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Département: Sciences Cliniques Unité: Médicine Tropicale de Laboratoire

Coloration des frottis sanguins aux colorants de


May-Grünwald et Giemsa
Projet/Étude: Non applicable

1. Terrain d’application
 Ce document fournit des instructions pour colorer des frottis sanguins au colorant de May-
Grünwald et Giemsa.
 Ce colorant panoptique sert à colorer les frottis sanguins pour la différentiation leucocytaire.

2. Responsabilités
Fonction Activités
Technicien de laboratoire  suit cette procédure
 est responsable de produire les colorants et de les stocker
correctement
 enregistre toutes les données dans le registre de laboratoire
 rapporte les problèmes techniques au laborantin coordonnateur
Laborantin coordonnateur  vérifie que les consommables sont stockés correctement
 vérifie que les techniciens de laboratoire suivent la procédure
 vérifie que les données sont correctement enregistrées

3. Références
 Manuel des techniques de base pour le laboratoire médical, OMS, 1982
http://www.labquality.be/documents/ANALYSIS/9242541451.pdf
 Notes pratiques ‘Parasitologie humaine tropical’, IMT, 2008, p. 106 - 108
http://www.labquality.be/documents/ANALYSIS/PARASITOLOGY/090803%20BIOLOGISTES%20MO
D1et2%20notes%20pratiques%20de%20parasitologie%20humaine%20tropicale.pdf

4. Procédure
4.1 Principe du test
Une fois secs, les frottis doivent être colorés pour pouvoir être examinés sous microscope. Cette procédure
décrit la coloration qui est nécessaire pour faire la différentiation leucocytaire. Les lames sont couvertes
premièrement de colorant de May-Grünwald et ensuite de Giemsa.
L’éosine, qui est acide, colore les éléments basiques tandis que le bleu de méthylène et l’azure, qui sont
basique, colorent les éléments acides.

4.2 Sécurité
Tous les frottis sanguins non fixés sont potentiellement infectieux. Respectez les précautions universelles.

4.3 Matériaux et consommables


 Des gants non-stériles, à usage unique
 Des frottis sanguins
 Le colorant de May-Grünwald (Merck N° 1.01424)
 Le colorant de Giemsa (Merck N° 1.09204)
 Deux agitateurs en verre placés au-dessus d’une cuve de coloration
 Une éprouvette de 50 ou 100 ml
 Une pissette contentant de l’eau tamponnée (pH 6.8 - 7.0)
 Minuterie
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 Un râtelier à lames
 De l’alcool méthylène (méthanol absolu)

4.4 Procédure
 Préparez chaque jour des colorants frais:
Note : On a besoin de 3 ml de colorant par lame.
o May-Grünwald : diluez le colorant ½ en mettant un volume égal de colorant et d’eau
tamponnée (pH 6.8 - 7.0) et mélangez bien.
o Giemsa: diluez le colorant 1/10 en mettant une part de colorant pour 9 parts d’eau
tamponnée (pH 6.8 – 7.0) et mélangez délicatement
Note : Ne secouez pas le colorant, car cela peut provoquer une précipitation

 Fixez l’étalement par couler 2 ou 3 gouttes de méthanol absolu sur le frottis disposé verticalement,
pendant 2 à 3 minutes.
 Couvrez le frottis sanguin de colorant de May-Grünwald dilué et laissez agir pendant 5 minutes.
 Egouttez le colorant, sans rincer, et remplacez-le par du Giemsa dilué.
Laissez agir pendant 10 minutes.
 Versez de l’eau tamponnée (pH 6.8-7.0) pour laver le colorant.
Note : N’inclinez pas la lame car il resterait un dépôt de colorant sur l’étalement.
 Laissez de l’eau propre sur la lame pendant 2 à 3 minutes pour obtenir une coloration différentielle.
 Laissez égoutter l’eau et faites sécher la lame sur une râtelier.
 Le frottis est prêt pour l’examiner au microscope sous immersion à l’objectif 100x.

4.5 Stockage et stabilité


Une fois dilués, les colorants ne conservent pas bien. N’en préparez que la quantité nécessaire pour une
journée.

4.6 Causes d’erreurs


 Pour éviter la formation de dépôts de colorants (des petites taches noires sur la préparation) et
pour éviter de mauvaises colorations (par exemple trop bleu, trop rose ou trop foncées), on doit :
o N’utiliser que de la verrerie parfaitement propre : lavez-la tous les jours, n’utilisez pas de
l’acide, enlevez les dépôts de colorant au méthanol
o Utiliser de l’eau neutre (tamponnée) préparée fraîche : une eau acide provoque une
coloration trop rose, une eau alcaline une coloration trop bleue
o Mélanger le Giemsa lentement. S’ils est secoué, les colorants précipitent.
 Si la coloration n’est pas réussie, on doit :
o Pour les dépôts de colorants qui sont visibles à l’œil nu dans le liquide sur la lame, et qui
sont dus au colorant de May-Grünwald ou à l’eau tamponnée :
Égouttez le colorant et rincer la lame deux fois au méthanol. Séchez et refaites la
coloration avec un colorant fraîchement préparé.
o Pour les dépôts de Giemsa qui sont visibles à l’œil nu ou au microscope :
Rincez également au méthanol mais lavez immédiatement à l’eau tamponnée. Séchez
et recommencez complètement la coloration.
o Si la lame est trop bleue (basophilie exagérée) :
Préparez une solution d’acide borique à 1% dans de l’alcool à 95°. Rincez la lame 2 fois
dans cette solution. Lavez la lame à l’eau tamponnée. Séchez la lame et examinez-la à
nouveau au microscope sans autre traitement.

Appendices & formulaires à compléter


Numéro Titre
Non applicable -
Révision
Version initiale
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Nom et fonction Date Signature


Auteur
Barbara Barbé 09/12/2011
Révisé par
Séverine Blesson 09/01/2012
Approuvé par
Jan Jacobs