Acétylcholinestérase

L'enzyme (marqueur) est couplée à l'antigène (ou haptène) ou à l'anticorps. Ce couplage doit préserver :
• le site actif de l'enzyme
• le site de liaison Ag ou Ac

Le couplage covalent direct est


réalisé à l'aide d'un réactif
bifonctionnel comme le
glutaraldéhyde, qui établit un
pont covalent entre deux atomes
d'azote (fonctions amines) des
protéines.

Le couplage indirect fait


intervenir deux molécules
présentant de l'affinité l'une pour
l'autre, chacune étant fixée par
un pont covalent à l'antigène
d'une part et à l'enzyme d'autre
part ; c'est le cas du système
avidine-biotine.

Les réactions enzymatiques

Enzymes Substrats Produits

Phosphatase alcaline PNPP (4-nitrophényl- PNP (4-nitrophénol) (jaune)


phosphate) incolore 405 nm
H2O2 + OPD Produit coloré (orange)
Peroxydase (orthophénylène
diamine) Produit luminescent

H2O2 + luminol
-galactosidase ONPG (2-nitrophényl - ONP (2-nitrophénol) (jaune)
galactoside) 405 nm

Glucose 6-phosphate Glucose 6-phosphate + NADH ou NADPH, 340 nm


déshydrogénase NAD+ ou NADP+

La révélation consiste à mesurer l'activité catalytique de l'enzyme : pour cela on mesure la vitesse
initiale de la réaction catalysée par l'enzyme, après addition du (des) substrat(s) de l'enzyme, et
incubation. En général, on travaille en méthode "2 points" : on dose le produit après addition d'un réactif
d'arrêt. Dans certain cas, on peut aussi procéder par méthode cinétique.
L'activité enzymatique est mesurée par spectrophotométrie d'absorption moléculaire, fluorimétrie ou
luminométrie.
On travaille le plus souvent dans des plaques de microtitration à 96 puits qui permettent de traiter un
grand nombre d'échantillons simultanément :

3-4-Les modes de calcul

Le principe général consiste à établir une courbe d'étalonnage avec des solutions contenant des
concentrations connues de l'antigène. On réalise donc à partir d'une solution-mère une série de dilutions
successives afin d'obtenir des concentrations finales différant d'un facteur 2 ou . Différents modes
de représentation sont utilisés pour ces courbes d'étalonnage.

Dosage par EIA de la 20-hydroxyecdysone (20E)

Le traceur est constitué par de la 20E couplée à la peroxydase. Deux modes de représentation sont
utilisés ici.
La représentation "classique" consiste à reporter B/Bo = f
(log[H]) qui donne une courbe dont la partie centrale est
relativement linéaire et permet de faire des
déterminations précises en particulier autour de la valeur
correspondant à B/Bo = 0,5.

La représentation dite log-logit consiste à utiliser en


ordonnées la fonction logit(B)= log (B/Bo-B)

On trace donc la fonction :


log (B/Bo-B) = f (log[H])
qui s'avère être une droite, à partir de laquelle il est plus
facile de faire les calculs (de toutes façons réalisés par un
programme informatique).

3-5-Applications

• Dosage de protéines à faible concentration : dosages spécifiques de certaines protéines


plasmatiques : IgE, ferritine, hormones protéiques : hCG…, marqueurs tumoraux : alpha-
foetoprotéine…
Les techniques en phase homogène permettent le dosage de molécules de petite taille (haptènes) :
hormones stéroïdes, hormones thyroïdiennes, médicaments…
• Recherche et dosage d'anticorps pour le diagnostic de maladies infectieuses (sérologie) : en
parasitologie (toxoplasmose…) et en virologie (virus de l'hépatite B, virus du SIDA…)

Bibliographie sommaire

Fisher, J., Arnold, J.R.P. (2001) L'essentiel en Chimie pour Biologistes. Berti Editions, Paris.
Jaussaud, P. (1996) L'exploration des molécules. Nathan Université, Paris.
Kamoun, P. Appareils et Méthodes en Biologie Moléculaire. Médecine-Sciences / Flammarion, Paris.
Mahuzier, G., Hamon, M. (1986) Abrégé de Chimie Analytique. Tome 2. Méthodes de séparation.
Masson, Paris.
Schwedt, G. (1993) Atlas de poche des Méthodes d’Analyse, Médecine-Sciences / Flammarion, Paris.

Les Technoscopes de Biofutur :

• La chromatographie liquide à haute performance. Supplément au N°52 (décembre 1986).


• Protéines : électrophorèse et électrofocalisation. Supplément au N°54 (février 1987).
• La chromatographie préparative basse pression. Supplément au N°59 (juillet-août 1987).
• Purification par les techniques d'affinité. 1ère partie : Stratégies de purification. Supplément au N°61
(octobre 1987).
• Absorptiométrie et fluorimétrie. Supplément N°15 au N°63 (décembre 1987).
• Analyse des électrophorégrammes bidimensionnels. Supplément N°17 au N°65 (février 1988).
• Le Western blot. Supplément N°19 au N°67 (avril 1988).
• Purification par les techniques d'affinité. 2ème partie. Supplément N°20 au N°68 (mai 1988).
• Chromatographie : les fluides supercritiques. Chemiluminescence et diagnostic. Supplément N°25 au
N°75 (janvier 1989).
• L'agarose. Supplément N°35 au N°88 (mars 1990).
• Nouvelles approches en chromatographie des biomolécules. Supplément N°36 au N°89 (avril 1990).
• Les macromolécules investies par la spectrométrie de masse. Supplément N°37 au N°91 (juin 1990).
• Electrophorèse capillaire : nouveaux développements à San Francisco. Supplément N°38 au N°93
(septembre 1990).
•La chromatographie assistée par ordinateur. Supplément N°40 au N°96 (décembre 1990).
• Electrophorèse bidimensionnelle des protéines. Supplément N°58 au N°123 (mai 1993).
• Electrophorèse en champs alternés de l'ADN. Supplément N°61 au N°127 (octobre 1993).
• La séparation sur billes de taille uniforme. Supplément N°76 au N°147 (juillet-août 1995).
• Chromatographie en phase liquide. Supplément N°78 au N°149 (octobre 1995).
• Spectrométrie de masse. Supplément N°89 au N°164 (février 1997).
• La chromatographie rapide. Supplément N°95 au N°170 (septembre 1997).
• L'électrophorèse capillaire. Supplément N°103 au N°178 (mai 1998).
• La chromatographie de partage centrifuge. Supplément N°104 au N°179 (juin 1998).
• Spectrométrie de masse en tandem. Supplément N°106 au N°181 (septembre 1998).
• La RMN des macromolécules. Supplément N°112 au N°189 (mai 1999).
• Les outils d'étude du protéome. Supplément N°115 au N°192 (septembre 1999).
• Bioessais, mycotoxines et risque alimentaire. Supplément N°125 au N°203 (septembre 2000).

Test ELISA : détection de la bêta-lactoglobuline bovine


 Introduction
 Protocole
 Résultats
 Fournisseur

 Introduction

Le test ELISA (acronyme de Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay) est un test immunologique
destiné à détecter et/ou doser une protéine dans un liquide biologique. Dans la technique de dosage
dite "en sandwich", les puits d’une microplaque sont tapissés avec un anticorps de capture capable de
lier spécifiquement l’antigène recherché. Lors de cette opération appelée coating, l'anticorps de
capture se fixe au plastique des puits par interaction électrostatique L'anticorps de capture assure la
spécificité du test. La solution à tester est ensuite déposée dans les puits de la microplaque et si
l'antigène recherché est présent il va se lier spécifiquement à l’anticorps de capture. Un deuxième
anticorps, l'anticorps traceur, capable de se lier à l'antigène capturé est alors ajouté dans le puits et les
anticorps traceurs non fixés sont éliminées par rinçage. L'anticorps traceur est couplé à une enzyme
catalysant la formation d'un produit coloré. La réaction peut ainsi être quantifiée par colorimétrie à
partir d'une courbe d'étalonnage réalisée avec des concentrations connues d'antigène puisque le
nombre de molécules d'anticorps traceur fixées dépend du nombre de molécules d'antigènes
immobilisées par l'anticorps de capture.
C’est le type de test utilisé notamment pour le dépistage de la séropositivité au virus VIH c'est à dire
pour mettre en évidence la présence d'anticorps anti-VIH dans le sérum. Toutefois, en clinique
humaine, lorsque le test est positif, il doit être confirmé par un immunotransfert (Western blot)
permettant d’identifier directement les antigènes du virus.
Dans le test présenté ici, produit sous forme de kit par l'Association des professeurs de biologie
géologie (APBG) en collaboration avec le Commissariat à l'énergie atomique (CEA), l'anticorps de
capture et l'anticorps traceur sont des anticorps monoclonaux dirigés contre deux épitopes différents
de la bêta-lactoglobuline bovine. L'anticorps traceur est couplé à une acétylcholinestérase de gymnote,
une enzyme particulièrement active. La révélation de l'activité enzymatique est réalisée avec la
méthode d'Ellman qui utilise un substrat artificiel, l'acétylthiocholine, dont l'hydrolyse conduit à la
formation de thiocholine. Cette dernière forme un dérivé coloré avec le DTNB (5-5'-dithiobis-[2
nitrobenzoate]) selon l'équation bilan suivante :
Acétylcholinestérase
Acétylthiocholine + H2O ----------------> Acide acétique + Thiocholine
Thiocholine + DTNB ---> 5-thio-2-nitrobenzoate + 2-nitrobenzoate-mercaptothiocholine
Incolore Jaune
Dans le kit fourni par l'APBG, les
barrettes de microtitration ont déjà
subi l’étape du coating et sont donc
prêtes à l’emploi. Elles sont placées
dans un support permettant
d'identifier les différents puits par
des lettres correspondant aux lignes
et des nombres correspondant aux
colonnes.
Les réactifs lyophilisés (anticorps
traceur, réactif d'Ellman,
lactoglobuline témoin) sont
reconstitués avec de l'eau distillée
selon les instructions données dans
le kit.
La recherche de la bêta-
lactoglobuline bovine peut être
menée sur du lait de vache ou sur
n'importe quel produit soupçonné de
contenir des traces de lait de vache.
Le test est suffisamment sensible
pour détecter la présence de
lactoglobuline dans un échantillon Barrettes de microtitration dans leur support
provenant d'un mélange d'une goutte
de lait de vache dans un litre d'eau
ou d'un extrait aqueux de produit
alimentaire solide (gâteau, biscuit,
etc.) comportant du lait dans sa
fabrication.
Elle peut servir aussi en classe à
simuler un test de dépistage de la
séropositivité à un quelconque agent
infectieux.
Protocole
Déposer dans les puits 100 µL des
solutions témoins (témoin positif :
lactoglobuline à 100 ng.mL-1, témoin
négatif : eau) et des solutions à tester
(lait de vache : 1 goutte de lait diluée
dans 1 L d'eau distillée, extrait
quelconque soupçonné de contenir la
protéine, etc.).
Ajouter 100 µL d’anticorps traceur
(conjugué à une enzyme,
l’acétylcholinestérase) dans chaque
puits.
Incuber 30 min à la température
ambiante.
Vider les puits en retournant les
barettes et les rincer avec une
pissette d’eau distillée pour éliminer
l’excès d’anticorps.
Vider l'eau de rinçage.
Déposer dans chaque puits 200 µL
de réactif d’Ellman (substrat de Quelques résultats
l’acétylcholinestérase). (voir les détails ci-dessous)
Incuber 10 min à température
ambiante.
NB Si on ne dispose pas de
micropipette de précision, délivrer
les réactifs avec une pipette Pasteur
munie d'une tétine à raison de deux
gouttes au lieu de 100 µL.
 Résultats

Une réaction positive se traduit par


une coloration jaune proportionnelle
à la quantité d’antigène immobilisé
par l’anticorps de capture.
Les résultats ci-contre correspondent
aux colonnes A à F des barrettes
numéros 3 et 5. Les échantillons
testés (100 µL) étaient les suivants :
A : témoin positif (lactoglobuline à
100 ng.mL-1)
B : témoin négatif (eau)
C : extrait aqueux de biscuit (1
biscuit dans 250 mL d'eau)
D : lait de vache UHT (1 goutte dans Détail des résultats : lignes 3 et 5
1 litre d'eau)
E : lait de vache stérilisé (1 goutte
dans 1 litre d'eau)
F : eau seule (pas de réactifs)

Kit comportant l'ensemble


des produits nécessaires :
APBG (Association des
Professeurs de Biologie
Géologie)
BP 8337
69356 Lyon Cedex 08
Téléphone : 04 78 74 47 22
Fax : 04 78 01 22 14
Auto-mmunité
Recherche des
ANA et méthodes
de confirmation
Lupus Allergie
Erythémateux EUROLINE
Disséminé et IgE
ADN Les Spécifiques
Maladies Sérologie infectieuse Gamme de
Thyroïdiennes Sérologie Bactérienne produits
Les Maladies Chlamydia Borrelia Treponema Bordetella Legionnella Liste des
Bio
Rhumatismales Bartonella Autres Bactéries allergènes
Advance
Accuei Les Maladies Sérologie Parasitaire ELISA IgE
Présentation Nouveautés
l Hépatiques Ecchinococcus Toxoplasma Autres Parasites Totales et
de la société
Dépistage des Sérologie Virale Spécifiques
Contacts
ANCAs et Virus Epstein Barr Cytomégalovirus Virus Herpes Microplaque
méthodes Simplex Virus Varicelle Zona Virus Respiratoire ELISA : IgE
d'identification Syncytial Autres Virus Totales
La Maladie ELISA
Coeliaque La Allercoat :
Maladie de Crohn IgE
Diabète Spécifiques
Diagnostic de
l'infertilité Autres
Maladies Auto-
Immunes

ELISA Sérologie Infectieuse


Principe du test
> Les puits de microplaque en polystyrène coatés avec des antigènes purifiés et
biochimiquement caractérisés sont utilisés comme phase solide contenant les antigènes
immobilisés.
> Si l'échantillon est positif, les anticorps spécifiques dans l'échantillon de sérum dilué se
lient aux antigènes couplés à la phase solide.
> Dans une seconde étape, les anticorps liés sont détectés avec des anticorps anti-
immunoglobulines humaines couplés à la peroxydase.
> Dans une troisième étape, les anticorps liés sont rendus visibles en utilisant une solution
chromogène/substrat capable de générer une réaction colorée. L'intensité de la coloration
produite est proportionnelle à la concentration de l'anticorps dans l'échantillon de sérum.
> L'ELISA "monospécifique" (immuno-dosages enzymatiques avec un seul antigène) fournit
un dosage quantitatif in vitro pour la détection des anticorps. L'ELISA "Profil" fournit un
dosage semi-quantitatif in vitro pour la détection de différents anticorps sur une seule
barrette de microplaque. La phase solide de l'ELISA "Pool" est coatée avec un mélange
d'antigènes utilisés pour la détection semi-quantitative des anticorps dont la spécificité
doit être analysée ensuite par des dosages monospécifiques.

Réalisation : les tests ELISA Bio Advance

> Réactifs prêts à l'emploi (sauf tampon de lavage concentré).


> Réactifs clairement identifiés par leur coloration :
 Rouge sombre: Calibrateur n°1
 Rouge: Calibrateur n°2
 Rouge clair: Calibrateur n°3
 Bleu foncé: Sérum de contrôle positif
 Vert: Sérum de contrôle négatif

 Bleu clair: Tampon échantillon


> Les conjugués sont identifiables par coloration :

 Anti-IgA couplé à la peroxydase : orange


 Anti-IgG couplé à la peroxydase : vert
 Anti-IgM couplé à la peroxydase : rouge
 Anti-IgGM couplé à la peroxydase : turquoise

 Anti-IgAGM couplé à la peroxydase : jaune


> Différents tests peuvent être réalisés sur une même microplaque, les temps d'incubation
(30 min, 30 min, 15 min) sont identiques pour la majorité des ELISA. Ceci présente un
avantage important lors de l'automatisation de ces techniques.
> Incubation à température ambiante.
> Compatibilité avec tous les lecteurs et les laveurs de microplaque et automates ELISA.
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Evaluation quantitative

> 3 sérums de calibration pour les tests quantitatifs :

 calibrateur n°1 : limite supérieure de la gamme de mesure


 calibrateur n°2 : valeur seuil (= limite des valeurs normales)

 calibrateur n°3 : négatif


> 1 sérum de calibration pour les tests semi-quantitatifs.
> 1 fiche de contrôle avec les valeurs cibles pour les calibrateurs et les sérums de contrôle,
lot dépendant.
> Interprétation simple par tous les logiciels ELISA.

> Barrettes emballées dans un sachet hermétique.


> Barrettes avec puits sécables (sauf pour les ELISA Profil).
> Nom abrégé de l'antigène imprimé sur chaque puits ou barrette afin d'éviter tout risque
d'erreur.
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Mode opératoire automatisable

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