UNIVERSIDAD CENTRAL “MARTA ABREU” DE LAS VILLAS

VERITATE SOLA NOBIS IMPONETUR VIRILIS TOGA. 1948

FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS

DEPARTAMENTO DE AGRONOMÍA

Tesis en opción al Título de Ingeniero Agrónomo

Empleo de reguladores de crecimiento en la aclimatización in vitro y

ex vitro de plantas de papaya (Carica papaya L.) provenientes de
Embriogénesis Somática.

Autor: Alfredo Pérez Castellón

Tutor: M.C. Laisyn Posada Pérez

Consultante: Dr.C. Rafael Gómez Kosky

Santa Clara
2014
 Hago constar que el presente trabajo de diploma fue realizado en la Universidad
Central “Marta Abreu” de Las Villas como parte de la culminación de estudios de la
especialidad de Ciencias Agronómicas, autorizando a que el mismo sea utilizado por la
Institución, para los fines que estime conveniente, tanto de forma parcial como total y
que además no podrá ser presentado en eventos, ni publicados sin autorización de la
Universidad.

Firma del Autor

Los abajo firmantes certificamos que el presente trabajo ha sido realizado según
acuerdo de la dirección de nuestro centro y el mismo cumple con los requisitos que
debe tener un trabajo de esta envergadura referido a la temática señalada.

Firma del Autor Firma del Jefe de Departamento

donde se defiende el trabajo

Firma del Responsable de

Información Científico-Técnica
Pensamiento
Ahora dicen que el hombre no debe parecerse a sus obras. Yo creo que sí; es así
como el Hombre y la obra se vuelven todavía más fuertes.

Adéle Foucher
Dedicatoria.
A mis padres, por creer en mí.
Agradecimientos.
A Dios por la fuerza que me ha dado

A mis padres por su esfuerzo y sacrificio para mi formación académica.

A toda mi familia que de una forma u otra me ayudaron a permanecer.

A mis tutores, M.C. Laisyn Posada Pérez y Dr.C. Rafael Gómez Kosky.

A las chicas del laboratorio de micropropagación y en especial a la Ing. Yeny Padrón.

A los profesores de la Facultad de Ciencias Agropecuarias que de una forma u otra me han
formado y educado, no solo con el conocimiento también la formación del carácter y
personalidad durante los 5 años de la carrera.

A los investigadores y trabajadores de Instituto de Biotecnología de las Plantas por su amistad y

la ayuda que he recibido en el tiempo que he trabajado aquí.

A mis compañeros de aula: Yamila, Hien, Rosalí, Diana, Urbano, Hianny, Ramón, Alberto,
Dairon, Domingo, Alejandro Pérez, Alejandro Orduña y Dorivaldo por su amistad.

A todos, muchas gracias.

RESUMEN.
El cultivo de la Papaya (Carica papaya L.) constituye un renglón importante para el
incremento de los ingresos a la economía nacional cubana, por concepto de consumo
por la población del fruto. El desarrollo de la embriogénesis somática en papaya en
medios de cultivo semisólidos nos brinda una novedosa alternativa para la propagación
de esta especie. El empleo de los medios de cultivo en estado semisólido combinado
con elementos reguladores del crecimiento (Pectimorf® y Fluoroglucinol®) podría
incrementar la germinación y mejorar la calidad de las plantas para su conversión en
condiciones ex vitro. Para ello se propusieron los siguientes objetivos, determinar el
efecto del producto cubano Pectimorf ® y el Fluoroglucinol® en el enraizamiento y la
aclimatización in vitro de plantas de papaya. Se evaluaron a los 37 días de cultivo las
siguientes variables morfológicas: Altura de la planta (cm), número de hojas, número de
entrenudos, enraizamiento (%), número de raíces, longitud de la raíz más larga (cm),
peso fresco de la planta in vitro (gMF), presencia o no de callo basal, número de
estomas totales (% de estomas abiertos y cerrados) tomado de las muestras a las 12 m
del mediodía, área Foliar. En la fase de aclimatización se empleó como sustrato 90 %
de zeolita y 10 % de compost de cachaza de caña de azúcar. Estos componentes
fueron colocados en macetas de plástico de 500 mL de volumen total. Primero se
depositó en el fondo el compost y encima la zeolita para garantizar una buena aireación
de las raíces de la plantas de papaya. Se alcanzó un buen desarrollo radical en las
plantas procedentes de embriogénesis somática en los diferentes tratamientos de Sin
embargo, el mejor resultado en cuanto al desarrollo morfológico de las plantas se
obtuvo con , la concentración de 10 mg.L-1 por alcanzar un 100 % de enraizamiento en
solo 27 días de cultivo.
ÍNDICE.
1. INTRODUCCIÓN ………………………………………………………………..……1
2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA………………………………………………………...5
2.1. Características botánicas y sistemáticas generales del papayo…………….5
2.2. Ubicación taxonómica…………………………………………………………….6
2.3. Descripción de las variedades fundamentales cultivadas en Cuba………...6
2.4. Caracterización del cultivar de papaya Maradol roja…………………………..7
2.5. Cultivo in vitro……………………………………………………………………...9
2.5.1. ¿Que es la micropropagación?..................................................................9
2.5.2. Fases de la Embriogénesis Somática………………………………………10
2.5.3. El desarrollo de un sistema experimental para la regeneración
de plantas vía embriogénesis somática incluye las siguientes fases…...11
2.5.3.1. Formación de los embriones somáticos……………………………….11
2.5.3.2. Desarrollo de los embriones somáticos………………………………...12
2.5.3.3. Proliferación de los embriones somáticos……………………………...13
2.5.3.4. Maduración de los embriones somáticos……………………………….13
2.5.3.5 Germinación y conversión de los embriones somáticos en plantas….14
2.6. Fases de la Micropropagación…………………………………………………....15
2.7. Aclimatización…………………………………………………………………........18
2.8. La Embriogenesis Somatica en papaya………………………………………….21
2.8.1.Aclimatización in vitro…………………………………………………………..22
2.8.2. Enraizamiento in vitro………………………………………………………….23
2.8.3. Enraizamiento ex vitro…………………………………………………………23
2.9. Anatomía de las plantas cultivadas in vitro y su influencia sobre la
aclimatización ………………………………………………………………………24
2.9.1.Enraizamiento…………………………………………………………………...24
2.9.2. Factores morfológicos que influyen en la aclimatización.…………………24
2.9.3. Cutícula…………………………………………………………………………27
2.9.4. Estomas…………………………………………………………………………27
 2.9.5. Raíces………………………………………………………………………….28
2.10. Aspectos fisiológicos y bioquímicos generales. Fisiología y bioquímica
del cultivo in vitro………………………………………………………………….29
2.11.Factores que influyen en la embriogénesis somática………………………..30
2.11.1 Genotipo……………………………………………………………………….30
2.11.2.. Explante……………………………………………………………………...31
2.11.3. Medio de cultivo……………………………………………………………...31
2.11.4 Reguladores de crecimiento………………………………………………...32
2.11.5. Condiciones de cultivo………………………………………………………33
3. MATERIALES Y MÉTODOS…………………………………………………………34
3.1. Efecto de la sacarosa, la auxina y el Pectimorf® en el enraizamiento y
la aclimatización in vitro de los brotes de papaya……………………………39
3.2. Efecto del Floroglucinol en el enraizamiento y la aclimatización in vitro
de los brotes de papaya………………………………………………………..40
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN……………………………………………………….43
4.1. Efecto de la sacarosa, la auxina y el Pectimorf ® en el enraizamiento
y la aclimatización in vitro de los brotes de papaya………………………….43
4.2. Efecto del Floroglucinol® en el enraizamiento y la aclimatización in vitro
de los brotes de papaya…………………………………………………………..50
5. CONCLUSIONES……………………………………………………………………….56
6. RECOMENDACIONES………………………………………………………………...57
7. BIBLIOGRAFÍA……………………………………………………………………….58
Introducción
1. INTRODUCCIÓN

A escala mundial con el aumento poblacional y el alza de los precios de los

productos de origen agrícola, unido al recrudecimiento del bloqueo económico y
financiero impuesto por los Estados Unidos, nuestro país se vio en la necesidad
de trazar nuevas estrategias para sustituir productos importados, e incrementar las
producciones agrícolas.
La papaya (Carica papaya L.) es originaria de América Central y su cultivo se
caracteriza por ser productivo en corto tiempo y de forma continua durante todo un
año. Es una de las frutas tropicales que abarca el sur de México hasta Costa Rica
en América Central, de alta demanda en Cuba y en el mundo. En los primeros
tiempos de la conquista se distribuyó rápidamente por todas las Antillas y
Sudamérica (Mendoza, 2005). Se plantea que esta es una de las frutas más
cultivada en los países tropicales. Es en el noreste de América del Sur, en la
Vertiente Oriental de los Andes, donde se localiza la mayor diversidad de especies
del género Carica (Mendoza, 2005).
En Cuba se han utilizado diferentes variedades que se han distinguido unas de las
otras por su porte, su susceptibilidad a plagas y enfermedades, por la composición
de las inflorescencias (masculinas, femeninas y hermafroditas), forma, tamaño,
color, sabor y consistencia de los frutos. Según el Ministerio de la Agricultura
(MINAG, 2005) las variedades comerciales que se utilizan en Cuba son: Maradol
Roja, NICA III y Criolla y se estudian otras variedades introducidas tales como
Tainung No.1, Tainung No.2, Tainung No.3, Know You y el híbrido Red Lady.
La papaya se propaga tradicionalmente por semillas y esquejes. Sin embargo, los
híbridos resultantes de los trabajos de mejoramiento genético para aumentar la
calidad de las producciones pueden tener problemas en su propagación y
conservación a través de semillas certificadas, por lo tanto estos tienen que ser
multiplicados vegetativamente. Las técnicas de cultivo de tejidos como la
micropropagación (Fitch et al. , 2005) y la embriogénesis somática (Banerjee,
2002) se han puesto a punto para la propagación in vitro de esta especie. No
obstante, Drew y Manshardt (1997) refieren que la multiplicación in vitro de la

1
papaya solo se justifica económicamente si la misma se realiza para un genotipo
híbrido.
La embriogénesis somática ofrece mayores posibilidades de obtener volúmenes
de producción superiores en un menor período de tiempo, lo cual la convierte en
un método más eficiente que la regeneración vía organogénesis (Villalobos y
Torpe, 1991). Como sistema de propagación de plantas presenta una serie de
ventajas entre las que se encuentran una enorme capacidad de multiplicación
aplicable industrialmente, permite obtener en un solo proceso estructuras
completas con ápice y raíz, que pueden ser almacenadas y encapsuladas
perfectamente. Todos estos conocimientos tienen su aplicación en la propagación
y mejora genética de plantas, en el saneamiento de patógenos, en el intercambio y
conservación de germoplasma y en ingeniería genética.
En el cultivo de la papaya la embriogénesis somática de forma directa es la más
utilizada tanto para la micropropagación, como para el mejoramiento genético con
el uso de técnicas de transformación genética (Cabrera-Ponce et al ., 1995;
Posada, 1995; Mahon et al ., 1996; Castillo et al ., 1998; Cai et al ., 1999; Del Sol
et al ., 2001; Banerjee, 2002).
En las últimas décadas la Embriogénesis Somática (ES) ha sido desarrollando en
cierto modo para la multiplicación rápida de muchas plantas, eso cambió de la
curiosidad simple al interés real del laboratorio para su producción industrial. El
éxito de cualquiera en la propagación in vitro procese en una balanza comercial
que depende de la habilidad de regenerar un número alto de plantas (a un costo
bajo) y que al llevarlo a condiciones de ex vitro se asegure una alta supervivencia
(Barry-Etienne el al del et. 2002; Hazarika 2006). Sin embargo, la aclimatación
continúa siendo un cuello de botella mayor en el la aplicación comercial de
protocolos de la Embriogénesis Somática y un alto porcentaje de plantas que se
pierden o se dañan luego de ser transplantadas desde la fase de in vitro a la de
ex vitro (Pospisilova et al. 1999).
De una manera general, las plantas obtenidas por Embriogenesis Somatica
(embriones) se regenera en un medio de cultivo semi-sólido y después son
aclimatadas en el exterior una vez que las plantas posean sus hojas y su sistema
2
radical. Estas condiciones frecuentemente producen la formación de plantas con
una morfología, anatomía y una fisiología anormal (Hazarika 2006). De hecho,
estas plantas son a menudo caracterizado por una pobre eficiencia fotosintética y
el retraso en el desarrollo de la cutícula y del aparato estomático (Pospisilova et al.
1999; Hazarika 2006).
La aclimatización de plantas in vitro a las condiciones naturales, es un paso crítico
para muchas especies y requiere tiempo e instalaciones caras que restringen la
aplicación comercial de los procesos de micropropagación. Estas plantas
muestran un rápido marchitamiento cuando se transfieren a condiciones de
invernadero, por lo tanto debe mantenerse una humedad relativa alta en el nuevo
ambiente, para no dañar los mecanismos que mantienen el volumen de agua en la
planta (FILA et al.,1998).
El problema científico:
El mayor problema que existe a nivel mundial en el cultivo in vitro de papaya es la
aclimatización de las plantas regeneradas, donde se pierde más del 70% de las
plantas producidas in vitro antes de poder ser plantadas en campo.
Hipótesis:
Si se logra mejorar la calidad fisiológica de las plantas de papaya provenientes de
Embriogénesis Somática en la fase final de la etapa in vitro entonces, se podrá
incrementar los porcentajes de supervivencia en la fase de aclimatización.
Objetivo General.
Evaluar la aclimatización in vitro en plantas de papaya var. Maradol roja obtenidas
por embriogénesis somática empleando dos nuevos reguladores del crecimiento.
Objetivos Específicos.
1.-Determinar el efecto del Pectimorf® en el enraizamiento y la aclimatización in
vitro de plantas de papaya.
2.- Determinar el efecto del producto Fluoroglucinol® en el enraizamiento y la
aclimatización in vitro de plantas de papaya.

3
Revisión Bibliográfica
4
2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA.

2.1. Características botánicas y sistemáticas generales del papayo.

La Carica papaya L. es una planta herbácea arborescente, de rápido crecimiento,

cuyo tallo recto y cilíndrico puede alcanzar en la madurez alturas de 10 m,
generalmente es un tallo único, sin embargo, ramifica cuando se elimina el punto
apical o cuando las plantas llegan a la vejez. El tronco está compuesto de un tejido
carnoso, el cual se va endureciendo conforme va creciendo, una de las
manifestaciones son las cicatrices que van dejando los pecíolos al desprenderse
(Guzmán, 1998). Las hojas son alternas y aglomeradas en el ápice del tronco y
ramas, de pecíolo largo, lisas, más o menos palmeadas, con venas medias y
robustas; por el haz, la hoja es de color verde oscuro o verde-amarillo, brillante,
marcada por nervaduras de color blanco amarillento y las venas reticuladas.

Las flores son grandes, blancas con cinco pétalos y cinco sépalos. Nacen en el
tallo, cerca de la inserción de las hojas al mismo. Pueden ser de sexo masculino,
sin ovario desarrollado; femenino, sin estambres y hermafroditas, con estambres y
ovarios. El sexo de las flores determina el de las plantas y en consecuencia la
producción y características de los frutos (ACTAF, 2010).

Las plantas femeninas generalmente producen frutos grandes de forma ovoide

que tienen carne relativamente delgada, de buena calidad y textura, las plantas
bisexuales producen frutos más pequeños de forma elipsoidal o cilíndrica, con
carne más gruesa, de calidad ligeramente inferior y las plantas masculinas
producen pocos frutos y pequeños, por lo general mal formados y sin valor (Osche
et al., 1980).

El fruto de la papaya es una baya proveniente de un ovario súpero, de pericarpio

carnoso y suculento, cuyo color puede variar desde amarillo hasta rojo. (Guzmán,
1998). Los frutos pueden ser de diferentes formas y tamaños, desde casi esféricos
o redondeados, cilíndricos o alargados y con pesos que oscilan entre los 200g y
800g

5
Los frutos maduran entre 4 y 6 meses dependiendo del clima y del cultivo. Durante
el desarrollo, la relación pulpa/piel se incrementa en 1.5-2.5 meses, luego avanza
de forma constante hasta la maduración y declina al final de este período. El
estado de madurez está caracterizado por el cambio de color de la piel.

El sistema radicular lo componen, unas pocas raíces grandes, poco profundas,

con una estructura semejante a la del tallo, pero de coloración blanca y provista de
muchas raicillas alimentadoras (López, 1992).

2.2. Ubicación taxonómica

División: Magnoliophyta

Clase: Magnoliosida

Subclase: Dilleniidae

Orden: Violales

Familia: Caricaceae

Género: Carica

Especie: Carica papaya L.

2.3. Descripción de las variedades fundamentales cultivadas en Cuba.

Según (MINAG. 1994) en Cuba han desaparecido muchas de las variedades que
tradicionalmente existían y se cultiva actualmente en forma intensiva la Maradol
Roja, Maradol Amarilla y la INIVIT fb-2000.

Existen además diversos cultivares entre los cuales los más destacados
son:

 Maradol Roja: variedad de origen cubano de maduración temprana, de frutas

consistentes con peso promedio de alrededor de 1,50 kg., de forma oblonga y
pulpa roja con un brix de 11%. Muy productiva y de excelente sabor.

6
(Rodríguez, 1967) refiere que el fruto de esta variedad es muy resistente al
embarque, se utiliza mucho en la industria y el consumo fresco.

 Maradol Amarilla: variedad de origen cubano, de maduración temprana, de

frutos consistentes con peso promedio de alrededor de 1.50 a 2.5 kg. De forma
oblonga y pulpa amarilla: muy productiva y de excelente sabor.

 Nika III: cultivar de procedencia Nicaragüense, frutos de forma alargada algo

deformes, su pulpa de color rosado pálido a intenso, algo insípido y muy jugoso.
Peso medio de 5.5 kg y su altura puede sobrepasar hasta los 6 m.

 Tainung 1, 2 y 3: híbridos obtenidos por la Estación Experimental de Fengshan

es formarse a partir de cruzamientos de Sunrise Solo con otras formas de pulpa
rojas procedentes de Costa Rica y Tailandia.

 INIVIT fb – 2000 Enana: variedad obtenida en el INVIT. Produce frutos de

forma oblonga, muy productivas, de mesocarpio rojo con un Brix entre 10 y 13
%. El peso promedio varía entre 0.5 y 2.0 kg/ fruto. De bajo porte (0.65-0.95m).

2.4. Caracterización del cultivar de papaya Maradol roja.

Maradol Roja. Desde el punto de vista sexual, una plantación de “Maradol Roja”,
originaran semillas de altas calidad, debe presentar 66,6% de plantas
hermafroditas, 33,38% femeninas y 0,014% masculinas cuando aparezcan deben
eliminarse. Este cultivar ha destacado en los últimos años, presenta un
mesocarpio de gran espesor, además de su sabor y valores nutricionales, el
nombre del cultivar “Maradol” proviene del nombre de su creador Adolfo y su
esposa María. El mejorador cubano Adolfo Rodríguez Rivera fue el creador de
este cultivar. El cruzamiento fue realizado en 1950 entre dos líneas de la papaya
observadas por el creador: “Corralillo”, de gran rusticidad y productividad, sabor
algo insípido; tallo y pecíolos morados, mesocarpio de color rojo salmón y la
“Oriental”, de exquisito sabor, mesocarpio amarillo, tallo y pecíolos con predominio
de color verde. El nuevo material genético obtenido de este cruce presentó gran
7
cantidad de segregaciones y resultó trabajar en su fijación por diez generaciones,
hasta lograr la variedad con los atributos que hoy presenta variedades comerciales
“Maradol Roja” (la más popular y difundida) y “Maradol Amarilla muy atractivos
para el consumidor, sus excelentes cualidades de comercialización y por la
rentabilidad que ofrece al productor (Guzmán, 1998).

Es este el cultivar más precoz, ya que su floración inicia aproximadamente a los

tres meses y su cosecha alrededor de siete meses después del trasplante y puede
mantenerse con interés comercial de 16- 20 meses o más. La fructificación inicia a
menos de 0.50 m sobre el nivel del suelo. Son plantas de porte bajo de 1.20– 1.70
m de altura del nivel del suelo a la yema apical (cogollo), al momento de iniciar la
cosecha y puede llegar hasta 2.30 m en plena producción. Tiene un alto potencial
de producción, ya que se ha logrado producir arriba de 200 t/ ha, en condiciones
óptimas se obtienen alrededor de 120 t/ ha. El peso promedio de los frutos es de
1.5– 2.6 Kg, prevalecen los frutos alargados (hermafroditas), siendo el tamaño y
forma muy adecuados para su comercialización. El exterior de las frutas es
amarillo – anaranjado brillante, su interior es de color rojo salmón intenso,
característica muy apreciada por el consumidor. Adecuado contenido de azúcares
(aproximadamente 11g brix), su sabor es exquisito, la pulpa tiene una excelente
consistencia, siendo ésta una característica distintiva, un mesocarpio grueso, lenta
maduración y superficie lisa (MINAG. 1996.).

 Planta precoz de porte mediano, abundante follaje, entrenudos cortos

comienza la producción entre el sexto y séptimo mes, puede mantenerse
hasta 22 meses si se mantienen los controles de virosis.

 Rendimiento potencial 300 t/ha en un periodo de tiempo de 20 a 22 meses.

 Árboles con flores hermafroditas tipo IV (66 %), árboles con flores
femeninas tipo I (33 %), árboles con flores pentandrias e intermedias (tipos II
y III) se presentan en % inferiores al 1 % , los árboles con flores masculinas
(tipo VI) prácticamente no aparecen.

8
 Los frutos son de tamaño, entre 1.5 y 2.6 Kg, pulpa de color rojo salmón,
extraordinaria consistencia aún madura contrastando la dureza exterior con
la suavidad de la pulpa, esto le permite una alta vida de anaquel, el Brix
está sobre 11 %.

2.5. Cultivo in vitro.

El término cultivo in vitro se aplica a todo explante en medio de cultivo y

condiciones asépticas que incluye diversas técnicas cuyos métodos y fines son
muy diferentes. La técnica general consiste en tomar un fragmento de tejido
vegetal, colocarlo en un medio nutritivo y provocar (gracias a un equilibrio
adecuado de los elementos del medio de cultivo) directamente o tras manipulación
el desarrollo de una plántula. El conjunto de estas operaciones se desarrolla en
condiciones estériles y se seguirá por una aclimatización en medio tradicional. Y
todo esto debido a una propiedad de las células vegetales llamada totipotencia
celular, que significa que: toda célula vegetal viva con núcleo, capaz, cual fuere su
“especialización” del momento, de reproducir fielmente la planta entera de la cual
proviene. Cada célula posee entonces la totalidad del patrimonio genético de la
planta. (Boutherin y Bron, 1994)

2.5.1. ¿Qué es la micropropagación?

El fin de la micropropagación es el de reproducir en gran cantidad plantas

idénticas a la planta madre, y no teniendo la micropropagación influencia sobre la
calidad sanitaria de la planta propagada, es indispensable poseer como punto de
partida un material sano (Boutherin y Bron, 1994). Otras ventajas, la selección, ya
que a partir de un individuo notable, se puede comercializar rápidamente un clon
interesante, garantía de homogeneidad, además limita o suprime Las plantas
madre y por consiguiente libera superficies de invernadero y permite la
programación de cultivos a lo largo de todo el año, o la producción en períodos
muy precisos, sin que el número de plantas madre o su estado por reposo
vegetativo tengan influencia y por último, la formación de un “banco de genes”

9
que podrán conservar especies o cultivares que ofrezcan un interés agronómico,
hortícola, industrial, ecológico, etc.

También Margara (1988) hace alusión a algunos factores negativos, que se

puede obtener “variantes” distintas a la planta madre por su morfología o fisiología,
la necesidad de usar determinados tejidos para una especie dada. Tal como
Boutherin y Bron (1994), mencionan el costo como desventaja ya que en una
planta in vitro es más elevado que el de aquella multiplicada por métodos
tradicionales. Sin embargo, este inconveniente se compensa con frecuencia con
una ganancia de productividad, el riesgo de mutación porque la tasa de
variabilidad es más elevada, por último, las dificultades de éxito, cierto número de
vegetales se multiplican fácilmente in vitro, otros permanecen más recalcitrantes a
esta técnica, en especial en las especies leñosas.

2.5.2. Fases de la Embriogénesis Somática.

Detalles morfológicos han revelado la existencia de 4 fases. Las fases 0, 1, 2 y 3

pueden ser reconocidas desde las etapas tempranas de la embriogénesis.

Durante la fase 0: La competente célula aislada por continuas divisiones forma los
agregados celulares embriogénicos (estado 1), con la presencia de auxina en el
medio de cultivo. En este tipo, los agregados de células formadas desde las
células aisladas ganan la habilidad para el desarrollo de embriones cuando la
auxina se elimina del medio, dando lugar al estado 1 de agregados celulares
anteriormente señalados.(Pérez et al; 1998)

Fase 1: Es inducida por la trasferencia de los agregados celulares en estado 1

al medio libre de auxina. Durante la fase 1 la proliferación de los agregados es
relativamente lenta y aparentemente sin diferenciación durante los 3 días después
de trasferidos a medio sin auxina. (Pérez et al; 1998)

Fase 2: Después de la fase 1 ocurre una rápida división a los 3 a 4 días del
cultivo en ciertas partes del agregado celular, dando lugar a la formación del
embrión en estado globular esta fase es designada fase 2, donde el tiempo de

10
división de 1 célula es de solamente 6.3 horas en relación a la fase 1 donde es de
51 horas. En esta fase ocurre una rápida división celular en cierta parte del
agregado producto de la polarización de la síntesis de ADN, dando lugar al
embrión globular y su suspensor en la zona que no ocurrió división. En la fase
final. (Pérez et al; 1998)

Fase 3: Sigue el continuo desarrollo del embrional estado de corazón y torpedo.

Como anteriormente señalamos esto es especifico de las especies dicotiledóneas
(R. Gómez, 1998)

2.5.3. El desarrollo de un sistema experimental para la regeneración de

plantas vía embriogénesis somática incluye las siguientes fases:

 Formación de los embriones somáticos.

 Desarrollo de los embriones somáticos.

 Proliferación de los embriones somáticos.

 Maduración de los embriones somáticos.

 Germinación y conversión de los embriones somáticos en plantas.

(von Arnold et al., 2002).

2.5.3.1. Formación de los embriones somáticos

La Inducción del proceso consiste en la terminación del patrón de expresión de los

genes presentes en el tejido del explante; siendo reemplazado por un programa de
expresión del gen o genes de la embriogénesis en aquellas células del tejido del
explante, los cuales pudieran dar lugar a embriones somáticos (Gómez, 1998).

Según, Parrot (2002), la inducción del estado embriogénico incluye la inducción de

los mismos mecanismos genéticos que conllevan a la embriogénesis cigótica.
Contrariamente a los embriones cigóticos los embriones somáticos no contienen
un nuevo grupo de genes sino que poseen la misma combinación genética de la
planta fuente del explante.

11
El empleo de la auxina es la mejor manera de inducir la formación de células
embriogénicas a partir de células somáticas. La inducción de la división celular
como una respuesta a esta auxina puede resultar en un callo con crecimiento
desorganizado o bien en un crecimiento polarizado coordinado para la formación
de un embrión somático (Gómez, 1998).

Autores como Souter y Lindsey (2000) mencionan que la fase de formación y

diferenciación de los embriones es crucial, aquí se determinan y especifican los
patrones de polaridad del eje apical-basal para el desarrollo de los ápices caulinar
y radicular del embrión somático.

En algunas especies monocotiledóneas, como trigo (Triticum sativum L.)

obtuvieron un incremento en la formación de callo con estructuras embriogénicas
(92,20%) cuando se sustituyó 10 µM de 2,4-D por 1,0 µM de (AIA) después de 22
días de iniciado el cultivo. Por otra parte, Özgen y Birsin (2002) en genotipos de
avena (Avena sativa L.) indujeron la formación de callos en embriones cigóticos
inmaduros (95,0 %) y embriones cigóticos maduros (88,3 %) con una
concentración de 9,05 µM de 2,4-D. Los mismos autores mencionan que la
respuesta estuvo fuertemente influenciada por el genotipo.

Komamine et al. (2005) indicaron que cuando las células somáticas expresan su
potencial embriogénico y son cultivadas en un medio de cultivo libre de auxinas
ellas se elongan y se diferencian, dando lugar a la siguiente fase.

2.5.3.2. Desarrollo de los embriones somáticos

La etapa temprana o pre-globular de los embriones somáticos son fácilmente

reconocidos generalmente por el contenido de citoplasma denso y la ausencia
general de vacuolas (Krikorian, 1995). Durante esta fase las auxinas son
inhibitorias para el desarrollo de los agregados celulares embriogénicos a
embriones somáticos (Halperin, 1995).

Fujimura y Komamine (1980) mencionan que para las especies monocotiledóneas

existen las fases 0, 1 y 2; pero la fase 3 no, pues no se diferencian a etapas de

12
corazón y torpedo, sino que el embrión globular sufre un proceso de transición
(etapas escutelar y coleoptilar), en el cual se alarga hasta llegar a formarse el
embrión somático maduro.

2.5.3.3. Proliferación de los embriones somáticos

Uno de los aspectos más importantes de la embriogénesis somática que permite

su aplicación en la propagación masiva y la transferencia de genes es la habilidad
de los cultivos embriogénicos de muchas especies de plantas a proliferar o
multiplicarse indefinidamente (Merkle et al., 1995).

El factor más fuerte asociado con la proliferación continua de las células

embriogénicas es la auxina. Sin embargo, parece que el efecto de este regulador
de crecimiento no puede ser considerado independiente a la reducción de la
concentración de nitrógeno, ya que existen evidencias de la interacción entre
ambos (Gómez, 1998). Además el nivel de auxina necesario para mantener la
embriogénesis somática repetitiva varía de acuerdo a la especie (Merkle et al.,
1995).

2.5.3.4. Maduración de los embriones somáticos

La fase de maduración es el período en el desarrollo del embrión somático en el

cual ocurre la expansión de la célula y la acumulación de sustancias de reserva y
se adquiere tolerancia a la deshidratación (Raghavan, 2000). En esta fase el
nitrógeno es fundamental en el medio de cultivo, siendo necesaria la adición de
nitratos, amonio y aminoácidos. Mc.Kersie y Bowley (1996) encontraron que al
añadir prolina al medio de cultivo se favorece el número y el tamaño de los
embriones somáticos de alfalfa (Medicago sativa L.) en etapas avanzadas,
mientras la glutamina y la arginina sólo incrementan el tamaño del embrión
somático. De la misma forma, Perán-Quesada et al. (2004) refieren que la correcta
acumulación de reservas conlleva a un incremento en la masa seca de los
embriones somáticos lo que indica una alta calidad en el vigor e influye
positivamente en su posterior germinación.

13
Los carbohidratos entre ellos la sacarosa en concentraciones de 3 - 6 % son
esenciales, junto a bajas concentraciones de oxígeno en la atmósfera gaseosa en
el frasco de cultivo, lo cual permite una maduración total y evita la germinación
precoz (Merkle et al., 1995).

2.5.3.5 Germinación y conversión de los embriones somáticos en plantas

Barbón, (2001) define la germinación como el proceso mediante el cual los

embriones somáticos emiten brote y raíz, y al desarrollo de plantas completas en
condiciones ex vitro a partir de embriones somáticos, conversión.

Las primeras señales de la germinación de los embriones somáticos lo constituyen

la elongación del hipocótilo, desarrollo del color verde de los cotiledones y la
elongación de la radícula (Canhoto et al., 1999).

La adición de citoquininas en el medio de cultivo según Merkle et al. (1995) es

importante para estimular la germinación, estas contrarrestan el efecto provocado
por las auxinas durante la formación y la multiplicación de los embriones
somáticos. En ocasiones, al colocar los embriones somáticos directamente de las
condiciones de maduración a germinación no se han alcanzado los resultados
esperados en cuanto a la germinación de los mismos.

En la primera fase de la germinación ocurre la hidrólisis de las proteínas a

aminoácidos, los cuales son transportados e incorporados al embrión somático
para su desarrollo. Estos aminoácidos son empleados en los procesos de síntesis
enzimática durante el crecimiento del embrión somático (Garin et al., 2000).

Algunos autores, sugieren el empleo de tratamientos con temperaturas frías,

desecación y aplicaciones de ácido giberélico durante la fase de maduración para
mejorar la germinación de los embriones somáticos (Das et al., 2002).

Se ha informado que la germinación y la regeneración en plantas a partir de

embriones somáticos es baja en muchas especies, debido a las anormalidades
estructurales que pueden presentar los embriones somáticos durante su desarrollo
(Lee et al., 2002).

14
2.6. Fases de la Micropropagación.

En la propagación comercial pueden identificarse cinco etapas bien definidas con

sus objetivos específicos:

Fase 0: Preparativa. En esta etapa se incluye la selección de la planta

donadora y una serie de pretratamientos en condiciones higiénicas
controladas, cuyo objetivo es mejorar la eficiencia en la implantación y el
desarrollo posterior de los cultivos in vitro. La selección de estos individuos se
debe realizar en bancos de germoplasma de alta calidad genética y fitosanitarias o
en plantaciones destinadas a semillas, con adecuada agrotécnia y sistemas
fitosanitarios preventivos establecidos, esto es lo ideal. Resultaría además de gran
facilidad realizar la selección en plantaciones de vitroplantas, donde la utilización
de semillas sanas disminuye los niveles de infección de los campos. (Pérez et al;
1998)

Las pruebas de campo que permiten conocer la sanidad del material se realiza a
través de los síntomas exteriores en la especie a propagar. Pero hay que tener en
cuenta que los síntomas causados por diferentes agentes patógenos pueden
confundirse y en ocasiones ser similares, lo que evidencia que la sintomatología
no es un criterio seguro para identificar el patógeno involucrado, aunque es una
importante ayuda para detectar plantas enfermas en el campo. Aquellas plantas
que no muestran síntomas y están enfermas se les denominan portadoras
asintomáticas.

El cumplimiento de los requisitos de selección de plantas donadoras, así como el

aplacamiento de tratamientos en condiciones controladas, disminuye las entradas
de microorganismos en el proceso de propagación in vitro, aunque esto no es
sinónimos de plantas libre de enfermedades (Pérez et al, 1998)

Método de diagnostico:

La ejecución de de los programas de producción de vitroplantas, requiere de un

sistema de control y verificación de la calidad sanitaria de las plantas propagadas.

15
A través de los años, varios métodos de diagnósticos han sido desarrollados y
extensivamente divulgados en la literatura, algunos más sensibles que otros. Sin
embargo, en la práctica se requiere una combinación de sensibilidad, confiabilidad
y simplicidad, por esta razón serán tratados los métodos de diagnósticos que más
se utilizan y los más adecuados según su especificidad. (Pérez et al, 1998)

Fase I: Establecimiento o Iniciación de los cultivos. El objetivo de esta fase es

establecer cultivos axénicos y viables con los cuales iniciar el proceso de
propagación. El éxito en los métodos de propagación, a través de la biotecnología,
se sustenta sobre la base de obtener en un corto tiempo grandes volúmenes de
plantas de alta calidad genética y fitosanitaria. Los procesos de desinfección a los
cuales se somete el material vegetal durante la fase 0 de la micropropagación, son
suficientes para eliminar los microorganismos patógenos y no patógenos que se
encuentran en la superficie de las hojas. Las enfermedades sistémicas,
producidas por bacterias, virus, microplasmas y rickettsias pueden escapar y
diseminarse con el material que se propaga. Contar con un material de partida
óptimo, es el resultado de la integración de diferentes aspectos, tales como, la
selección adecuada en el campo de las plantas donadoras, la utilización de
técnicas de diagnostico confiables y métodos eficientes de saneamiento que
garanticen la eliminación del patógeno. (Pérez et al, 1998)

Fase II: Multiplicación. Es considerada la etapa más importante del proceso

donde se debe garantizar la propagación de los brotes y la estabilidad
genética de las plantas producidas. Esta es la fase más importante y determinante
en todo programa de propagación in vitro, es en ella que se realiza la verdadera
multiplicación o micropropagación de una especie o variedad definiéndose no solo
el número de plantas o propágalos a obtener, sino su calidad genética por ser esta
fase en las que se produce las variantes somaclonales. Como su nombre lo indica
el objetivo de esta fase es la producción del mayor numero posible de propágalos
(plantas, microtubérculos, microbulbillos) a partir de explantes (meristemos
apicales o axiales yemas axilares o adventicias), ya establecidos in vitro.
16
Generalmente el proceso se inicia desde plantas donantes seleccionadas sin
afectar las características y estabilidad genética de la variedad o clon. Existen tres
métodos por los cuales pueden lograrse estos objetivos (propagación en base a
yemas axilares, yemas adventicias y a través de la embriogénesis somática.
(Pérez et al, 1998)

Fase III: Enraizamiento. Su objetivo es preparar las plántulas para su re-

establecimiento en condiciones de suelo. Se caracteriza por ser la fase más
voluminosa de todo el proceso, pues en ella cada brote, esqueje o yema de forma
individual que se ha formado durante la fase de multiplicación, debe ser cultivada y
manipulada in vitro para que, además de crecer y desarrollar su seudotallo o tallo
con sus primeras hojas, forme y desarrolle varias raíces que le permitan comenzar
la absorción de nutrientes al trasplantarse sobre un sustrato enriquecido y
convertirse en una vitroplanta aclimatizada lista para llevarse al campo.

Si no se logra una uniformidad en la calidad de la vitroplanta que se produce in

vitro, ello creara problemas no solo en el desarrollo durante la aclimatización, sino
el rechazo que tiene el producto en su comercialización, ya sea que se
comercialice en la fase 3 o como vitroplanta ya lista para trasplante a campo (fase
IV) (Pérez et al, 1998)

Fase IV: Aclimatización. Es la fase final del proceso y por tanto su meta es
lograr plantas listas para su trasplante definitivo a campos comerciales de
producción, casas de vidrio o invernaderos (Brainerd y Fuchigami, 1981).

La aclimatización de plantas in vitro a las condiciones naturales, es un paso crítico

para muchas especies y requiere tiempo e instalaciones caras que restringen la
aplicación comercial de los procesos de micropropagación. Estas plantas
muestran un rápido marchitamiento cuando se transfieren a condiciones de
invernadero, por lo tanto debe mantenerse una humedad relativa alta en el nuevo
ambiente, para no dañar los mecanismos que mantienen el volumen de agua en la
planta (Fila et al.,1998).

17
Por su parte Ravindra y Thomas (1995) señalan que la aclimatización o
endurecimiento de plantas de cultivos in vitro, es el paso más crítico en la
micropropagación y que la supervivencia de vides (Vitis vinifera. L)
micropropagadas es relativamente baja comparada con otras especies leñosas.
Los frascos, tubos de ensayo y matraces necesitan ser cerrados para impedir su
deshidratación e infección, pero por otro lado, tiene que ser posible el intercambio
gaseoso con el exterior, para evitar una falta de oxígeno o el exceso de gases
producidos como el CO2 y el etileno (Pierik, 1990). Zobayed, Armstrong y
Armstrong (2001) explican que la principal característica del ambiente gaseoso in
vitro, en un sistema convencional de cultivo de tejido es la alta humedad relativa,
gran fluctuación diurna de la concentración de CO2 y la acumulación de etileno y
de otras sustancias tóxicas, esto debido al restringido intercambio aéreo entre el
tubo de cultivo y el ambiente.

Las concentraciones de etileno en los tubos de cultivo pueden afectar el

crecimiento in vitro de las plantas (Santamaria et al., 2000).

Las plantas cultivadas in vitro, tienen generalmente la cutícula escasamente

desarrollada, debido a la alta humedad relativa (90% - 100%). Como
consecuencia, cuando se transfiere la planta a condicionesambientales, se
produce una transpiración cuticular extra, ya que la humedad del aire en
condiciones in vivo es más baja (Pierik, 1990). Por otra parte, (Pierik, 1990)
señala que las hojas de una planta producida in vitro, son frecuentemente finas,
blandas y fotosintéticamente poco activas, además tienen las células en
empalizada que son las que deben utilizar la luz, más pequeñas y en menor
cantidad. Indica además que los estomas pueden no ser suficientemente
operativos, y permanecer abiertos al trasplantarse a condiciones ambientales,
originando un importante estrés hídrico en las primeras horas de aclimatación.

2.7. Aclimatización

El termino aclimatización es definido como la adaptación ambiental de las plantas

obtenidas por cultivo de tejidos o micropropagación que han sido movidas a una

18
nuevo ambiente, invernaderos o campo. Durante la aclimatización, el ambiente a
las plantas le es cambiado gradualmente en el tiempo, comenzando con el
cercano ambiente in vitro y terminando con el cercano ambiente en el invernadero
o campo. La aclimatización realizada en el invernadero o campo bajo condiciones
de sombra es llamada “aclimatización ex vitro”. En la micropropagación foto-
autotrófica, la aclimatización puede ser también completada en el frasco de cultivo,
lo cual es conocido como “aclimatización in vitro” (Kozai et al. 2005).

La aclimatización de plantas in vitro a las condiciones naturales, es un paso crítico

para muchas especies y requiere tiempo e instalaciones caras que restringen la
aplicación comercial de los procesos de micropropagación. Estas plantas
muestran un rápido marchitamiento cuando se transfieren a condiciones de
invernadero, por lo tanto debe mantenerse una humedad relativa alta en el nuevo
ambiente, para no dañar los mecanismos que mantienen el volumen de agua en la
planta (FILA et al.,1998).

Por su parte Ravindra y Thomas (1995) señalan que la aclimatación o

endurecimiento de plantas de cultivos in vitro, es el paso más crítico en la
micropropagación y que la supervivencia es relativamente baja comparada con
otras especies.

Zobayed, Armstrong y Armstrong (2001) explican que la principal característica del

ambiente gaseoso in vitro, en un sistema convencional de cultivo de tejido es la
alta humedad relativa, gran fluctuación diurna de la concentración de CO 2 y la
acumulación de etileno y de otras sustancias tóxicas, esto debido al restringido
intercambio aéreo entre el tubo de cultivo y el ambiente.

Tradicionalmente el cultivo de tejidos ha involucrado recipientes cerrados con

plantas creciendo heterotróficamente, en un medio con agar que contiene una
fuente de carbono. Para mejorar la aclimatación de las plantas ex vitro debe
proporcionárseles un ambiente que se parezca al in vivo, especialmente durante
la etapa III. Para estimular el fotoautotropismo, se reduce la concentración de
hidratos de carbono en el medio, se incrementa la intensidad de luz y se eleva la

19
concentración de CO2. Además, es importante normalizar el ambiente gaseoso en
los envases de cultivo cerrados, ya que éstos difieren muy notablemente del
ambiente, y puede provocar cambios significativos en el crecimiento y en la
fisiología de la planta. Los valores de CO2 son del orden de 0 – 12%, es decir
menores a 10 ppm y los de la acumulación de etileno de 3 µl/l, además de una
humedad relativa cercana al 100% (Murphy et al., 1998)

Las plantas cultivadas in vitro, tienen generalmente la cutícula escasamente

desarrollada, debido a la alta humedad relativa (90% - 100%). Como
consecuencia, cuando se transfiere la planta al suelo, se produce una
transpiración cuticular extra, ya que la humedad del aire en condiciones in vivo es
más baja (Pierik, 1990).

Por otra parte, Pierik (1990) señala que las hojas de una planta producida in vitro,
son frecuentemente finas, blandas y fotosintéticamente poco activas, además
tienen las células en empalizada que son las que deben utilizar la luz, más
pequeñas y en menor cantidad. Indica además que los estomas pueden no ser
suficientemente operativos, y permanecer abiertos al trasplantarse al suelo,
originando un importante estrés hídrico en las primeras horas de aclimatación.

Thomas (1998) demuestra que la aclimatación de las plantas in vitro es a menudo

difícil porque ellas poseen tallos y hojas suculentas, debido a la alta humedad
dentro del vaso de cultivo, y el agua libre en el medio.

Fila et al. (1998) señalan que la aclimatación puede ser mejorada modificando el
microambiente durante el desarrollo in vitro, por ejemplo reduciendo la humedad
relativa que causa un endurecimiento de la planta, mejorando los resultados
durante el trasplante. También con el aumento de la tasa de CO 2 en los tubos de
cultivo o aumentando las intensidades de luz, para producir el establecimiento
autotrófico in vitro.

Gribaudo, Novello y Restagno (2001) indican que el costo de la fase de

aclimatación es generalmente considerable. Es por ello que los procedimientos
que lleven a un endurecimiento de la planta en la última etapa de la
20
micropropagación, con menores costos de labor y equipamiento facilitan este
manejo.

2.8. La Embriogénesis Somática en papaya.

Diferentes autores utilizan para la germinación de embriones somáticos de papaya

dos y hasta tres subcultivos en un medio de cultivo de germinación (Cruz et al.,
1990; Posada, 1995) para completar y lograr el desarrollo de las plantas. Los
embriones somáticos provenientes del medio de cultivo de multiplicación son
separados, también en pequeños grupos antes de colocarlos en el medio de
cultivo.

utilizada tanto para la micropropagación, como para el mejoramiento genético con

el uso de técnicas de transformación genética (Cabrera-Ponce et al., 1995;
Posada, 1995; Mahon et al., 1996; Castillo et al., 1998; Cai et al., 1999; Del Sol et
al., 2001; Banerjee, 2002).

El explante más utilizado en este cultivo, independiente de la variedad, para lograr

la embriogénesis somática, es el embrión cigótico (Cabrera-Ponce et al., 1995;
Posada, 1995; Mahon et al., 1996; Cai et al., 1999; Del Sol et al., 2001). No
obstante, también se han utilizado otros tipos de explantes como: discos de hojas
(Cabrera–Ponce et al., 1996; Arrieta-Espinoza, 1996), segmentos de hipocotilo
(Castillo et al., 1998;), raíces (Yu et al., 2001), así como ápices y segmentos de
plantas in vitro (Gallardo et al., 2004a).

Varias metodologías de regeneración de plantas por esta vía en el cultivo de la

papaya han sido establecidas, su fin fundamental ha estado dirigido al
mejoramiento genético (Posada, 1995). Sin embargo, este proceso de
morfogénesis in vitro también puede ser utilizado para la producción de semillas
de plantas élites o hermafroditas en este cultivo.

En el Instituto de Biotecnología de las Plantas se han desarrollado dos

metodologías las cuales representan un gran potencial para la micropropagación y
el mejoramiento genético. Una se basa en el uso como explante inicial de

21
embriones cigóticos inmaduros y la otra con el empleo de plantas in vitro de
papaya, específicamente del híbrido IBP 42-99.

Las condiciones de cultivo son cámaras de luz solar con un flujo de fotones de 48-
62.5 mol.m-2 s-1 y una temperatura de 27±2 o
C. A los embriones somáticos que
ya alcanzaron las etapas de torpedo y cotiledonal se les realizan dos subcultivos
en medio de cultivo con 6-BAP en concentraciones entre 0.2- 0.5 mg.l -1. Las
plantas in vitro se desarrollan completamente y forman varias hojas verdaderas.
Debido a que en esta especie la germinación de los embriones somáticos ocurre
de forma parcial (Posada, 1995), se hace necesario utilizar un medio de cultivo
para elongar las plantas in vitro y posteriormente que las mismas enraícen.

2.8.1.Aclimatización in vitro

La fase de aclimatización de las plantas in vitro es una de las etapas críticas de

cualquier protocolo de propagación en este cultivo. Lo fundamental en esta fase es
que las plantas formen un buen sistema radical, debido a que su nutrición
dependerá durante mucho tiempo y en gran parte de la efectividad de sus raíces.

En la papaya resulta fundamental y merece una mayor atención mantener una alta
humedad relativa para lograr mayor éxito en la adaptación a las
condiciones ambientales. Gallardo et al. (2002)

El riego debe ser una vez al día con nebulizadores es suficiente. Durante la fase
de aclimatización deben emplearse como sustrato productos que presenten como
características fundamentales: (Posada, 2007)

 Una adecuada condición física que permita el intercambio de aire.

 Contenido de materia orgánica inerte (70 %).

 Contenido de zeolita (30%).

 Buena capacidad para retención de agua.

22
  Estar libre de agentes dañinos como pueden ser nemátodos, bacterias
y hongos patógenos.

 Libre de semillas de plantas de otras especies. Las plantas responden muy

bien a la aplicación semanal de urea (10g.l-1) de forma foliar, toman una
consistencia vigorosa y desarrollan hojas de color verde intenso (Posada,
2007).

2.8.2. Enraizamiento in vitro

Para el enraizamiento in vitro se recomienda el empleo de un medio de

cultivo de enraizamiento, compuesto por el 50% de las sales Murashige y
Skoog (1962) (MS) y Ácido Indol-3-butirico (AIB) como regulador del
crecimiento (Drew, 1988; Reuveni et al., 1990; Rahaman et al., 1992; Islan et al.,
1993 y Vianna, 1996).

En este medio de cultivo se induce la formación de raíces y luego se transfieren

aun medio de cultivo compuesto por sales MS sin reguladores de crecimiento
para completar el proceso. Al final de este período las plántulas formarán
raíces con pelos absorbentes y estarán listas para ser trasladadas a condiciones
ambientales de aclimatización (Drew et al., 1991).

Gallardo et al. (2004) obtuvieron resultados satisfactorios en el enraizamiento del

híbrido IBP 42-99 al emplear frascos de cultivo con 30ml de medio de cultivo MS
(1962) y AIB a una concentración de 5 mg.l-1 .

Cruz, (2007) obtuvieron resultados satisfactorios en el enraizamiento in vitro de

plantas transgénicas de papaya al emplear frascos de cultivo con 30ml de medio
de cultivo propuesto por Drew et al. (1991) el cual contenía la mitad de las sales
MS (1962) suplementado con 2 mg.l-1 de AIB y pH 5.8 previo al autoclave.

2.8.3. Enraizamiento ex vitro

Otra variante que también puede ser empleada es el enraizamiento ex vitro

(Kataoka e Inoue, 1991). Estos autores emplearon plantas de cultivo in vitro de 10

23
Mm... de altura a las que se les eliminaron las hojas basales y fueron tratadas con
250 – 2500 mg.L-1 de AIB en etanol al 50% por 10 segundos.

2.9. Anatomía de las plantas cultivadas in vitro y su influencia sobre la

aclimatización

2.9.1.Enraizamiento.

El ambiente in vitro es conocido por inducir modificaciones morfológicas,

anatómicas y fisiológicas en las plantas micropropagadas. Esas plantas son
generalmente susceptibles a la deshidratación rápida cuando se exponen a baja
humedad relativa (Gribaudo, Novello y Restagno, 2001).

Por su parte Ritchie, Short y Davey (1991) indican que las plantas
micropropagadas son cultivadas bajo altos niveles de humedad relativa, causando
anormalidades morfológicas, particularmente en el estoma y la cutícula,
produciendo un alto porcentaje de mortalidad en la transferencia al invernadero.

Brainerd y Fuchigami (1981) señalan que las hojas de plantas micropropagadas

pueden tener menos cera epicuticular, células en empalizada más pequeñas, y
más espacios aéreos en el mesófilo.

2.9.2. Factores morfológicos que influyen en la aclimatización

Brainerd et al. (1981) demuestran que la anatomía de la hoja es influenciada por la

luz y la humedad. Las hojas desarrolladas a altas intensidades de luz tienen
células en empalizada en mayor cantidad y más grandes que aquellas en
condiciones de sombra, situación que se asemeja al de las plantas in vitro. Las
hojas desarrolladas en baja humedad relativa tienen espacios intercelulares
pequeños. Las plantas crecidas en alta humedad relativa tienen un pobre
desarrollo de cera epicuticular, y altas tasas de transpiración en aire seco.

Plantas creciendo bajo condiciones heterotróficas in vitro, tienen bajas tasas de

fotosíntesis. Esto es debido a las bajas intensidades de luz, bajas concentraciones
24
de CO2 (Infante, Magnanini y Richetti, 1989) y la inhibición de la fotosíntesis por la
alta concentración de azúcar en el medio de cultivo. No obstante, después de
transferirlas a las condiciones ex vitro, la mayoría de las plantas micropropagadas
desarrollan un aparato fotosintético funcional, aunque el aumento en la intensidad
de la luz no es linealmente traducido en un incremento de la fotosíntesis (Kozai,
1991).

En las plántulas in vitro, la respuesta a la fotosíntesis en condiciones de luz, es

similar a la de las plantas de sombra, caracterizadas por tasas fotosintéticas y de
compensación de luz bajas y puntos de saturación también bajos. La anatomía de
las hojas es de acuerdo con las características fisiológicas mencionadas, ya que el
efecto de la luz en el desarrollo del mesófilo, principalmente en el parénquima en
empalizada, es ciertamente el factor determinante anatómicamente. Sin embargo,
las deficiencias en las estructuras de los cloroplastos (desarrollo de grana), el nivel
bioquímico y la baja en la actividad de la Rubisco, también contribuyen a limitar la
actividad fotosintética (Amacio, Rebordao y Chaves, 1999).

Además, Amacio, Rebordao y Chaves (1999) confirman que cuando las plantas
son transferidas a condiciones in vivo, a radiaciones más altas, puede ocurrir
estrés de luz, incluyendo la fotoinhibición, la fotooxidación de la clorofila, lo último
siendo revelado por clorosis y manchas secas que aparecen en la hoja. No
obstante, algunas especies toleran mayores radiaciones que aquellas in vitro, sin
mayor estrés. El control y la optimización de la luz, es entonces esencial para la
aclimatización satisfactoria, aumentar la tasa de sobrevivencia y el desarrollo de
nuevas estructuras. Por otra parte, existe la evidencia que un alto nivel de azúcar
en las células puede inhibir la síntesis de clorofila.

Los factores limitantes para la fotosíntesis de plantas cultivadas in vitro, son la

baja concentración de CO2 en la atmósfera del frasco de cultivo y la baja
intensidad de luz. El aumento simultáneo de estos factores generalmente hace
25
posible mejorar la actividad de la fotosíntesis in vitro. La tasa de fotosíntesis
aumenta con la intensidad de la luz, pero hay variantes entre cultivares, es así
como bajo varias intensidades de luz la fotosíntesis es baja en Riesling italiana,
comparada con Dimiat. (Slavtcheva y Dimitrova, 2000).

La captación de CO2 neto por parte de las plantas in vitro, es pequeña debido a la
baja tasa de éste dentro del tubo de crecimiento. Es más, los azúcares que se
suplementan al medio de crecimiento pueden causar una inhibición extensa de la
fotosíntesis. Al aumentar la tasa de CO2 y/o las intensidades de iluminación en el
tubo de cultivo, se produce un establecimiento autotrófico en las plantas in vitro.
Sin embargo estas técnicas son de poco uso comercial debido a su alto costo
(FILA et al., 1998).

Van Huylenbroeck y Debergh (1996), indican que lo importante en las plantas in

vitro, son las reservas de hidratos de carbono para superar el estrés del
trasplante. Con un balance positivo del carbono es posible producir nuevas hojas
funcionales, ya que el trasplante causa un cambio en la asignación de materia
seca entre el tallo y las hojas en papaya, se forman más hojas y menos tallo, esto
también es corroborado en manzano por Díaz -Pérez, Shackel y Sutter (1995).

Investigaciones anteriores han mostrado que el estrés del trasplante es debido

primeramente al estrés hídrico, el cual puede ser combatido exitosamente por
algunas especies de plantas con alta humedad después del trasplante. La pobre
formación de cera epicuticular y cuticular, y el reducido control estomático
comparado con las plantas control aclimatizadas en invernadero, contribuye a la
desecación de las plantas transferidas (Donnelly y Vidaber, 1984).

La pérdida de agua en plantas micropropagadas durante la aclimatización, se ha

atribuído principalmente al mal funcionamiento de los estomas y a una reducida
deposición de cera epicuticular (Gribaudo, Nobello y Restagno, 2001).

26
2.9.3. Cutícula

Brained y Fuchigami (1981) señalan que el estrés hídrico de las plantas cuando
son transferidas a baja humedad relativa, ha sido atribuido al pobre desarrollo de
la cera cuticular y epicuticular.

Grout y Aston (1977) observaron que una considerable y evidente capa de cera
epicuticular, en ambas superficies de hojas de Brassica oleracea, 10 días
después de transferirlas desde un cultivo aséptico a baja humedad relativa (HR).
Estos desarrollos de cera son parte del proceso de aclimatización. El desarrollo de
cera ocurre a los 10 días o más después de transferirlos, pero no explica la
diferencia en el contenido relativo de agua o el porcentaje de agua perdida entre
un cultivo de manzano cultivado asépticamente y aquellos después de cuatro o
cinco días de expuestos a 30 a 40% de humedad relativa.

La deposición de la cera epicuticular, es un factor importante en el retardo de la

deshidratación de la hoja, ésta es reforzada al disminuir la humedad relativa

(Ritchie, Short y Davey, 1991).

Gribaudo, Nobello y Restagno (2001) observaron que la cantidad de cera de la

hoja en plantas in vitro era baja, anormalmente estructurada y químicamente
diferente de la cera de las plantas crecidas en invernadero. Además, evaluaron la
presencia de cera epicuticular de la superficie adaxial de la hoja, para determinar
si la pérdida de agua era influenciada por la cantidad de cera o por un problema
estomático, concluyendo que la mayoría del agua se perdió a través de la
superficie adaxial debido a un cierre estomático imperfecto.

2.9.4. Estomas

Brainerd y Fuchigami (1981) determinaron que la proporción de pérdida de agua

de plantas micropropagadas de manzano, se relacionó inversamente al porcentaje
de cierre estomático. Brained et al. (1981) observaron que el agua perdida de
hojas de plantas provenientes de cultivos asépticos de ciruelo cv. Pixy ocurrió
desde la superficie abaxial, donde se encuentran localizados los estomas.

27
Gribaudo, Nobello y Restagno (2001) indican que las uvas crecidas en el campo,
tienen hojas hipoestomáticas, es decir tienen los estomas confinados
principalmente en la superficie abaxial.

Brainerd y Fuchigami (1981) observaron que un corto tiempo de aclimatización

con humedad, involucra un cambio en el funcionamiento estomático, y ocurre en
menos de cinco días después de exponerlo a esta baja humedad relativa. Otro
tiempo más largo de aclimatización involucra desarrollo de cera, y reorientación
de los cloroplastos, y esto ocurre después de 10 a 14 días.

Brainerd y Fuchigami (1981) y Sutter y Langhans (1979) han sugerido, sin

embargo, que la lenta respuesta estomática puede contribuir también al estrés
hídrico en plantas micropropagadas removidas desde el ambiente de cultivo.

Romano, Noronha y Martins- Loucao (1992) demuestran que los estomas de las
plántulas in vitro están levantados, alrededor de las células de guarda
comparados con los normales que son elípticos, y con las células de guarda
hundidas.

Ritchie, Short y Davey (1991) señalan que el mal funcionamiento de los estomas,
es debido a la anormal disposición de las células de guarda. La incapacidad de los
estomas de cerrarse completamente, la mínima reducción de las aperturas de las
células de guarda en las hojas de crisantemo, y remolacha cultivadas bajo
humedad relativa reducida es consistente con los resultados publicados por Short
y Roberts (1987) y Wardle, Dobbs y Short (1983).

2.9.5. Raíces

El equilibrio del agua en tejidos de plantas micropropagadas no solo depende de

regular la transpiración, sino de un suministro adecuado de agua a las raíces. Es
por esto que las plantas cultivadas en agar tienen pobres conexiones raíz-tallo, la
estructura de la raíz alterada, la absorción y transporte del agua es negativo. La
captación de agua por parte de las raíces, junto con la pérdida de agua por los
ápices, es de importancia primaria para el mantenimiento del equilibrio del agua

28
durante la aclimatización de las plantas cultivadas in vitro. Además indican que el
suministro de agua podría estar limitado, desde que estudios histológicos han
mostrado una anatomía de raíz anormal en las plantas in vitro (Fila et al., 1998).

Végvari (2001) mostró que las raíces de plantas propagadas in vitro,

generalmente pierden sus pelos radicales durante la aclimatización, pero estas
raíces son todavía importantes porque las nuevas raíces desarrolladas son
totalmente funcionales a partir de ellas.

2.10. Aspectos fisiológicos y bioquímicos generales. Fisiología y bioquímica

del cultivo in vitro.

Como resultado del microambiente in vitro, las plantas presentan una anatomía y
fisiología diferente a las que son cultivadas en condiciones de campo o casas de
cultivo (Kozai y Smith, 1995; Pospisilova et al., 1997; Majada et al., 2000; Majada
et al., 2001; Chakrabarty y Subodh, 2008). Los desórdenes observados afectan
todos los órganos de la planta, aunque no todos tienen el mismo peso sobre el
comportamiento ex vitro. Dentro de estos desórdenes se encuentran el pobre
desarrollo del aparato fotosintético, de las cutículas de las hojas, la emisión de
raíces no funcionales sin conexión con los haces conductores y otros más que
pueden afectar la supervivencia de las plantas en la aclimatización (Precce y
Sutter, 1991).

Dentro de los procesos fisiológicos más importantes de las plantas, se encuentran

los relacionados con la tasa de intercambio de gases, la fotosíntesis y la
transpiración, procesos que ocurren en las hojas como órganos principales de la
fisiología de las plantas y con un papel fundamental en el crecimiento de cualquier
especie (Barceló et al., 2001).

Desde el punto de vista bioquímico la fotosíntesis contempla una serie de

reacciones que le permiten ser el proceso de la vida, a través del cual se lleva a
cabo la síntesis de materia orgánica y la generación de oxígeno por medio de la
luz (Barceló et al., 2001). Varias han sido las formas de cuantificación de la misma
y generalmente se basan en la medición del diferencial de concentración de CO 2
29
que se genera durante la ocurrencia de este proceso. Otra de las formas de
medición de la actividad fotosintética es por el desprendimiento de dioxígeno
producto de la fotólisis del agua Le et al. (2001)

Para la fotosíntesis en particular existen dos factores que son determinantes para
que esta actividad anabólica se favorezca. Uno es la presencia y el tipo de luz y el
otro es la concentración de CO2. En los gráficos de fotosíntesis en función de la
luz el punto llamado “punto de compensación” o “equilibrio” representa el momento
en el que la intensidad de luz genera la energía mínima para que la fotosíntesis
sea cero, es decir que la captación de CO2 se hace igual al desprendimiento del
mismo por la célula. Para el caso de la variación de la concentración de CO 2 este
punto se alcanza cuando la concentración del mismo iguala la difusión neta de
este gas hacia el interior y exterior de la célula. Las plantas responden
aumentando su actividad fotosintética con aumento de la luz y el CO 2, siempre
hasta llegar a un valor llamado el “punto de saturación” donde la fotosíntesis
alcanza y permanece con su valor máximo (Barceló et al., 2001).

Para el caso del plátano se han realizado algunos estudios asociados a los
cambios en la fotosíntesis y transpiración de las hojas en condiciones de campo.
Experimentos en plátanos pertenecientes a la variedad Dominico-Hartón (AAB)
mostraron varios criterios respecto a la fisiología de las hojas de plantas adultas
en condiciones de campo (Cayón, 2001).

2.11.Factores que influyen en la embriogénesis somática

2.11.1 Genotipo

Se ha observado que genotipos provenientes de una misma especie, pueden

diferir en cuanto a su capacidad para formar embriones somáticos, lo cual esta
dado por las diferentes habilidades para activar las rutas embriogénicas (Parrott,
2002).

Varios artículos científicos reflejan la baja eficiencia de formación de callos con

estructuras embriogénicas; así como la influencia del genotipo en la producción

30
de callos y en la regeneración de plantas in vitro (Kaeppler y Pederson, 1997;
Jogeswar et al., 2007).

2.11.2. Explante

Según Parrot (1993) el tipo, estado fisiológico y los niveles de diferenciación y

polarización de los tejidos utilizados como explantes iniciales son algunos de los
factores que favorecen el desarrollo de la embriogénesis somática

La respuesta de los diferentes tipos de explantes a la regeneración de plantas vía

embriogénesis somática en la mayoría de las especies depende de la edad del
explante y la concentración de auxina.

2.11.3. Medio de cultivo

Malinowski y Filipecki (2002) refieren que el establecimiento de un cultivo depende

de varios factores, los cuales pueden ser modificados al variar algunos
componentes del medio de cultivo como son los reguladores del crecimiento, las
sales minerales como el calcio y el hierro, los azúcares y las vitaminas como la
Tiamina (B1), Cianocobalamina (B12) y Tocoferol (E). Samoylov et al. (1998),
determinaron que son cuatro los factores que afectan la formación de embriones
somáticos en cultivos embriogénicos: el contenido de carbohidratos, la presión
osmótica, el contenido de nitrógeno total y el índice amonio/nitrato en el medio de
cultivo. De igual forma, Zaidi et al. (2000) mencionan que el nitrógeno en el medio
de cultivo es importante, desde el punto de vista cualitativo y cuantitativo en la
inducción de la embriogénesis somática.

Por otra parte, Mashayekhi (2000) señala que el requerimiento de nitrógeno

reducido en la inducción de los embriones somáticos se debe a que estos carecen
de la nitrato reductasa, la cual reduce el nitrato a nitrito.

En algunas especies se ha determinado la influencia de la concentración de

sacarosa sobre la formación de callo con estructuras embriogénicas y embriones
somáticos, ya que altas concentraciones de sacarosa (> 40 g.L -1) actúan como un

31
factor estresante que induce el proceso de la embriogénesis somática (Nuutila et
al., 2002; Zheng et al., 2002; Choi y Jeong, 2003).

2.11.4 Reguladores de crecimiento

La combinación de reguladores de crecimiento necesaria para obtener embriones

somáticos depende del tipo de células que formen el explante, ya sean células
predeterminadas embriogénicamente (CPE) o células no determinadas
embriogénicamente (CnDE). En el caso de las CPE, la adición de una citoquinina
al medio de cultivo es suficiente, porque las células ya son embriogénicas y
simplemente necesitan dividirse; pero al utilizar tejidos con CnDE, es necesario el
empleo de auxinas para inducir el estado embriogénico (Parrott, 2002).

Las auxinas desempeñan un importante papel en el proceso de embriogénesis

somática. La acción auxínica produce severos cambios, lo cual reprograma a la
célula para un estado embriogénico. Uno de los eventos iniciales es la terminación
del patrón genético general, que puede variar y permitir la expresión de un
programa embriogénico. Un posible mecanismo para la baja regulación de la
expresión génica es la metilación del ácido desoxirribonucleico (ADN), lo cual esta
correlacionado con la cantidad de auxina exógena (Barbón, 2001; Kintzios et al.,
2002).

El papel de las citoquininas en el medio de cultivo primario o inductor no ha sido

bien definido, aunque normalmente este medio de cultivo incluye en su
composición alguna de ellas como es el 6-bencilaminopurina (6-BAP) o la
Kinetina. Las citoquininas pueden ser esenciales para la maduración y
germinación de embriones somáticos. La incorporación de estas durante la fase
de histodiferenciación compensa el efecto negativo inducido por la auxina sobre el
desarrollo del meristemo (Barbón, 2001).

Muchos de los protocolos para la embriogénesis somática omiten una o más

etapas, usan reguladores de crecimiento innecesarios, o condiciones subóptimas

32
de cultivo. Lo que provoca que los embriones somáticos requieran el empleo de
reguladores de crecimiento (generalmente citoquinina o giberelina) antes de
germinar y convertirse en plantas (Parrott, 2002).

2.11.5. Condiciones de cultivo

En términos de la atmósfera gaseosa, la adición de inhibidores de etileno, tales

como cobalto, níquel y ácido salicílico incrementaron la embriogénesis en
zanahoria (Roustan et al., 1990). Grapin et al. (1994) informan la importancia de la
atmósfera gaseosa en el proceso de regeneración de embriones somáticos, donde
la calidad de la atmósfera influyó en el proceso de diferenciación y se observó una
reducción del número de embriones somáticos por explante en atmósferas con
bajas concentraciones de oxígeno.

33
Materiales y Métodos
34
3. MATERIALES Y MÉTODOS

Las investigaciones del presente trabajo se desarrollaron en el Instituto de

Biotecnología de las Plantas perteneciente a la Universidad Central “Marta Abreu”
de Las Villas en el período comprendido desde diciembre 2013 a mayo de 2014.

Material vegetal

Como material vegetal se emplearon brotes de papaya regenerados a partir de

embriones somáticos; procedentes del cuarto subcultivo en el medio de cultivo de
elongación propuesto por Posada et al. (2009), que contenía las sales Murashige y
Skoog (1962) MS al 100 % de su concentración, 1.0 mg.L-1 de tiamina, 1.2 µM de
BAP, 1.5 µM de ácido naftalenacético (ANA), 100 mg.L-1 mio-inositol, 30 g.L-1 de
sacarosa, 0.06 mg.L-1 de vitamina B2 y 5 g.L-1 de Agargel (Sigma Co). Los brotes
para los ensayos fueron seleccionados con una longitud entre 3.0 – 5.0 cm, a los
cuales se les eliminaron las hojas basales y se le dejaron las cuatro nuevas
últimas hojas.

Técnicas y procedimientos generales de trabajo

Los medios y frascos de cultivo utilizados en este trabajo fueron esterilizados en la

autoclave a 121ºC y 1.2 kg.cm-2 de presión por tiempos que variaron en
dependencia del volumen de medio de cultivo a esterilizar, según información
técnica de la firma SIGMA (1991). Los platos metálicos para el manejo de los
explantes, fueron esterilizados en la estufa a 180ºC durante dos horas.

Los medios de cultivo en estado semisólido se dosificaron en frascos de vidrio con

capacidad total de 250 mL, a los que se les adicionaron 30 mL. El pH utilizado fue
de 5.8 para los medios de cultivo. Este fue ajustado antes de la esterilización en
autoclave con NaOH 1.0 (Normales) y HCl 1.0 (Normales).

El instrumental (pinzas y bisturíes), se desinfectó en un esterilizador eléctrico

modelo DENT-EQ (Alemania) que permaneció dentro de la cámara de flujo

35
laminar horizontal, donde se realizó el manejo del material vegetal en condiciones
de esterilidad.

Condiciones de cultivo

Los frascos de cultivo con los brotes se colocaron en cuartos de cultivo

climatizados a una temperatura de 27 ± 2 °C con luz solar con un fotoperíodo de
13/11h de luz/oscuridad con un rango de intensidad luminosa entre 23.2 y 44.5
µmol.m-2.s-1; medido con un luxómetro EXTECH Light meter 401 025 (EUA). Los
experimentos fueron repetidos dos veces.

A los tres días de cultivo se comenzó a abrirles el orificio a la lamina de aluminio

que cubría los frascos de cultivo en los distintos tratamientos y experimentos del
trabajo, con el objetivo de incrementar la ventilación; uno por frasco de cultivo, con
el auxilio de una pinza estéril. El segundo orificio se abrió a los cinco días de haber
abierto el primero (Figura 1).

Figura 1. Cultivo in vitro de los brotes in vitro de papaya var. Maradol roja en
medio de cultivo con zeolita como soporte. A la izquierda: Orificios realizados en la
lámina de aluminio que cubre el frasco. A la derecha: Aspecto de las plantas al
inicio de los experimentos.

36
Evaluación de variables morfológicas y fisiológicas

Al terminar los distintos experimentos in vitro se le realizaron a los brotes y plantas

las siguientes evaluaciones morfológicas que a continuación se relacionan:

• Altura de la planta (cm)

• Número de hojas

• Número de entrenudos

• Enraizamiento (%)

• Número de raíces

• Longitud de la raíz más larga (cm)

• Peso fresco de la planta in vitro (gMF)

• Presencia o no de callo basal

• Número de estomas totales (% de estomas abiertos y cerrados) tomado de

las muestras a las 12 m del mediodía

• Área Foliar, por el método propuesto para estimar el área foliar para plantas
de papaya de Cardona et al. (2009)

Observación de los estomas

La visualización de los estomas se realizó en la parte abaxial de la hoja. Se

utilizó el método de la réplica propuesto por Larqué-Saavedra y Trejo
(1988), modificado por Engleman (sin publicar), que consiste en poner una gota
de pegamento instantáneo Kola Loca en un portaobjetos, posteriormente
presionar la hoja por un minuto sobre la gota y enseguida despegar del
portaobjetos. Las impresiones se llevaron al laboratorio donde se observaron en
un microscopio óptico Olympus BX51 (Olympus, Tokio Japón) que tenía
adaptada una cámara digital evolución TM MP (Media Cybernetics, Florida, EUA).
Se observaron y fotografiaron tres campos elegidos al azar.

37
Las evaluaciones de los indicadores fisiológicos de los brotes y plantas in vitro
fueron realizadas según será especificado en cada acápite correspondiente.
Fueron determinados los contenidos de los pigmentos de clorofila a, b y
carotenoides. Determinación de la actividad fotosintética, la transpiración total y la
conductancia estomática.

Determinación de clorofila a, b y carotenoides

Todas las hojas fueron tomadas de 10 plantas provenientes de embriones

somáticos para obtener el extracto de clorofila (mg.g-1) en cada uno de los
tratamientos, usando alcohol al 70%. Se pesaron entre 200-500 mg de hojas las
cuales fueron maceradas en alcohol (2-3 mL) y después el macerado filtrado con
papel de Filtro Watman 2. La absorbancia de los extractos se midió a 663, 645 y
472 nm con un espectrofotómetro (GENESYS 6; Thermo Electronic Corporation
Visionlite Vision 2.1), según el método modificado por Meyer-Berthenrath
(ecuación 4, 5,6)

donde:

- chlA / B, contenido de clorofila a y b (mg g-1)

- t. c, contenido total de carotenoides (mg g-1)

- E (l), longitud de onda; d, ancho de la celda (1 cm)

- V, volumen del alcohol al 70% (mL); w, peso del tejido (g)

38
Determinación de la actividad fotosintética, transpiración total y
conductancia estomática.

Para las mediciones se utilizaron hojas totalmente expandidas de los brotes y

plantas al final del experimento in vitro, entre cuatro y cinco horas después del
principio del fotoperíodo. Todas las mediciones se realizaron con tres hojas de
diferentes plantas. La capacidad fotosintética máxima (µmol CO 2.m-2.s-1) y la
transpiración total (mmol H2O m-2 s-1) se midieron con el CIRAS-2 (Sistema Portátil
de Fotosíntesis, Europa, PP Systems, Reino Unido) acoplado a una cubeta
universal (PLC6). El área de la cubeta se cubrió completamente con la hoja (1.7
cm2). La concentración del dióxido de carbono, la temperatura del aire y la
humedad relativa (80-90%) fueron valores ambientales. La luz fue fijada a los 900
µmol.m-2 s-1.Estas determinaciones se realizaron en el Centro de Bioplantas de la
Universidad de Ciego de Ávila.

De igual forma y en el mismo momento otro grupo de plantas de cada tratamiento

experimental fueron llevadas a condiciones de aclimatización para evaluar la
supervivencia (%).

Condiciones de aclimatización

El ambiente en las condiciones de aclimatización se caracterizó y promediaron las

temperatura durante el día a 30±2ºC, humedad relativa del 70-75% y la
intensidad lumínica osciló entre 224 y 457 µmol m -2 s-1 medida con un luxómetro
EXTECH Light meter 401 025.

Se utilizó como sustrato 90 % de zeolita y 10 % de compost de cachaza de caña

de azúcar. Estos componentes fueron colocados en macetas de plástico de 500
mL de volumen total. Primero se depositó en el fondo el compost y encima la
zeolita para garantizar una buena aireación de las raíces de la plantas de papaya.
El riego fue realizado de forma manual por aspersión dos veces al día. Las plantas
fueron cubiertas por un frasco de vidrio transparente durante cinco días para
garantizar una alta humedad relativa mayor del 90 % y un sombreo del 70 % con
una maya sarán negra. Se utilizaron por tratamiento 25 plantas para todos los
39
experimentos. El control empleado en la aclimatización fueron las plantas
obtenidas por semilla botánica.

El porcentaje de supervivencia (%) se determinó contando las plantas que se

mantenían vivas en el momento de evaluación siete días, con respecto al total que
inicialmente se plantaron.

Análisis estadístico

Para los análisis estadísticos se utilizó el paquete de programas SPSS para

Windows versión 21 del 2012. Para el análisis de la normalidad de las variables se
utilizó el test de Shapiro Wilk, para la comparación entre las medias se aplicó la
alternativa no paramétrica del Análisis de Varianzas, el test de Kruskal-Wallis y
para la comparación entre parejas de grupos se utilizó el test no paramétrico de
Mann-Whitney. Para las variables normales se aplicó un análisis ANOVA y la
diferencia entre las medias se determinó por la prueba de Dunnett-C para ≤ 0.05.

3.1. Efecto de la sacarosa, la auxina y el Pectimorf® en el enraizamiento y la

aclimatización in vitro de los brotes de papaya.

Experimento I

Este primer experimento consiste en, determinar el efecto de la combinación de la

sacarosa y la presencia o no del regulador del crecimiento, ácido indolbutírico
(AIB) y varias concentraciones de Pectimorf® que es una mezcla de (1―4) α-D-
oligogalacturonidos, con grado de polimerización de entre 12 y 14 Cabrera et al.
(2003) para el enraizamiento de los brotes. Se utilizó como soporte el mineral
zeolita estéril (alumino-silicato natural con unas excelentes propiedades de
intercambio iónico y un alto poder de absorción, tabla 1), de granulación 1-3 mm.
Se adicionó a cada frasco de cultivo de vidrio 97 g de este mineral y estos fueron
tapados con una lámina de aluminio (Figura 1).

Los tratamientos estuvieron conformados por (0 sacarosa y 10 g.L-1 de sacarosa

de AIB (0 y 9.8 µM), tres concentraciones de Pectimorf ® (3, 5, 7 mg L-1). Se
40
emplearon como tratamientos controles: el medio de cultivo de enraizamiento
propuesto por Posada et al. (2009) que estaba compuesto por las sales MS al 50
% de su concentración, 9.8 µM de AIB, 0.4 mg.L -1 de tiamina, sacarosa 40 g.L-1,
agar 7.0 g.L-1 y el mismo medio de cultivo pero con zeolita, 0.98 µM de AIB y sin
sacarosa.

Experimento II

En este experimento se emplearon las siguientes concentraciones 9 y 12 mg.L -1

de Pectimorf®.

Ambos experimentos tuvieron treinta y tres repeticiones por cada tratamiento,

colocando 2 brotes por frasco de cultivo, de una longitud de 3-4 cm y 3-4 hojas. De
ellas se seleccionaron al azar 20 repeticiones a partir de los 37 días de cultivo
para las evaluaciones de indicadores morfológicos y fisiológicos (pigmentos
clorofílicos, actividad fotosintética y conductancia estomática) de las plantas. A la
vez otro grupo de plantas por tratamiento fueron llevadas a condiciones de
aclimatización para evaluar la supervivencia (%) en los primeros sietes días de
plantadas.

3.2. Efecto del Floroglucinol® en el enraizamiento y la aclimatización in vitro

de los brotes de papaya.

Tomando en cuenta los resultados del experimento anterior el objetivo de este

experimento fue determinar el efecto del Floroglucinol® (uno de los productos de la
degradación del florizin, es un compuesto fenólico conocido con propiedades de
regulador del crecimiento, Kumar et al. (2005)) para el enraizamiento de los brotes
in vitro, utilizando como soporte el mineral zeolita estéril. Todas las condiciones
del experimento fueron iguales al experimento con Pectimorf®.

Se emplearon tres concentraciones de Floroglucinol® (10, 15, 20 mg L-1) basados

en estudios previos no mostrados en el trabajo. Se emplearon como tratamientos
controles: el medio de cultivo de enraizamiento propuesto por Posada et al. (2009)

41
que estaba compuesto por las sales MS al 50 % de su concentración, 9.8 µM de
AIB; 0.4 mg.L-1 de tiamina, sacarosa 40 g.L-1, agar 7.0 g.L-1 y pH 5.8 previo a la
esterilización y el medio de cultivo con zeolita, 0.98 µM de AIB y sin sacarosa.
Este experimento tuvo 30 plantas por tratamiento. Las evaluaciones morfológicas
y fisiológicas a este experimento se realizaron a los 27 días de cultivo. A la vez
otro grupo de plantas por tratamiento fueron llevadas a condiciones ex vitro en la
fase de aclimatización para evaluar la supervivencia (%) en los primeros siete
días.

Tabla 1. Características físico-química de la zeolita

Composición química (%)

Óxido de Silicio (SiO2) 70.10

Óxido de Aluminio III (Al2O3 ) 11.20

Óxido de Hierro III (Fe2O3 ) 2.20

Óxido de Hierro II (FeO) 0.30

Óxido de Magnesio (MgO) 0.60

Óxido de Calcio (CaO) 4.50

Óxido de Sodio (Na2O) 1.50

ÓxidodePotasio (K2O) 1.30

Pentóxido de difósforo (P2O5 ) 0.07

Agua (H2O) 4.70

Composición mineral %

Clinoptilolita 40.00

Modernita 40.00

42
Otros (Calcita, cuarzo, feldespato) 20.00

Propiedades físicas Valor

Tamaño de la partícula 1.0-3.0 mm

Densidad (δ) 0.37 g cm-3

Densidad de la fase sólida (γ) 1.77 g cm-3

Porosidad total (PT) 80.59 % vol.

43
Resultados y Discusión
44
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

4.1. Efecto de la sacarosa, la auxina y el Pectimorf® en el enraizamiento y la

aclimatización in vitro de los brotes de papaya.

Experimento I

El mejor resultado para todas las variables morfológicas evaluadas se alcanzó en

el tratamiento control con zeolita, sin sacarosa, sin Pectimorf® y 9.8 µM de AIB.
Este tratamiento tuvo una respuesta igual o superior al resto de los tratamientos,
con diferencias significativas con los mismos. Ninguna de las concentraciones de
Pectimorf® empleadas en este primer experimento (3-7 mg.L-1) superaron los
resultados del tratamiento control zeolita (tabla 2), sin embargo es de destacar que
todos fueron superiores al control con agar y con 40 g.L-1 de sacarosa.

Para el caso de las variables relacionadas con el enraizamiento (longitud de raíz,

número de raíces y porcentaje de enraizamiento) el tratamiento control con zeolita
fue también superior al resto de los tratamientos con diferencias significativas
(Tabla 2).

De manera general se observó en el experimento que las concentraciones de

Pectimorf® no estimularon la longitud de la raíz, ni el número de estas. Solo se
alcanzó un 50.0 % de enraizamiento en el tratamiento sin sacarosa, 9.8 µM de AIB
y 7 mg.L-1 de Pectimorf ® inferior al 62.5 % del tratamiento control con zeolita.

En los tratamientos donde no estuvo presente la sacarosa en el medio de cultivo,

las plantas crecieron y se desarrollaron de forma normal comparados a los
tratamientos con sacarosa (10 y 40 g.L-1 control). Esto presupone que las plantas
in vitro de papaya en estas condiciones de cultivo tuvieron un comportamiento
fotoautotrófico (Tabla 2). No obstante es importante destacar que a estas
concentraciones de sacarosa anteriormente señaladas no se obtuvieron plantas
con raíces o fue muy bajo el porcentaje de enraizamiento, solamente un 5.0 %.

45
Tabla 2. Efecto de la combinación sacarosa, AIB y Pectimorf® en el crecimiento y enraizamiento de las plantas in vitro de papayavar. Maradol roja
creciendo en frascos de cultivo con zeolita como soporte, a los 37 días de cultivo.

Sacarosa AIB Concentración Altura No. de Peso No. Longitud No. de Enraizamiento
hojas fresco Entrenudos raíces
(g.L-1) (µM ) de Pectimorf® (cm) planta de la raíz (%)
(mg.L-1) (gMF) (cm)

0 0 3 3.58 b 3.78 cd 0.42 bc 10.14 a 0.12 b 0.28 b 5

0 0 5 4.19 a 4.55 a 0.47 b 11.05 a 0.01 b 0.05 c 5

0 0 7 3.88 ab 3.90 bc 0.50 ab 10.20 a 0.18 ab 0.10 b 5

0 9.8 3 4.13 a 3.69 cd 0.60 a 12.70 a 0.11 b 0.54 ab 28.6

0 9.8 5 3.68 b 4.18 b 0.52 b 11.87 a 0b 0c 0

0 9.8 7 4.02 a 4.18 b 0.52 ab 11.87 a 0.32 a 1.81 ab 50.0

10 9.8 3 4.0 a 3.44 d 0.46 bc 8.88 a 0b 0c 0

10 9.8 5 3.38 c 4.00 b 0.33 c 8.00 b 0b 0c 0

10 9.8 7 3.36 c 3.66 d 0.32 c 7.11 b 0.04 b 0.11 b 5

0 Control 9.8 0 4.24 a 6.03 a 0.73 a 9.68 a 0.58 a 2.03 a 62.5

Zeolita
40 9.8 0 3.62 bc 3.26 d 0.42 bc 9.26 a 0b 0c 0
Control agar
Significación * * * * * *

Medias con letras no comunes dentro de la misma columna difieren estadísticamente según prueba no paramétrica deKruskal-Wallis
/ Mann-Whitney para P< 0.05 (n=20)

47
No siempre en todas las plantas cultivadas in vitro la eliminación de la sacarosa en
el medio de cultivo presupone el desarrollo de un buen sistema de raíces. Kong-
Sik, So-Young y Kee Yoeup (2013) obtienen en su trabajo en la especie de
orquídea Doritaenopsis, plantas creciendo en medio de cultivo con sacarosa,
mostraron una mayor número y más largas raíces que en el tratamiento sin
sacarosa.

Respecto a la contaminación microbiana, los niveles alcanzados fueron de 10.0-

15.0 % de los frascos de cultivo, donde el medio de cultivo tenía sacarosa, a los
37 días de cultivo. En el resto de los tratamientos sin la presencia de la sacarosa
en el medio de cultivo los valores de contaminación fueron menores del 4.0 %.

Los resultados alcanzados en este primer experimento con llevaron al estudio de

concentraciones más altas, que estimulan el enraizamiento de los brotes in vitro
de papaya var. Maradol roja.

Experimento II

Los tratamientos sin sacarosa, 9.8µM de AIB, zeolita como soporte; 9 y 12 mg.L-1
de Pectimorf® tuvieron una respuesta superior en las variables morfológicas
evaluadas con el resto de los tratamientos, aunque solo se alcanzaron diferencias
significativas para las variables área foliar y peso fresco de las plantas y tuvieron
un misma respuesta para el número de entrenudos (Tabla 3).

48
Tabla 3. Efecto de las concentraciones elevadas de Pectimorf® en el crecimiento y enraizamiento de las plantas in vitro
de papaya var. Maradol roja creciendo en frascos de cultivo con zeolita como soporte, a los 37 días de cultivo.
Sacarosa AIB (µM ) Concentraci Altura No. de Área foliar Peso No. Longitud No. de Enraizamient
ón hojas fresco Entrenudo raíces o
(g.L-1) (cm) (cm2) de la raíz
planta s
de Pectimorf (cm) (%)
(gMF)
(mg.L-1)
0 9.8 7 4.02 4.57 1.32 b 0.56 b 12.77 a 0.35 2.07 52.8
0 9.8 9 4.04 5.21 1.59 a 0.80 a 10.21 ab 0.75 2.15 84.2

0 9.8 12 4.06 5.21 1.50 a 0.84 a 10.72 ab 0.87 1.72 69.0

0 9.8 0 4.24 6.03 1.36 b 0.73 ab 9.67 b 0.58 2.03 63.6

Control
Zeolita
Significación n.s n.s * * * n.s n.s

Medias con letras no comunes dentro de la misma columna difieren estadísticamente según prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis
/ Mann-Whitney para P< 0.05 (n=20)

49
Respecto a la variable longitud de las raíz más larga, los valores más altos se
obtuvieron en ambos tratamientos (9 y 12 mg.L -1 de Pectimorf®), no así en el
número de raíces por planta, donde aunque se tuvieron resultados superiores a
las concentraciones más bajas de Pectimorf® (7 y 9 mg.L-1), pero sin diferencias
significativas entre los distintos tratamientos. Estos no superaron el control con
zeolita (Tabla3). Sin embargo el mayor porcentaje de enraizamiento 84.2 % fue
alcanzado con la concentración de 9 mg.L-1 de Pectimorf®, siendo superior al resto
de los tratamientos y al control, a los 37 días de cultivo.

Los resultados del presente trabajo coinciden con otros trabajos realizados por
otros autores empleando Pectimorf® en el cultivo de la yuca (Manihot sculenta L.)
por Hernández et al. (2013) quienes obtuvieron los mejores resultados con 9 mg.L -
1
de Pectimorf® para aumentar el enraizamiento de los brotes in vitro de yuca y su
aclimatización. También en tabaco (Nicotiana tabacum) y Arabidopsis thaliana (L.)
Heynh, González et al. (2012), pero utilizando 10 mg.L-1 de Pectimorf® alcanzaron
los mejores resultados, concentración muy cercana a la obtenida en este trabajo.
También estos autores informan que el Pectimorf ® promovió la elongación de la
raíz primaria, igual que el presente trabajo a pesar de ser otro cultivo. También el
Pectimorf® a las concentraciones estudiadas no estimuló la formación de mayor
número de raíces (Tablas 2 , 3 y Figura 2).

CONTROL ZEOLITA 9 MG.L-1 DE PECTIMORF®

50
Figura 2. Aspecto de las plantas de papaya y su sistema de raíces a los 37 días de
cultivo en frascos con zeolita como soporte. Izquierda: Tratamiento control, sin
sacarosa, zeolita y 9.8 µM de AIB. Derecha: Tratamiento con 9 mg.L -1 de
Pectimorf®, sin sacarosa, zeolita y 9.8 µM de AIB.

En el cultivo in vitro de la papaya es conocido el uso del regulador del crecimiento

AIB para la formación de raíces (Suksa-Ard et al., 1998; Panjaitan et al., 2007;
Posada et al., 2007), sin embargo este regulador del crecimiento en el medio de
cultivo semisólido estimula la formación de un callo basal que impide o hace
infuncional algunas de las raíces que se forman por no tener conexión con el tallo.
En ninguno de los tratamientos con zeolita como soporte se formó callo basal en
los brotes, a pesar de estar presente el AIB a la concentración de 9.8 µM. La
zeolita también permitió un mejor crecimiento y desarrollo de las raíces, dado por
la mayor aireación que reciben las raíces durante su crecimiento in vitro.
Resultados estos que anteriormente no se habían obtenido para este cultivo. No
obstante en el cultivo de la papaya in vitro se han utilizado la vermiculita como
soporte para el enraizamiento de los brotes.

Suksa-Ard et al. (1998) y Panjaitan et al. (2007) informan del uso de la vermiculita
combinado con el AIB para el enraizamiento de distintas variedades de papaya.
Estos autores señalan el efecto beneficioso de la vermiculita para lograr altos
porcentajes de enraizamiento (80-90 %). Sin embargo Kumar et al. (2012) señalan
en su trabajo el efecto superior del AIB sobre otras auxinas (ANA; AIA) para lograr
el enraizamiento de brotes in vitro de papaya, pero en medio de cultivo semisólido

Al analizar los resultados de las variables fisiológicas evaluadas (fotosíntesis,

transpiración y conductancia estomática) el tratamiento control con zeolita tuvo los
mayores valores de fotosíntesis, sin embargo también mayor transpiración y
conductancia estomática con diferencias significativas con el resto de los
tratamientos, lo cual es negativo para la aclimatización de las plantas in vitro a las
condiciones ex vitro ya que hay una mayor pérdida de agua (Tabla 4). El
tratamiento con 9 mg.L-1 de Pectimorf® tuvo menor nivel de fotosíntesis, pero

51
 también menos transpiración y conductancia estomática, teniendo una mejor
respuesta que el control.

Tabla 4. Efecto del Pectimorf® sobre la actividad fotosintética (mol CO2 m-2s-1),
transpitaroria (mmol H2O m-2s-1) y conductancia estomática (µmol CO2/mmol
H2O) en plantas de papaya var. Maradol roja cultivadas in vitro en frascos con
zeolita como soporte.

Sacarosa AIB Concentración Fotosíntesis Transpiración Conductancia

(g.L-1) (µM) de Pectimorf® (µmol CO2) (mmol H2O) estomática
(mg.L-1) (µmol CO2/mmol H2O)
0 9.8 7 1.481 d 0.666 d 12.14 c

0 9.8 9 3.548 b 1.298 b 24.26 b

0 9.8 12 3.070 c 0.793 c 18.66 b

0 9.8 0 3.828 a 1.506 a 34.85 a

Control
Zeolita

Significación * * *

Medias con letras no comunes dentro de la misma columna difieren

estadísticamente según prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis / Mann-Whitney
para P< 0.05 (n=120) Las mediciones se realizaron a los 37 días de permanecer
las plantas en estas condiciones de cultivo.

Los resultados anteriormente descritos son apoyados por los datos presentados
en la tabla 5, donde se muestran el porcentaje de estomas abiertos y cerrados, así
como el número total de estos por mm -2. El porcentaje de estomas abiertos (35 %)
fue mayor en las hojas de las plantas de papaya en el control con zeolita con
respecto a las hojas de las plantas de los tratamientos con 9 y 12 mg.L -1 de
Pectimorf®, 26.44 y 33.30 % respectivamente. También en el tratamiento control
zeolita el número total de estomas por área fue superior en comparación con el
52
tratamiento con 9 mg.L-1 de Pectimorf®. Esto unido a un mayor porcentaje de
plantas con raíces permitió alcanzar a los 7 días en condiciones de aclimatización
el mayor porcentaje de supervivencia (56.2%) respecto al resto de los tratamientos
(Figura 3).

Figura 3. Plantas in vitro de papaya variedad Maradol roja y el control de semilla

en condiciones de aclimatización, a los 7 días de plantadas.

Es importante señalar la respuesta de las plantas del tratamiento control agar, las
cuales no tenían raíces y producto de las condiciones del cultivo in vitro con alta
humedad relativa dentro del frasco de cultivo, las plantas tuvieron un alto
porcentaje de estomas abiertos 72.4 % y a pesar de no tener un alto número de
estomas por área, el 100 % de las plantas no sobrevivieron a las condiciones ex
vitro de aclimatización (Tabla 5).

53
Tabla 5. Efecto del Pectimorf® en los estomas de las hojas y la supervivencia de las plantas in vitro de papaya var.
Maradol roja a los 37 días de cultivo y 7 días después de plantadas en condiciones de aclimatización
Sacarosa AIB Concentración Estomas abiertos Estomas Número total de Supervivencia
cerrados Estomas
(g.L-1) (µM) de Pectimorf® (%) (%)
-2
(%) mm
(mg.L-1)

0 días 7 días 0 días 7 días 0 días 7 días

0 9.8 9 26.14 66.60 73.86 33.40 88 69 56.2

0 9.8 12 33.30 71.76 66.67 28.40 117 60 40.8

0 9.8 0 35.00 24.50 65.00 73.60 100 60 48.9
Control
Zeolita
40 9.8 0 72.41 27.59 87 0.0
Control
Agar

Plantas de 27.5 72.5 40

semillas

54
Autores como Sáez et al. (2012) informan que al comparar la densidad estomática
en hojas de plantas cultivadas in vitro con otras en condiciones de invernadero
encontraron que la densidad estomática es más del doble en las plantas in vitro
que las de invernadero. Además encontraron diferencias en el tamaño y el número
de estomas. Las plantas in vitro de la especie leñosa Castanea sativa tuvieron una
mayor proporción de estomas abiertos que las plantas de invernadero. En el
presente trabajo de investigación fue posible cambiar esta proporción, debido a las
condiciones empleadas que permitieron su aclimatización in vitro como
fotoautotrofismo (medio de cultivo sin sacarosa), zeolita como soporte, aperturas
en la cubierta de los frascos permitiendo una mayor aireación y alta supervivencia
de las plantas.

Al respecto (Franck et al. 2006) señalan que la sacarosa juega un papel

fundamental en el mecanismo que media en el control de la regulación por
disminución de la fotosíntesis provocando su caída. La baja tasa de regeneración
del sustrato para carboxilación de la Ribulosa bifostato (RuBP) debido a la
acumulación de azúcares solubles en las hojas es el posible resultado en la
inhibición de la fotosíntesis (Azcon-Bieto, 1983). Sin embargo, resultados
obtenidos por esto autores indican que una mayor cantidad de gránulos de
almidón se han encontrado en los cloroplastos de hojas de plantas cultivadas en
vivero probablemente como parte del producto de almacenamiento. Por el
contrario en las plántulas en crecimiento in vitro no mostraron gránulos de
almidón, probablemente debido a que la tasa de fotosíntesis es muy baja o la
exógena sacarosa provoca una retroalimentación negativa sobre las enzimas a
nivel de plastídio para la biosíntesis del almidón (Krapp y Stitt, 1994).

El Pectimorf® ha sido utilizado por varios autores para inducir el enraizamiento en

diferentes especies de plantas (Hernandez et al. 2007, 2009; Falcón y Cabrera
2007; Domini y Benitez, 2004). Todos estos autores señala que la concentración
adecuada para el cultivo in vitro de plantas de uso del Pectimorf® como regulador
del crecimiento es alrededor de los 10 mg.L -1, lo cual apoya los resultados
obtenidos en la presente investigación. Sin embargo los mecanismos que explican
55
la estimulación del Pectimorf en la división celular en las plantas superiores son
aún desconocidos. Es también conocido que este oligogalacturonido es un
antagonista en la acción de la auxina (González et al. 2012) sobre todo con el AIA,
el cual tiene un papel positivo en la regulación de la formación o iniciación de las
raíces laterales.

4.2. Efecto del Floroglucinol® en el enraizamiento y la aclimatización in vitro

de los brotes de papaya.

La mejor concentración de floroglucinol® que estimuló el crecimiento de las plantas

fue 10 mg.L-1 con diferencias significativas con el resto de los tratamientos y
controles para la variable altura. Sin embargo alcanzó los menores valores en
relación al peso fresco de las plantas y el número de entrenudos (Tabla 6).
Respecto a las variables relacionadas con el enraizamiento se alcanzaron los
mayores valores en la longitud de la raíz más larga y el número de raíces con
diferencias significativas con ambos controles en todas las concentraciones de
floroglucinol®. El floroglucinol® estimuló la elongación y la formación de nuevas
raíces, duplicando en esta ultima variable al control con zeolita, sin este regulador
del crecimiento. Se destaca por encima de todos los tratamiento, la concentración
de 10 mg.L-1 por alcanzar un 100 % de enraizamiento en solo 27 días de cultivo.
Las plantas en el medio de cultivo control agar alcanzaron un valor medio de peso
fresco, esto fue debido a la formación de un gran callo basal, el cual no se formó
en los tratamiento donde se utilizó la zeolita como soporte (Tabla 6 y Figura 4).

Es de señalar que las raíces de las plantas tratadas con el Floroglucinol

presentaron un gran número de pelos radicales, no así en ambos controles,
característica esta de gran importancia para que las raíces puedan realizar sus
funciones de toma de nutrientes y agua para la planta. Esto no se había informado
hasta el momento con el uso de otros reguladores del crecimiento y condiciones
de cultivo in vitro para papaya.

56
Tabla 6. Efecto de la Floroglucinol en el crecimiento y enraizamiento de las plantas in vitro de papaya var. Maradol roja
creciendo en frascos de cultivo con zeolita como soporte.
Sacarosa AIB(µM ) Concentración Altura No. de Área Peso No. Longitud No. de Enraizamient
de hojas Foliar fresco Entrenudo raíces o
(g.L-1) (cm) planta s de la
Floroglucinol
(cm2) raíz (%)
(mg.L-1) (gMF)
(cm)
0 9.8 10 4.06 a 4.80 1.63 0.90 b 10.75 b 1.90 a 2.30 a 100 %
0 9.8 15 3.67 b 4.80 1.46 0.53 bc 9.40 bc 1.33 a 1.90 a 93 %

0 9.8 20 3.65 bc 5.05 1.49 0.84 bc 9.70 bc 1.76 a 2.40 a 90 %

0 9.8 0 3.94 4.55 1.51 0.54 bc 12.55 a 0.36 b 1.37 b 50 %
abc
Control
Zeolita
40 9.8 0 3.44 bc 5.15 1.80 3.51 a 8.25 bc 0.53 b 0.50 b 25 %
Control agar
Significación * n.s n.s * * * *

Medias con letras no comunes dentro de la misma columna difieren estadísticamente según prueba no paramétrica de
Kruskal-Wallis / Mann-Whitney para P< 0.05 (n=20) Las mediciones se realizaron a los 27 días de permanecer las plantas
en estas condiciones de cultivo.

57
El floroglucinol® no estimuló el desarrollo del área foliar de las plantas de papaya
cultivadas in vitro, no se obtuvieron diferencias significativas con los controles sin
el regulador del crecimiento.

Los resultados alcanzados con la determinación de los pigmentos clorofílicos

destacan a la concentración de 20 mg.L-1 de floroglucinol® con los mayores
contenidos de clorofila a y b en las hojas de las plantas iguales al control con agar
a los 27 días de cultivo, pero con diferencias significativas con el resto de los
tratamientos y el control zeolita (Tabla 7). Sin embargo el contenido de
carotenoides fue mayor en todos los tratamientos sin sacarosa y floroglucinol ® y el
control zeolita sin diferencias significativas entre ellos, pero si con el control agar.
Es conocido el papel de los carotenoides por sus propiedades antioxidantes que
reducen los excesos de radicales libres, restaurando el balance fisiológicos en las
plantas (Jalal et al. 2013), lo cual puede ser una explicación a porque los niveles
de carotenoides son superiores en las plantas in vitro de papaya cultivadas en los
medio de cultivo sin sacarosa.

Tabla 7. Efecto del Floroglucinol sobre la actividad de clorofilas (a y b) y

carotenoides en hojas de plantas de papaya var. Maradol roja cultivadas in
vitro en frascos con zeolita como soporte.

Sacarosa AIB Concentración de Clorofila a Clorofila b Carotenoides

®
(g.L-1) (µM ) Floroglucinol (mg.g-1) (mg.g-1) (mg.g-1)
(mg.L-1)
0 9.8 10 0.074 b 0.083 b 0.146 a

0 9.8 15 0.077 b 0.072 b 0.169 a

0 9.8 20 0.175 a 0.171 a 0.181 a

0 9.8 0 0.089 b 0.068 b 0.174 a

Control Zeolita

40 9.8 0 0.143 a 0.161 a 0.072 b

Control agar

58
 Significación * * *

Medias con letras no comunes dentro de la misma columna difieren

estadísticamente según prueba Dunnett C para P< 0.05 (n=10). Las mediciones se
realizaron a los 27 días de permanecer las plantas en estas condiciones de cultivo.

Aunque es conocido que el contenido de clorofila no está directamente

relacionado con la capacidad fotosintética, no obstante es un buen indicador del
estado del aparato fotosintético (Saez et al. 2012).

Todos los tratamientos presentaron condiciones fotoautróficas (tratamientos y

control zeolita) y mixotroficas (el control agar) ya que en todas las hojas de las
plantas in vitro realizaron fotosíntesis, a los 27 días de cultivo. Sin embargo los
mayores valores se presentaron en la concentración de 10 mg.L -1 con diferencias
significativas con el resto de los tratamientos (Tabla 8).

Tabla 8. Efecto del Floroglucinol® sobre la actividad fotosintética (mol CO2 m-2s-1),
transpiratoria (mmol H2O m-2s-1) y conductancia estomática (µmol CO2/mmol
H2O) en plantas de papaya var. Maradol roja cultivadas in vitro en frascos con
zeolita como soporte.

Sacarosa AIB Concentración de Fotosíntesis Transpiración Conductancia

(g.L-1) (µM) Floroglucinol® (µmol CO2) total estomática
(mg.L-1) (mmol H2O) (µmol CO2/mmol H2O)
0 9.8 10 6.497 a 0.992 b 24.25 b

0 9.8 15 5.957 b 0.833 c 19.15 c

0 9.8 20 5.165 c 0.685 d 15.22 d

0 9.8 0 4.246 d 0.701 d 18.27 c

Control Zeolita

59
 40 9.8 0 3.649 d 1.387 a 35.00 a

Control agar

Significación * * *

Medias con letras no comunes dentro de la misma columna difieren

estadísticamente según prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis / Mann-Whitney
para P< 0.05 (n=120). Las mediciones se realizaron a los 27 días de permanecer
las plantas en estas condiciones de cultivo.

Respecto a la transpiración total de las hojas fue mayor en el control agar con
diferencias significativas con el resto de los tratamientos y el control zeolita, lo cual
es unido al mayor valor de conductancia estomática, lo cual provoco gran perdida
de agua por las plantas y esto hizo que los valores de la supervivencia a los 7 días
fueran de solo 25.7 % (Tabla 9).

La concentración de 10 mg.L-1 de floroglucinol® alcanzó valores inferiores a ambos

controles para las variables transpiración total y conductancia estomática, lo que
unido al tener los porcentajes más bajos de los estomas cerrados (2.81 y 12.65%)
a los 0 y 7 días respectivamente en condiciones ex vitro permitió a las plantas in
vitro de papaya cultivadas a esta concentración lograr el mayor porcentaje de
supervivencia 72.5 % (Tabla 9).

60
Tabla 9. Efecto del Floroglucinol en los estomas de las hojas y la supervivencia de las plantas in vitro de papaya var.
Maradol roja a los 27 días de cultivo y 7 días después de plantadas en condiciones de aclimatización.

Sacarosa AIB Concentración Estomas abiertos Estomas Número total de Supervivencia

cerrados Estomas
(g.L-1) (µM) de (%) (%)
-2
Floroglucinol (%) mm
(mg.L-1)
0 días 7 días 0 días 7 días 0 días 7 días

0 9.8 10 2.81 12.65 97.19 87.35 142 72 72.5

0 9.8 15 62.74 33.80 37.26 66.20 102 86 66.4
0 9.8 20 81.37 73.40 18.63 26.60 102 88 54.8
0 9.8 0 34.00 25.40 66.00 74.60 100 59 47.3
Control
Zeolita
40 9.8 0 72.41 66.58 27.59 33.42 87 79 25.7
Control
Agar

61
Al respecto Kozai y Zobayed (2000) informan que con la micropropagación foto-
autotróficas la formación de las raíces, el desarrollo y crecimiento in vitro las
plantas son fisiológicamente y morfológicamente normales. Las plantas son
capaces de controlar la transpiración y por lo tanto tener una menor perdida de
agua cuando son expuestas a condiciones ambientales ex vitro. Una de las
razones puede ser una alta porosidad del material de soporte lo cual permite una
alta disolución de las concentración del oxígeno alrededor de la base del brote.

En este experimento los niveles de contaminación microbiana fueron menores del

2 % para todos los tratamientos evaluados donde los frascos de cultivo tenían 2
oficios en el papel de aluminio.

Este regulador del crecimiento hasta el momento en la literatura consultada no

había sido estudiado en el cultivo in vitro de la papaya. No obstante ha sido
empleado en otros cultivos para estimular o potenciar la acción de la auxina en el
medio de cultivo.

Husain et al. (2008) para el enraizamiento de brotes in vitro de Pterocarpus

marsupium empleando el Floroglucinol® y AIB encontraron una alta frecuencia de
plantas con raíces (70%) muy superior al control, así como un mayor largo de las
raíces y un mayor número. Resultados similares fueron obtenidos en el presente
trabajo en las plantas in vitro de papaya. Otros autores como Webs and Jones
(1989) y Modgil et al. (1999) informan también que el Floroglucinol ® incremento el
porcentaje de enraizamiento y Sharma et al. (2000) un mayor número de raíces
por plantas, pero no fue igual para todos los cultivares.

Teixeira da Silva, Dobranszki y Ross (2013) señalan que la adición de este

regulador del crecimiento en el medio de cultivo para el enraizamiento de los
brotes in vitro de conjunto con la auxina estimuló el enraizamiento porque el
Floroglucinol actúa en sinergismo con la auxina o como protector de ella.

62
Figura 4. Plantas in vitro de papaya var. Maradol roja en las distintas
concentraciones de Floroglucinol® y el control agar después de 27 días de cultivo.
Superior izquierda: Planta in vitro cultivada con 10 mg.L-1 de Floroglucinol®.
Superior derecha: Plantas in vitro en el medio de cultivo control con agar, con
formación de callo basal. Inferior: Comparación del sistema de raíces en las
distintas concentraciones de Floroglucinol® 0 (agar), 10, 15 y 20 mg.L-1

63
5. CONCLUSIONES

1. El Pectimorf® a una concentración de 9 mg.L-1, en combinación con el AIB

9.8 µM, zeolita como soporte y sin sacarosa en el medio de cultivo se
alcanzó el mayor número de plantas con raíces y la aclimatización in vitro
de las mismas en niveles adecuados.

2. El Floroglucinol® a la concentración de 10 mg.L-1, combinado con el AIB, 9.8

µM, zeolita como soporte y sin sacarosa en el medio de cultivo permitió
alcanzar un 100 % de enraizamiento, un mayor número de raíces por
planta, la formación de pelos radiculares y la aclimatización in vitro de las
plantas de papaya.

64
6. RECOMENDACIONES

1. Continuar los estudios en fase de aclimatización por más tiempo con

plantas de papaya provenientes de los distintos medios de cultivo
estudiados en el presente trabajo.

2. Realizar estudio comparativo entre la mejor concentración de Pectimorf® y

Floroglucinol® obtenidas.

3. Evaluar otras concentraciones más bajas de Floroglucinol® en brotes in vitro

de papaya.

65
7. BIBLIOGRAFÍA.

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