Guia Practica de Inmunologia

UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
MANUAL DE LABORATORIO DE
INMUNOLOGIA
Elaborado por:
Q F. Lourdes Amalia Suárez C

Universidad de Guayaquil
Facultad de Ciencias Químicas
Carrera: Química y Farmacia
Guía de Prácticas de Laboratorio
Asignatura INMUNOLOGIA
Campo de PRAXIS PROFESIONAL

formación
Código 061 Semestre Octavo Período 2018-2019 Ciclo C-I
Relación de prácticas de laboratorio
Unidad 1 PROPIEDADES Y GENERALIDADES DE LA RESPUESTA INMUNE
Práctica 1: Normas de bioseguridad en el laboratorio, aplicado a la inmunología
Práctica 2: Técnicas de aglutinación, Investigación de Sífilis
Práctica 3: Técnicas de aglutinación, Investigación de Pruebas Reumáticas
Práctica 4: Técnicas de aglutinación, de Aglutinina Febriles
Unidad 2 MOLÉCULAS Y CÉLULAS QUE REACCIONAN CON EL ANTÍGENO
Práctica 5: de Elisa Investigación de Chagas por técnica de hemaglutinación
Práctica 6: Investigación de Inmunoglobulinas por técnica de Elisa
Práctica 7: Investigación de Hormona LH por técnica de Elisa
Práctica 8: Investigación de Hormonas Tiroideas por técnica de Elisa
Unidad 3 MÉTODOS INMUNOLÓGICOS Y APLICACIONES

Práctica 9: Investigación de Citomegalovirus por técnica de Elisa
Práctica 10: Investigación de Herpes por técnica de Elisa
Práctica 11: : Investigación de Marcador tumoral PSA por técnica de Elisa
Práctica 12: Investigación de Marcador tumoral CEA por técnica de Elisa
Unidad 4 INMUNIDAD FRENTE A PATÓGENOS
Práctica 13: Investigación de Paludismo por técnica de inmunocromatografia
Práctica 14: Investigación de Sangre oculta por Técnica Inmunocromatográfica
Práctica 15: Investigación de Hormona Prolactina por técnica de Elisa
Práctica 16: Investigación de H. Pylori por técnica de Elisa
Cargo Fecha Firma

Elaborado
Q.F. Amalia Suárez C. Mg.
por: Docente TC,
12-11-2018
Q.F.Gina Johnson H. Mg. Docente TC, 12-11-2018
Q. F. Celeste Carrillo T. M.Sc Docente TC, 12-11-2018
Jefe de
Revisado Dr. Luis Cazar Ubilla Mg.
departamento
por:
Gestor
Q.F. María José Morales
Revisado Pedagógico
Estupiñán M.Sc
por: Curricular
Aprobado Q.F. Nilda Cedeño Albán Mg. Decana

por:
Secretaría
Analista
de la Diana Elizabeth Villao Valle
carrera
Número N° NORMAS DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO, APLICADO A LA
1 INMUNOLOGÍA
Objetivos de la práctica de laboratorio
1-Aplicar las normas de bioseguridad en el laboratorio de Inmunología
2- Describir cada uno de los elementos de protección personal en el Laboratorio de Inmunología
3-Determinar el nivel de bioseguridad del laboratorio de Inmunología
Instrucciones o consideraciones previas
Conocer los protocolos de laboratorios de ensayos biológicos
Conocer las señaléticas de Riesgo biológico
Conocer los dispositivos de bioseguridad
Reactivos de laboratorio
No se hará usos de ningún reactivo de laboratorio
Materiales de laboratorio
1- Guardián
3- Recipientes para eliminar desechos biológicos
2- Botiquín para primeros auxilios
Equipos de laboratorio
No se hará usos de ningún equipo de laboratorio
Actividades por desarrollar/ técnica operatoria
Exposición dialogada, lluvia de ideas, realización de un simulacro de bioseguridad
Se les trasmitirá un video de bioseguridad y presentaran imágenes/gráficos de diferentes situaciones
en el laboratorio para su análisis y discusión. Posteriormente procederán a desarrollar el siguiente
trabajo grupal en clases (traer 1 hoja de papel ministro por grupo):
1. De acuerdo con el video visto en clase señale lo positivo, lo negativo y lo interesante.
2. Señale cinco (5) de las normas de bioseguridad para permanecer en las áreas del
laboratorio.
3. Señale cinco (5) de los hábitos que se deben desarrollar para trabajar adecuadamente en
un laboratorio.
4. Indique:
a. ¿Qué debería realizar si observa un reactivo destapado?
b. ¿Por qué se debe usar zapato cerrado y preferiblemente de goma o suela plana en el
laboratorio?
c. ¿Qué protección le brinda el uso del mandil, lentes y guantes?, de ejemplos.
5. Mencione 5 pictogramas, con su respectivo significado, de acuerdo con lo observado en
el video.
6. Establecer 5 semejanzas y 5 diferencias entre las normas de seguridad empleadas en un
laboratorio clínico, de alimentos y farmacéutico. Mencione la diferencia más relevante para
Uds., y el ¿por qué?
Resultados obtenidos
Apartado a desarrollar por parte del estudiante.
Conclusiones
Recomendaciones
Bibliografía
1-INMUNOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR (5a ed.) Abul k. Lichtman, 2004
2-INMUNOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR (8a ed.)Abul K. Abbas, Andrew H. Lichtman, Shiv
Pillai, 2015.
3-INMUNOLOGÍA BÁSICA Y CLÍNICA (2a ed.) Mark Peakman, Diego Vergani, 2011
Número de INVESTIGACIÓN DE SÍFILIS POR TÉCNICA DE AGLUTINACIÓN
la Práctica
#2
1. Detectar por acción de las reaginas con antígeno de cardiolipina, lecitina y colesterol adsorbido
sobre partículas de carbón la presencia de aglutinación.
 Conocer los reactivos a utilizar.
 Analizar e interpretar el inserto del reactivo a utilizar.
FUNDAMENTO DEL MÉTODO

Las "reaginas", presentes en individuos infectados por T. pallidum se detectan en suero por la
reacción con un antígeno cardiolipínico purificado y estabilizado. Si la muestra contiene reagina,
ésta se unirá al antígeno produciendo una floculación visible en microscopio. Las reacciones
inespecíficas se evitan con el empleo de antígeno altamente purificado y el agregado de cloruro de
colina característica de la técnica USR (Unheated Serum Reagin) en la que no es necesario
inactivar la muestra.
A. Reactivo A:
Suspensión de antígeno de cardiolipina 0,003%, lecitina 0,02% y colesterol 0,09%, adsorbido sobre
partículas de carbón 0,02% especialmente tratado en buffer fosfatos 0,01 mol/l con cloruro de colina
0,72 mol/l, EDTA 12,5 mmol/l y conservantes apropiados.
Control Positivo: dilución de suero reactivo.
Control Negativo: dilución de suero no reactivo.
1.- Tarjetas de reacción
2.-Gotero metálico para dispensar el Reactivo
3.-Goteros plásticos descartables para dispensar y distribuir
las muestras
4.-Agitador rotativo de 100 rpm
N/A
PRUEBA CUALITATIVA
Llevar a temperatura ambiente los reactivos y la muestra antes de realizar el ensayo.
En cada uno de los círculos de la tarjeta de reacción colocar con un gotero plástico
provisto:870860022 / 00 p. 2/9
Muestra o Controles 1 gota (50 ul)
Con el extremo cerrado del gotero distribuir la muestra uniformemente en todo el círculo.Con el
gotero metálico provisto, en posición vertical, agregar en el centro del círculo:
Reactivo A 1 gota (17 ul)
SIN MEZCLAR, hacer rotar horizontalmente la tarjeta de reacción en forma manual o con agitador
rotativo a 100 rpm durante 8 minutos. Observar la presencia o ausencia de aglutinación al cabo de
este tiempo. Tiempos de lectura mayores pueden dar lugar a falsos resultados.
PRUEBA SEMICUANTITATIVA
Efectuar diluciones seriadas 1:2, 1:4, 1:8, hasta 1:64 empleando solución fisiológica y proceder de
la misma manera que en la técnica cualitativa. El título estará dado por la inversa de la última dilución
que se observe reactiva.
Resultados obtenidos (Observaciones, cálculos, datos, ecuaciones, tablas, gráficos, figuras, fotos)
Reactivo: presencia de aglutinación visible en forma de grumos negros sobre el fondo claro que
indica presencia de "reaginas" en la muestra.
No reactivo: aspecto gris homogéneo que indica ausencia de "reaginas" en la muestra.
Conclusiones Apartado a desarrollar por parte del estudiante.
Recomendaciones
 Usar los elementos de protección personal.(mandil, guantes etc.)
 Seguir la técnica paso a paso, empleando las debidas medidas de bioseguridad.
 Manipular los reactivos con prolijidad, para evitar su contaminación
Bibliografía
- Zinsser Microbiología, Joklik W., Willett H. y Amos D., 17 edición Editorial Médica Panamericana,
1983.
- Manual of Tests for Syphilis, cap. 8 - American Public Health Association, Washington, D.C 20005,
1990.
- McGrew, B.E. et al. - Am. J. Clin. Path. 50:52, 1968.
- Stevens, R.W. and Stroebel, E. - Am. J. Clin. Path. 53:32, 1970.
Número TÉCNICAS DE AGLUTINACIÓN –PRUEBAS REUMÁTICAS
de la
Práctica
#3
1- Aprender el fundamento de la técnica de aglutinación o floculación.
2- Conocer la reacción antígeno y anticuerpo
3- Conocer la significación clínica de la prueba, que servirá como herramienta diagnóstica para
el tratamiento y curación de los pacientes afectados con la enfermedad .

1. Revisar conceptos y definiciones sobre técnicas de aglutinación en reacciones química
2. Investigar sobre los reactivos a emplear.
3. Revisión e interpretación de la técnica

Los Factores Reumatoides, grupo de anticuerpos del tipo IgM, se detectan mediante una
reacción inmunológica de aglutinación. El Reactivo látex-FR posee inmunoglobulinas IgG
humanas, absorbidas sobre las partículas de látex. Mezclando de forma directa la muestra
con el Reactivo látex-FR, la presencia de Factores Reumatoides (con capacidad anti IgG)
provocan la aglutinación de las partículas de látex, que se visualiza macroscópicamente
A. Reactivo A: suspensión de partículas de látex-poliestireno sensibilizadas con anticuerpos anti-
PCR.
B. Control Negativo: dilución de suero negativo.
C. Control Positivo: dilución de suero positivo.
1.-Pipetas automáticas
2.-tubos de ensayo
3.- Puntas descartables para pipetas automáticas.
4.-Placas de plástico o vidrio de fondo negro
1.-Microscopio
2.- Centrifuga
3.- Estufa

PROCEDIMIENTO Llevar los reactivos y las muestras a temperatura ambiente antes de usar.
Agitar el Reactivo A antes de usar, vaciando previamente la pipeta del gotero. I-
TECNICA CUALITATIVA Muestra 1 gota Reactivo A 1 gota PCR-látex C directo 870790000 / 02 p.
2/6 Mezclar con un palillo descartable hasta obtener una suspensión uniforme en toda la superficie
del círculo. Inmediatamente disparar un cronómetro, balancear suavemente la placa y observar
macroscópicamente el resultado bajo un haz luminoso dentro de los 2 minutos.
II- TITULACION Los sueros positivos pueden titularse efectuando diluciones seriadas en 8 tubos
de Kahn. a) Colocar 0,5 ml de solución fisiológica en cada uno de los tubos. b) Agregar 0,5 ml de
suero al tubo Nº 1 y mezclar. Transferir 0,5 ml de esta dilución al tubo Nº 2 y mezclar, continuando
así las diluciones hasta el último tubo. Las diluciones así obtenidas equivalen a 1:2, 1:4, 1:8, 1:16,
etc. c) Ensayar cada dilución según la TECNICA I.
Resultados obtenidos (Observaciones, cálculos, datos, ecuaciones, tablas, gráficos, figura

Negativo: suspensión homogénea. Positivo: aglutinación que aparece dentro de los 2 minutos. Se
califica de 1 a 4 +. Título: inversa de la máxima dilución a la que se produce aglutinación visible
macroscópicamente. La concentración aproximada de PCR en la muestra puede ser calculada por
la fórmula siguiente: PCR (mg/l) = Título x Sensibilidad de la reacción (6 mg/l) Ejemplo: la muestra
presenta un título de 1:2. Su concentración de PCR es de 2 x 6 = 12 mg/l. METODO DE CONTROL
DE CALIDAD Procesar simultáneamente el Control Negativo y el
Conclusiones
Recomendaciones
 Contar con su mandil y guantes para trabajar en el laboratorio.
Bibliografía
Singer, J.M.; Plotz, C.M.; Parker, E. and Elster, S.K. - Am. J. Clin. Path. 28:611 (1957). - Nilson,
L.A. - Acta Pathol. Microbiol. Scand. 73:129 (1968). - Scherffarth, F.; Pérez-Miranda, M.; Goetz, H.
- Blut. 20: 296 (197
Número de INVESTIGACIÓN DE ANTÍGENOS FEBRILES POR TÉCNICA DE AGLUTINACIÓN
la Práctica
#4
1- Observar si la muestra contiene los anticuerpos correspondientes y si se produce una
aglutinación visible macroscópicamente.
1. Utilizar los reactivos guardando las precauciones habituales de trabajo en el laboratorio de
inmunología.
2. Todos los reactivos y las muestras deben descartarse de acuerdo a la normativa local
vigente.
FUNTADAMENTO
El suero del paciente se pone en contacto con antígenos específicos. En este caso se utilizan
suspensiones de Salmonellas o Brucellas muertos. Si la muestra contiene los anticuerpos
correspondientes se producirá una aglutinación visible macroscópicamente.
Antígenos Febriles Salmonella: suspensión en solución salina con conservantes apropiados,
conteniendo los siguientes antígenos bacterianos:
- Antígenos Paratyphoid A (Salmonella, antígeno flagelar a).
- Antígenos Paratyphoid B (Salmonella, antígeno flagelar b).
- Antígenos Typhoid H (Salmonella, antígeno flagelar d).
- Antígenos Typhoid O (Salmonella, antígeno somático D).
Antígenos Febriles Brucella: suspensión de antígenos bacterianos (Brucella abortus, cepa 1119-
3) en solución fisiológica con conservantes apropiados. La concentración celular de los antígenos
se encuentra entre el 4 y el 6%. Las bacterias utilizadas se encuentran en fase lisa.
Antígenos Febriles Controles:
- Control Positivo: dilución de suero humano inactivado positivo.
- Control Negativo: dilución de suero humano negativo.
1. Placa de vidrio
2. Micropipetas BBB
3. Tubos de hemólisis
4. Varilla
5. - Reloj o timer
N/A
PROCEDIMIENTO
I- TECNICA RÁPIDA EN PLACA
Colocar en una placa una gota (50 ul) de suero y agregar una gota (50 ul) de suspensión de
Antígeno. C 870090000 / 00 p. 2/6 Mezclar y agitar la placa en forma circular durante 2 minutos.
Observar la presencia o ausencia de aglutinación utilizando una luz indirecta sobre fondo oscuro.
II- TITULACION RAPIDA EN PLACA
1) Dividir una placa de vidrio en sectores de 4 cm2 aproximadamente.
2) Empleando las micropipetas apropiadas colocar en estos sectores 80 ul, 40 ul, 20 ul, 10 ul y 5 ul
de suero límpido. Repetir el procedimiento para un control negativo y uno positivo.
3) Colocar 1 gota de Antígeno previamente agitado sobre cada gota de suero.
4) Mezclar el suero y el Antígeno utilizando una varilla abarcando un área de 2 cm de diámetro
aproximadamente. Debe emplearse una varilla distinta para cada dilución de suero o la misma
varilla mezclando a partir de la muestra más diluida.
5) Agitar la placa durante 2 minutos en forma circular.
6) Observar la aglutinación utilizando luz indirecta sobre fondo oscuro.
Los resultados obtenidos en la titulación en placa se aproximan a los de la prueba en tubo
descripta en Bennett, C.W (ver Bibliografía), considerando las diluciones como se muestra a
continuación:
Conclusiones
Recomendaciones
Bibliografía
- Widal, F. - Bull. Soc. Med. Hop. de Paris 13 (1896).
- Bennett, C.W. Clinical Serology, pág. 145, Charles Thomas Co. (1964).
- Huddleson, J.B. - J. Infect. Dis. 42:242 (1928).
Guía de Prácticas de Laboratorio de Inmunología
Número TÉCNICA DE HEMAGLUTINACIÓN INDIRECTA, INVESTIGACIÓN DE CHAGAS
de la
Práctica
#5
1. Aprender el fundamento de la técnica de hemaglutinación.
2. Conocer la reacción antígeno y anticuerpo
3. Conocer la significación clínica de la prueba, que servirá como herramienta diagnóstica
para el tratamiento y curación de los pacientes afectados con la enfermedad .

1. Revisar conceptos y definiciones sobre técnicas de aglutinación en reacciones química
2. Investigar sobre los reactivos a emplear.
3. Revisión e interpretación de la técnica
FUNDAMENTOS DEL MÉTODO
La hemaglutinación indirecta (HAI), también llamada hemaglutinación reversa pasiva, se
basa en la propiedad que tienen los anticuerpos (que en este caso son anti-T. cruzi) de
producir aglutinación específica en presencia de glóbulos rojos sensibilizados con los
correspondientes antígenos. En el suero existen anticuerpos inespecíficos (heterófilos) que
son capaces de aglutinar glóbulos rojos de distintas especies. Su presencia se investiga
enfrentando el suero con GR no sensibilizados. Los anticuerpos interferentes se eliminan
mediante tratamiento con 2-mercaptoetanol
Antígeno HAI A-V: suspensión de glóbulos rojos de ave sensibilizados con antígenos
citoplasmáticos y de membrana de T. cruzi en buffer fosfatos con ClNa, 8,5 g/l y conservante <
0,1%. Buffer HAI A-V:
solución fisiológica (8,5 g/l ClNa) tamponada con fosfatos 20 mmol/l, pH 7,1 y conservante < 0,1%.
Solución Proteica A-V: solución de proteínas, 5 g/dl y conservante < 0,1%.
Control Positivo: suero inactivado conteniendo anticuerpos contra el Trypanosoma cruzi y
conservante < 0,1%. Control Negativo: dilución de proteínas séricas no reactivas y conservante <
0,1%.
2.-tubos de ensayo
4.-Policubetas de plástico
1. Impresora
2. Centrífuga
3. incubadora Stat Fax 2200

PROCEDIMIENTO Seleccionar una policubeta de pocillos de fondo en V sin usar. Pasar un paño
húmedo por la base de la misma antes de usar y disponerla apaisada.
. I- PRUEBA CUALITATIVA 1- En un tubo de hemólisis colocar 400 ul de Diluyente de Sueros HAI
A-V y adicionar 10 ul de suero o controles (dilución 1/40).
2- Colocar 50 ul de la dilución 1/40 de suero o controles en un pocillo de la policubeta y agregar
25 ul de Antígeno HAI A-V.
3- Mezclar aplicando suaves golpes en los laterales de la policubeta durante por lo menos 30
segundos.
4- Dejar en reposo, protegido de vibraciones durante 60 minutos a temperatura ambiente.
5- Leer a partir de los 60 minutos. Puede aumentarse la nitidez de la apreciación, leyendo sobre un
espejo, iluminando la placa desde arriba e interponiendo un papel blanco traslúcido entre la
policubeta y la fuente de luz. II- PRUEBA CUANTITATIVA 1- En una misma serie de 6 pocillos
colocar 50 ul de Diluyente de Sueros HAI A-V en los pocillos 2, 3, 4, 5 y 6. 2- Pipetear 50 ul de la
dilución 1/40 de suero o controles en los pocillos 1 y 2. 3- Transferir 50 ul del pocillo 2 al 3 y así
sucesivamente, desechando 50 ul del último pocillo, evitando la formación de burbujas. 4-
Homogeneizar por inversión el Antígeno HAI A-V. 5- Agregar a cada dilución 25 ul de Antígeno
HAI A-V. 6- Agitar la policubeta aplicando suaves golpes en los laterales durante por lo menos 30
segundos. 7- Dejar en reposo, protegido de vibraciones durante 60 minutos. 8- Leer a partir de los
60 minutos. El título del suero será el de la mayor dilución de suero
No Reactivo: presencia de un sedimento en forma de botón, nítido y de bordes netos en el fondo
del pocillo. Reactivo Débil: manto pequeño sobre el fondo del pocillo con botón más o menos
definido en el centro. Fuertemente Reactivo: formación de una película o manto a veces de bordes
irregulares en el fondo del pocillo
Conclusiones
Recomendaciones
Bibliografía
Mazza, S. - Sexto Congreso Nacional de Medicina (Córdoba) pág. 155, 1938. - Cerisola, J.A. - La
Prensa Médica Argentina 49/34: 1761, 1962. - Fontenla S., Moretti E. y González G. - 50°Triduo de
la ABA, Huerta Grande (Córdoba), 1985. - Basso A. y col. - 50° Triduo de la ABA. Huerta Grande
(Córdoba), 1985. - Lorenzo, L.; Capriotti, G.; Rojkín, F.; - Rev. Arg. de Transfusión XVII/1:51, 1991.
- Ministerio de Salud y Acción Social, Instituto Nacional de Parasitología "Doctor Mario Fatala
Chabén" - Normas para el diagnóstico de la infección chagásica - Resolución ministerial 523/97, 19
Guía de Prácticas de Laboratorio de Inmunología
Número TÉCNICA DE INMUNOCROMATOGRAFIA INVESTIGACIÓN DE SANGRE OCULTA
de la
Práctica
#6
1.-Aprender el fundamento de la técnica de Inmunocromatografía.
2.-Conocer la reacción antígeno y anticuerpo
3.-Conocer la significación clínica de la prueba, que servirá como herramienta diagnóstica para el
tratamiento y curación de los pacientes afectados con la enfermedad .

1.Revisar conceptos y definiciones sobre técnicas de inmunocromatografía en reacciones química
2.-Investigar sobre los reactivos a emplear.
3.-Revisión e interpretación de la técnica
FUDAMENTO DEL MÉTODO

Es un inmunoensayo cualitativo para la detección de hemoglobina humana en muestras de heces
humanas. En la zona de la línea del test de la membrana se han fijado unos anticuerpos
monoclonales frente a hemoglobina humana. Durante el proceso, la muestra reacciona con
partículas que presentan en su superficie anticuerpos anti-hemoglobina, formando un conjugado.
La mezcla se mueve hacia la parte contraria de la membrana por acción capilar. En el caso de
obtener un resultado positivo, los anticuerpos específicos presentes en la membrana reaccionarán
con la mezcla de conjugado y aparecerán unas líneas coloreadas. Una línea verde siempre debe
verse en la zona de la línea de control ya que sirve como verificación de que el volumen de
muestra añadido es suficiente, que el flujo ha sido el adecuado y también como control interno de
los reactivos.
Antígeno HAI A-V: suspensión de glóbulos rojos de ave sensibilizados con antígenos
citoplasmáticos y de membrana de T. cruzi en buffer fosfatos con ClNa, 8,5 g/l y conservante <
0,1%. Buffer HAI A-V:
solución fisiológica (8,5 g/l ClNa) tamponada con fosfatos 20 mmol/l, pH 7,1 y conservante < 0,1%.
Solución Proteica A-V: solución de proteínas, 5 g/dl y conservante < 0,1%.
Control Positivo: suero inactivado conteniendo anticuerpos contra el Trypanosoma cruzi y
conservante < 0,1%. Control Negativo: dilución de proteínas séricas no reactivas y conservante <
0,1%.
2.-tubos de ensayo
4.-Policubetas de plástico
1. Impresora
2. Centrífuga

PROCEDIMIENTO Seleccionar una policubeta de pocillos de fondo en V sin usar. Pasar un paño
húmedo por la base de la misma antes de usar y disponerla apaisada.
. I- PRUEBA CUALITATIVA 1- En un tubo de hemólisis colocar 400 ul de Diluyente de Sueros HAI
A-V y adicionar 10 ul de suero o controles (dilución 1/40).
2- Colocar 50 ul de la dilución 1/40 de suero o controles en un pocillo de la policubeta y agregar
25 ul de Antígeno HAI A-V.
3- Mezclar aplicando suaves golpes en los laterales de la policubeta durante por lo menos 30
segundos.
4- Dejar en reposo, protegido de vibraciones durante 60 minutos a temperatura ambiente.
5- Leer a partir de los 60 minutos. Puede aumentarse la nitidez de la apreciación, leyendo sobre un
espejo, iluminando la placa desde arriba e interponiendo un papel blanco traslúcido entre la
policubeta y la fuente de luz. II- PRUEBA CUANTITATIVA 1- En una misma serie de 6 pocillos
colocar 50 ul de Diluyente de Sueros HAI A-V en los pocillos 2, 3, 4, 5 y 6. 2- Pipetear 50 ul de la
dilución 1/40 de suero o controles en los pocillos 1 y 2. 3- Transferir 50 ul del pocillo 2 al 3 y así
sucesivamente, desechando 50 ul del último pocillo, evitando la formación de burbujas. 4-
Homogeneizar por inversión el Antígeno HAI A-V. 5- Agregar a cada dilución 25 ul de Antígeno
HAI A-V. 6- Agitar la policubeta aplicando suaves golpes en los laterales durante por lo menos 30
segundos. 7- Dejar en reposo, protegido de vibraciones durante 60 minutos. 8- Leer a partir de los
60 minutos. El título del suero será el de la mayor dilución de suero
No Reactivo: presencia de un sedimento en forma de botón, nítido y de bordes netos en el fondo
del pocillo. Reactivo Débil: manto pequeño sobre el fondo del pocillo con botón más o menos definido
en el centro. Fuertemente Reactivo: formación de una película o manto a veces de bordes irregulares
en el fondo del pocillo
Conclusiones
Recomendaciones
 Seguir la técnica paso a paso, empleando las debidas medidas de bioseguridad
Bibliografía
Mazza, S. - Sexto Congreso Nacional de Medicina (Córdoba) pág. 155, 1938. - Cerisola, J.A. - La
Prensa Médica Argentina 49/34: 1761, 1962. - Fontenla S., Moretti E. y González G. - 50°Triduo de
la ABA, Huerta Grande (Córdoba), 1985. - Basso A. y col. - 50° Triduo de la ABA. Huerta Grande
(Córdoba), 1985. - Lorenzo, L.; Capriotti, G.; Rojkín, F.; - Rev. Arg. de Transfusión XVII/1:51, 1991.
- Ministerio de Salud y Acción Social, Instituto Nacional de Parasitología "Doctor Mario Fatala
Chabén" - Normas para el diagnóstico de la infección chagásica - Resolución ministerial 523/97, 19
Número de INVESTIGACIÓN DE HORMONA PROLACTINA POR TÉCNICA DE ELISA
la Práctica
#7
1. Determinar la absorbancia de los calibradores y muestras haciendo uso de un lector de
micropocillos ELISA, la concentración en la muestra se evalúa por medio de una curva de
calibración la cual se obtiene haciendo uso de calibradores de suero con concentraciones de
PSA conocidas
 Conocer el manejo del equipo de ELISA.
Los reactivos esenciales requeridos por un análisis Inmunoenzimométrico incluyen el anticuerpo
inmovilizado, con diferentes y con reconocimiento distinto del epítome, en exceso, y antígeno
nativo. En este procedimiento, la inmovilización toma lugar durante el análisis en la superficie del
micro pozo a través de la interacción de streptavidin recubierto en el pozo y el exógeno agregado
monoclonal biotinilado al anticuerpo de anti-PRL. Mezclando el anticuerpo inmovilizado,
conjugación del enzima-antígeno etiquetado y un suero que contienen el antígeno nativo, una
reacción de la competición resulta entre el antígeno nativo y los anticuerpos sin competencia o
steric hidrance, para formar un sándwich complejo soluble.
1. [MIC]12 Tiras de Micropocillos en portatira
2. [CAL]A - F Calibradores
3. [CON] 13 ml Conjugado enzimático-anticuerpo , coloreado rojo
4. [WS]20 ml Solución de Lavado Concentrado para 1000 ml
5. [SA]7,0 ml Reactivo Substrato A
6. [SB]7,0 ml Reactivo Substrato B
7. [STOP]7,5 ml Solución de Parada Ácido sulfúrico
1. Pipetas automáticas
2. tubos de ensayo
3. Puntas descartables para pipetas automáticas.
1. Equipo Elisa Stat Fax 2100
1. Impresora

Los reactivos y las muestras deberían estar a temperatura ambiente antes del uso.
Etapa 1 Pocillo [µl]

A1...D2 E2...
Calibrador Muestra
(*a) [CAL] A-F; en duplicado Muestras, Controles; en 25 -- 25
duplicado -- 100 100
[CON]
Mezclar y cubrir las tiras con película sellante
(*b) Incubar por 30 min a 20...25°C
Lavar 3 veces como se describe (ver L1 – L3)
[WASH] 300 300
Etapa 2
[SUB] 100 100
Incubar por 15 min a 20...25°C (ver P8)
[STOP] 50 50
Mezclar cuidadosamente
Medir la absorbancia a 450 nm lo más pronto posible o dentro de 10 min. Después de terminar
la reacción usando una longitud de onda de referencia de 630-690 nm (si está disponible).
Conclusiones
Recomendaciones
Bibliografía
-Chen, Z. et al., Clin. Chem. 41, 1273-1282 (1995)
-Wild, D., The Immunoassay Handbook, Stockton Press, 452 (1994)
-Junker, R. et al., Clin. Chem. 43, 1588-1594 (1997)
Número de INVESTIGACIÓN DE INMUNOGLOBULINAS POR TÉCNICA DE ELISA
la Práctica
#8
1.-Determinar la absorbancia de los calibradores y muestras haciendo uso de un lector de
PSA conocidas
Los reactivos esenciales requieren de un ensayo Inmunoenzimométrico que contenga anticuerpos de

alta afinidad y especificidad (enzima e inmovilidad), con reconocimiento diverso y distinto del epitome,
en exceso y antígeno de origen. En este procedimiento, la inmovilización se lleva a cabo durante el ensayo
en la superficie de un pozo de la microplaca a través de la intersección del pozo recubierto con
Streptavidin y anticuerpo anti-IgE monoclonal biotinilado exógeno. Al mezclarse el anticuerpo
monoclonal biotinilado un suero que contenga antígeno de origen, la reacción se produce ente el
antígeno de origen y los anticuerpos, formando un complejo antígeno-anticuerpo. La interacción es
ilustrada por la siguiente ecuación
Simultáneamente, el complejo es depositado en el pozo a través de la alta afinidad con la reacción del
streptavidin y el anticuerpo biotinilado.
Después de un periodo apropiado de incubación, la fracción ligada al antígeno-anticuerpo es separada por
medio de la decantación o aspiración. Otro anticuerpo(dirigido a un epítome diferente) etiquetado
con una enzima es añadido. Otra interacción ocurre para formar una enzima etiquetada antígeno-anticuerpo
complejo de anticuerpo biotinlado en la superficie de los pozos. El exceso deenzima es lavada por
medio de un paso de lavado. Un sustrato adecuado es añadido para que el color pueda ser
cuantificable con el uso de un espectrofotómetro de microplacas. La actividad de la enzima en el
pozo es directamente proporcional a la concentración del antígeno de origen. Al utilizar varios y
diferentes sueros de referencia de concentración de antígeno conocido, una curva de dosis de respuesta
puede ser generada desde la cual la concentración del antígeno de un desconocido puede ser comprobada
1.-[MIC]12 Tiras de Micropocillos en portatira
2.-[CAL]A - F Calibradores
3.-[CON] 13 ml Conjugado enzimático-anticuerpo , coloreado rojo
4.-[WS]20 ml Solución de Lavado Concentrado para 1000 ml
5.-[SA]7,0 ml Reactivo Substrato A
6.-[SB]7,0 ml Reactivo Substrato B
7.-[STOP]7,5 ml Solución de Parada Ácido sulfúrico
2.-tubos de ensayo
3.-Puntas descartables para pipetas automáticas.
1.-Equipo Elisa Stat Fax 2100
2.-Impresora
3.-incubadora Stat Fax 2200

A1...D2 E2...
Calibrador Muestra
[CON]
[WASH] 300 300
Etapa 2
[SUB] 100 100
[STOP] 50 50
Apartado a desarrollar por parte del estudiante
Conclusiones
Recomendaciones
Bibliografía
Número de INVESTIGACIÓN DE HORMONA LH POR ELISA
la Práctica
#9
PSA conocidas
El LH ELISA es un ensayo en fase sólida de inmunoadsorción unido a enzimas (ELISA), basado

en el principio del sándwich. Los pocillos de las placas están recubiertos con un anticuerpo
monoclonal/policlonal dirigido contra un único foci antigénico en una molécula de Hormona
Luteinizante. Se incuba una alícuota de una muestra perteneciente a un paciente que contiene
Hormona Luteinizante endógena en los pocillos recubiertos con el enzima conjugado, que es un
anticuerpo anti-Hormona Luteinizante conjugado con la peroxidasa endógena. Después de la
incubación se lava el conjugado que no se ha unido. La cantidad de peroxidasa unida es
proporcional a la concentración de Hormona Luteinizante en la muestra. Cuando se añade la
solución del sustrato de la peroxidasa, la intensidad del color desarrollado es proporcional a la
concentración de Hormona Luteinizante en la muestra del paciente
1-[MIC]12 Tiras de Micropocillos en porta tira
5.-[SA]7,0 ml Reactivo Substrato A
1.Pipetas automáticas
2.tubos de ensayo
2.-Impresora

A1...D2 E2...
Calibrador Muestra
[CON]
[WASH] 300 300
Etapa 2
[SUB] 100 100
[STOP] 50 50
Conclusiones
Recomendaciones
Bibliografía
Número de INVESTIGACIÓN DE HORMONA TIROIDEA POR TÉCNICA DE ELISA
la Práctica
#10
micropocillos ELISA, la concentración en la muestra se evalúa por medio de una curva de calibración
la cual se obtiene haciendo uso de calibradores de suero con concentraciones de PSA conocidas

Los reactivos esenciales requeridos por un análisis Inmunoenzimométrico incluyen alta afinidad y
especificidad de anticuerpos (enzima conjugada e inmovilizada), con diferentes y con
reconocimiento distinto del epítome, en exceso, y antígeno nativo. En este procedimiento, la
inmovilización toma lugar durante el análisis en la superficie del micro pozo a través de la
interacción de streptavidin cubierto en el pozo y el exógeno agregado biotinilado monoclonal al
anticuerpo de anti-TSH. Mezclando el anticuerpo monoclonal inmovilizado, conjugación del enzima
antígeno etiquetado y un suero que contienen el antígeno nativo, una reacción de la competición
resulta entre el antígeno nativo y los anticuerpos sin competencia o steric hidrance, para formar un
sándwich complejo soluble. Simultáneamente, el complejo es depositado en el pozo a través de la
reacción de alta afinidad de streptavidin y el anticuerpo biotinilado.
Después de que se obtiene el equilibrio, la fracción del anticuerpo-unido es separado del antígeno
desatado por la decantación o la aspiración. La actividad enzimática en la fracción del anticuerpo-
limite es directamente proporcional a la concentración nativa del antígeno. Utilizando diversas
referencias del suero de los valores sabidos del antígeno, una curva de la reacción a cierta dosis
puede ser generada de la cual la concentración del antígeno de un desconocido puede ser
comprobada.
1. [MIC]12 Tiras de Micropocillos en portatira
2. [CAL]A - F Calibradores
3. [CON] 13 ml Conjugado enzimático-anticuerpo , coloreado rojo
4. [WS]20 ml Solución de Lavado Concentrado para 1000 ml
5. [SA]7,0 ml Reactivo Substrato A
6. [SB]7,0 ml Reactivo Substrato B
7. [STOP]7,5 ml Solución de Parada Ácido sulfúrico
2.-tubos de ensayo
2.-Impresora

A1...D2 E2...
Calibrador Muestra
[CON]
[WASH] 300 300
Etapa 2
[SUB] 100 100
[STOP] 50 50
Apartado a desarrollar por parte del estudiante
Conclusiones
Recomendaciones
Bibliografía
Número INVESTIGACIÓN DE CITOMEGALOVIRUS POR TÉCNICA DE ELISA
de la
Práctica
#11
1-Aplicar las normas de bioseguridad en el laboratorio de Inmunología
2-Describir cada uno de los elementos de protección personal en el Laboratorio de Inmunología
3-Determinar el nivel de bioseguridad del laboratorio de Inmunología
Conocer los protocolos de laboratorios de ensayos biológicos
Conocer las señaléticas de Riesgo biológico
Conocer los dispositivos de bioseguridad
FUNDAMENTOS DEL MÉTODO

HBsAg ELISA es un método inmunoenzimático directo tipo sandwich. Los pocillos de la policubeta
están recubiertos con anticuerpo de cobayo anti-HBs (anti-HBsAg) que actúa como anticuerpo de
captura. La muestra se incuba en uno de los pocillos. Si la misma contiene HBsAg, éste formará
un complejo con el anticuerpo unido a la placa. El material no unido se elimina por lavado. En el
siguiente paso se agrega el anticuerpo de cabra anti-HBs conjugado con peroxidasa, que se unirá
con los complejos anticuerpo-antígeno formados previamente. El conjugado no unido se remueve
por lavado. Posteriormente se agrega una solución conteniendo tetrametilbencidina y peróxido de
hidrógeno. En los casos en que el HBsAg esté presente en la muestra, se desarrolla color celeste
que vira al amarillo cuando se detiene la reacción con ácido sulfúrico
1.- [MIC] 12 Micropocillos en portatiras (Código CMV M)
Tiras (desprendibles) de 8 micropocillos cada uno, recubiertas con antígeno CMV (derivados cultivo
celular)
2.-[NC] 2,5 ml Control CMV IgM negativo (tapa verde) listo para el uso, humano
3.-[PC] 2,5 ml Control CMV IgM positivo (tapa roja) listo para el uso, humano
4.-[DIL-M] 100 ml Buffer de dilución IgM (tapa azul) 5111 listo para el uso, color verde pH 6,5 ± 0,2
Buffer Fosfato 10 mmol/l NaCl 8 g/l Albúmina 10 g/l Anti-IgG humana (oveja)
5.-[CON] 12 ml Conjugado Antí IgM (tapa blanca) listo para el uso, color rojo Anticuerpos anti-IgM-
humano, marcados con peroxidasa (conejo)
6.-[WS] 50 ml Solución de lavado (tapa blanca) 5102 Concentrado para aprox. 1000 ml pH 7,2 ± 0,2
Buffer TRIS 10 mmol/l NaCl 8 g/l
7.-[SUB] 13 ml Reactivo Substrato (tapa negra) 5103 listo para el uso, sin color a azulado pH 3,7 ±
0,2 3,3', 5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB) 1,2 mmol/l Peróxido de Hidrógeno ≤ 6 mmol/l
8.-[STOP] 15 ml Solución de parada (tapa roja) 5104 Ácido sulfúrico, listo para el uso 0,5 mol/l
2.-tubos de ensayo
2.-impresora
3.- incubadora Stat Fax 2200
Diluir el suero del paciente 1+100 con [DIL-G] 5121, por ejemplo 10 µl de suero + 1
ml de [DIL-G] 5121 y mezclar vigorosamente. Las muestras diluidas se pueden
almacenar hasta 48 horas entre 2...8°C.
Los controles son listos para el uso.
A1 B1/C1 D1/E1 F1...
Blanc [NC] [PC]
Muestr
o a
[NC] en duplicado -- 100 -- --
[PC] en duplicado -- -- 100 --
Muestra diluida -- -- -- 100
Cubrir [MIC] con tiras adhesivas
Incubar por 30 min. a 17...25°C
[WASH] 350 350 350 350
Etapa 2
[CON] -- 100 100 100
[WASH] 350 350 350 350
Etapa 3
[SUB] 5103 100 100 100 100
Incubar por 15 min. a17...25°C (ver U8)
[STOP] 5104 100 100 100 100
Llevar a cero de absorbancia el instrumento lector ELISA (HumaReader) con el
blanco de substrato con el pozillo A1.
Medir la absorbancia a 450 nm lo más pronto posible o dentro de 30
min. Después de terminar la reacción usando una longitud de onda de referencia de
630-690 nm (si está disponible).
Resultados obtenidos (Observaciones, cálculos, datos, ecuaciones, tablas, gráficos, figura
Realizar curva de calibración
Interpretación de resultados Debido a variaciones fisiológicas y analíticas los resultados de los
pacientes un 15% arriba o abajo del valor calculado como cut-off son equívocos. Es recomendable
medir estas muestras en paralelo con una muestra fresca tomada de 7 a 14 días después cada una
en duplicado. El cambio de la concentración específica de anticuerpos deberá ser evaluado, si es
necesario, tomando en cuenta la concentración específica de IgG (HUMAN ELISA IgG), la
anamnesis del paciente, así como los resultados de más exámenes.
Conclusiones
Recomendaciones
1.Dominio del estudiante de la aplicación de las normas de bioseguridad
2.Uso adecuado de los E.P.P. (elementos de protección personal) y materiales de bioseguridad
3.Cumplimiento de protocolo establecido dentro del laboratorio de Inmunología
Bibliografía
1. INMUNOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR (5a ed.) Abul k. Lichtman, 2004
2. INMUNOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR (8a ed.)Abul K. Abbas, Andrew H. Lichtman, Shiv
Pillai, 2015.
3. INMUNOLOGÍA BÁSICA Y CLÍNICA (2a ed.) Mark Peakman, Diego Vergani, 2011
Número de INVESTIGACIÓN DE HERPES POR TÉCNICA DE ELISA
la Práctica
#12
1. Detectar anticuerpos clase IgG contra el Virus Herpes Simplex 1 en suero humano.
FUNDAMENTO DEL MÉTODO:
Método de ELISA basado en la reacción de los anticuerpos de la muestra con el antígeno unido a
la superficie de poliestireno. Las inmunoglobulinas no unidas por reacción con el antígeno son
eliminadas en el proceso de lavado. En un paso posterior la globulina anti‐humana reacciona con
el complejo antígeno‐ anticuerpo, y la que no se une es eliminada por los lavados; la unida
reacciona con el sustrato (TMB), para dar una reacción coloreada azul, que cambia a amarillo tras
la adición de la solución de parada
1. [MIC]12 Micropocillos en portatiras .Tiras (desprendibles) de 8 micropocillos cada uno,
recubiertas con antígeno de HSV 1 (derivados cultivo celular)
2. [NC] 2,5 ml Control HSV 1 IgG negativo
3. [PC] 2,5 ml Control HSV 1 IgG positivo
4. [DIL-G] 100 ml Buffer de dilución IgG
5. [CON] 12 ml Conjugado Antígeno IgG .Anticuerpos anti-IgG-humano, marcados con
peroxidasa (conejo)
6. [WS] 50 ml Solución de lavado
7. [SUB] 13 ml Reactivo substracto
8. [STOP] 15 ml Solución de parada ,Ácido sulfúrico
2. tubos de ensayo
1.Equipo Elisa Stat Fax 2100
2.-Impresora
Diluir el suero del paciente 1+100 con [DIL-G] 5121, por ejemplo 10 µl de suero + 1
ml de [DIL-G] 5121 y mezclar vigorosamente. Las muestras diluidas se pueden
almacenar hasta 48 horas entre 2...8°C.
Los controles son listos para el uso.
A1 B1/C1 D1/E1 F1...
Blanc [NC] [PC]
Muestr
o a
[NC] en duplicado -- 100 -- --
[PC] en duplicado -- -- 100 --
Muestra diluida -- -- -- 100
[WASH] 350 350 350 350
Etapa 2
[CON] -- 100 100 100
[WASH] 350 350 350 350
Etapa 3
[SUB] 5103 100 100 100 100
Incubar por 15 min. a17...25°C (ver U8)
[STOP] 5104 100 100 100 100
Llevar a cero de absorbancia el instrumento lector ELISA (HumaReader) con el
blanco de substrato con el pozillo A1.
Medir la absorbancia a 450 nm lo más pronto posible o dentro de 30
min. Después de terminar la reacción usando una longitud de onda de referencia de
630-690 nm (si está disponible).
A450 (paciente) COV + 15% : anti-HSV 1-IgG-Ac-positivo
A450 (paciente) < COV - 15% : anti-HSV 1-IgG-Ac-negativo
Debido a variaciones fisiológicas y analíticas los resultados de los pacientes un 15% arriba o
abajo del valor calculado como cut-off son equívocos. Es recomendable medir estas muestras
en paralelo con una muestra fresca tomada de 7 a 14 días después cada una en duplicado. El
cambio de la concentración específica de anticuerpos deberá ser evaluado, si es necesario,
tomando en cuenta la anamnesis del paciente, así como los resultados de más exámenes.
Conclusiones
Recomendaciones
Bibliografía
-Engvall, E., Perlmann, P., Immunochemistry 8, 871-874 (1971) 2. Engvall, E., Perlmann,
P., J. Immunol. 109, 129-135 (1972)
-Remington, J.S., Klein, J.O., Infectious diseases of the fetus and newborn infant. Sanders,
Philadelphia, London, Toronto (1976)
-Bidwell, D.E. et al., J. Infect. Dis. 136, Supplement 274-278 (1977)
Número de INVESTIGACIÓN DE MARCADOR TUMORAL PSA POR TÉCNICA DE ELISA
la Práctica
#13
micropocillos ELISA, la concentración en la muestra se evalúa por medio de una curva de calibración
la cual se obtiene haciendo uso de calibradores de suero con concentraciones de PSA conocidas

Se trata de un ensayo de inmunoabsorción enzimática (ELISA) de fase sólida basado en el
principio de tipo sándwich. Las placas multipocillo están recubiertas con un anticuerpo, dirigido
hacia un epítopo de una molécula del antígeno (PSA). Una parte alícuota del suero del paciente se
incuba en el pocillo recubierto con el segundo anticuerpo del conjugado enzimático (E-Ab), dirigido
hacia una región diferente de la molécula del antígeno. Después de la incubación, el E-Ab no
ligado se elimina con un lavado. La cantidad de E-Ab ligado es proporcional a la concentración del
antígeno presente en la muestra. Después de añadir la solución de sustrato, la intensidad del color
es proporcional a la concentración del antígeno presente en la muestra. Las densidades ópticas
(DO) de los estándares medidos se utilizan para elaborar una curva de calibración con la que se
calculan las muestras desconocidas.
1.-[MIC]12 Tiras de Micropocillos en portatira
5.[SA]7,0 ml Reactivo Substrato A
2.-tubos de ensayo
2.-Impresora

A1...D2 E2...
Calibrador Muestra
[CON]
[WASH] 300 300
Etapa 2
[SUB] 100 100
[STOP] 50 50
El cáncer prostático, el maligno del hombre segundo en frecuencia, muestra un aumento importante
en la incidencia a partir de los 50 años.
El método más sensitivo para el diagnóstico y control del tratamiento es la determinación cuantitiva
de PSA en suero. La concentración de PSA correlacione muy bien con el tamaño y estadio de
desarrollo del tumor.
Los niveles de PSA no son elevados solamente en el cáncer maligno pero también en hiperplasia
prostática benigna (BPH). Por eso, la determinación del nivel de PSA sólo no es suficiente para
diagnosticar el cáncer. Debe evaluarse en conjunto con otros datos clínicos y parámetros
diagnósticos (p.ej. investigación rectal digital, ultrasonido de la próstata).
Niveles elevados de PSA declinan muy rápidamente después de la extirpación de la próstata.
Niveles elevados persistentes indican normalmente la persistencia del tumor y/o la existencia de
metástasis.
El aumento de los valores de PSA en un tratamiento conservativo indica la progresión del cáncer
prostático en un estadio temprano (hasta los 6 meses antes de otros métodos diagnósticos).
La determinación del PSA libre puede ayudar en la distinción entre BPH y cáncer prostático.
Conclusiones
Recomendaciones
Bibliografía
Número de INVESTIGACIÓN DE MARCADOR TUMORAL CEA POR TÉCNICA DE ELISA
la Práctica
#14
6. Obtener una reacción entre el antígeno nativo y los anticuerpos, para formar un complejo
soluble tipo sándwich.

CEA ELISA es un método en fase sólida basado en el principio Streptavidina / Biotina. Las
muestras, estándares y el conjugado enzimático Anti-CEA-HRP/Biotina, se añaden a los pocillos
designados recubiertos con Streptavidina. La CEA en el suero del paciente forma una reacción tipo
sándwich entre dos anticuerpos anti-CEA altamente específicos, marcados con Biotina y HRP.
Simultáneamente, el anticuerpo biotinilado es inmovilizado dentro del pocillo a través de una
interacción de alta afinidad entre la Streptavidina y la Biotina. Las proteínas no unidas, así como el
exceso de conjugado enzimático, son lavados por la solución de lavado. Tras la adición del
sustrato, la intensidad del color es directamente proporcional a la concentración de CEA en las
muestras. Una curva estándar se prepara sobre la intensidad del color a la concentración de CEA
Materiales suministrados:
A. Antígeno Carcinoembrionario (CEA) – 1ml/vial- Iconos A-F
Seis (6) viales de antígeno CEA de referencia en los niveles de 0 (A), 5 (B), 10 (C), 25 (D) 50 (E) y
250(F) ng/ml. Almacenar de 2-8ºC. Se agrega preservante
Nota: los estándares, basados en suero humano, se calibraron utilizando una preparación de
referencia, la cual fue probada contra la primera preparación internacional de referencia
(IRP*73/601).
B. Reactivo de enzimas CEA-13ml/vial – icono E
Un (1) vial que contiene anticuerpo marcado con enzima, IgG de rata monoclonal y marcado con
biotina, en amortiguador de PH, colorante y preservantes. Almacenar de 2-8º C.
C. Pozos de reacción luminosa - 96 pozos
Una micro placa de 96 pozos recubiertos estreptavidina, empacada en bolsa de aluminio y con un
agente desecante. Almacenar de 2-8 ºC.
D. Concentrado de solución de lavado -20 ml
Un (1) vial que contiene un surfactante en solución salina amortiguada. Se agregó preservante.
Almacenar de 2-30 º C.
E. Reactivo de Señal A- 7ml/ vial – Icono CA
Un (1) botella contiene Luminol en buffer. Almacenar de 2-8º C.
F. Reactivo de Señal B – 7 ml/vial- Icono CB
Un (1) botella contiene peróxido de hidrogeno (H2O2.) en buffer. Almacenar de 2-8ºC.
2. tubos de ensayo
2.-Impresora

1. Marcar los pozos de la microplaca para cada calibrador, control y muestra de paciente para ser
procesados por duplicado.
2. Pipetear 0.025 ml (25µl) de calibrador apropiado, control o muestra dentro del pozo asignado.
3. Adicionar 0.100ml (100µl) de solución de reactivo trazador CEA a todos los pozos.
4. Agitar suavemente la microplaca durante 20-30 segundos para mezclar y cubrir.
5. Incubar durante 45 minutos a temperatura ambiente.
6. Eliminar el contenido de la microplaca por decantación o aspiración. Si se hace por decantación,
golpear suavemente y secar la `placa con papel absorbente.
7. Adicionar 350µl de solución de lavado (ver Sección reparación de Reactivos), decantar, secar o
aspirar. Repetir 4 veces más para obtener un total de 5 lavados. Se puede utilizar un lavador
automático o manual de placas. Seguir las instrucciones del fabricante para asegurar el uso
apropiado. Si se utiliza un frasco de lavado, llenar cada pozo oprimiendo el recipiente (evitar las
burbujas de aire) para distribuir el lavado. Decantar el lavado y repetir 4 veces adicionales.
8. Adicionar 0.100 ml (100µl) de la solución de reactivo de señal (Buffer) a todos los pozos. Siempre
adicione reactivos en el mismo orden para minimizar las diferencias del tiempo de reacción entre los
pozos.
9. Incubar durante 5 minutos en la oscuridad.
10. Tomar lectura de las unidades relativas luminiscentes (RLU) en cada pozo durante 0.2-1.0
segundos. Los resultados deberán leerse dentro de los 30 minutos a partir de la adición de la
solución de sustrato.
Apartado a desarrollar por el estudiante, según las observaciones presenciadas en la actividad.
Analizar curva de calibración
Conclusiones
Apartado a desarrollar por el estudiante
Recomendaciones

Bibliografía
-Gold P, Freedman SO, J Exp Med, 121, 439 (1965)
-ZamcheckN, Adv Intern Med, 19, 413 (1974)
-Rayncao G, Chu TM, JAMA, 220, 381 (1972)
-Wild D, The Inmunoassay Handboock, Stockton Press, 444 (1944)
Número de INVESTIGACIÓN DE PALUDISMO POR TÉCNICA DE INMUNOCROMATOGRAFÍA
la Práctica
#15
1. Detectar P. falciparum y la diferenciación de otras especies de malaria así como
para el seguimiento de terapias frente a la malaria.

Es un inmunoensayo cualitativo para la detección de Plamodium en muestras de suero humano.

En la zona de la línea del test de la membrana se han fijado unos anticuerpos monoclonales frente
al anticuerpo anti-plasmodium . Durante el proceso, la muestra reacciona con partículas que
presentan en su superficie anticuerpos anti-plasmodium, formando un conjugado. La mezcla se
mueve hacia la parte contraria de la membrana por acción capilar. En el caso de obtener un
resultado positivo, los anticuerpos específicos presentes en la membrana reaccionarán con la
mezcla de conjugado y aparecerán unas líneas coloreadas. Una línea verde siempre debe verse
en la zona de la línea de control ya que sirve como verificación de que el volumen de muestra
añadido es suficiente, que el flujo ha sido el adecuado y también como control interno de los
reactivos.
1. 25 Cassettes individuales empaquetados en sobres de aluminio conteniendo bolsas con
desecante.
2. 1 Frasco gotero conteniendo buffer hemolizante
3. 1 Instrucciones de uso
1. Cronometro avisador
2. Pipetas de laboratorio
3. Lancetas estériles
4. Gasas desinfectantes
N/A
1. Dejar a temperatura ambiente los componentes del kit. En caso de almacenaje a 2-
8ºC, dejar atemperar al menos 30 minutos.
2. Abrir el sobre de aluminio y extraer el cassette.
3. Toma de Muestra:
4. Procedimiento para Sangre Capilar
1. Seleccionar la zona de punción (normalmente 3º-4º dedo). Limpiar la
zona con una solución desinfectante y esperar a su secado
2. Pinchar el dedo con una lanceta estéril y masajear en orden a obtener
una gota de tamaño medio (15-20 µl).
3. Poner en contacto el borde de la tira con la gota de sangre, la gota
deberá de situarse en el centro sobre la almohadilla de la zona abierta
(15-20 µl aproximadamente) hasta cubrir las 2/3 partes de la
almohadilla de color rojo
b) Procedimiento para Sangre Venosa.
1.-Cuando usemos sangre venosa, situar el cassette sobre una superficie plana,
agitar el tubo hasta homogeneizar y tomar 15 µl de sangre con una pipeta de
laboratorio. Dispensar la gota de sangre sobre el centro de la almohadilla absorbente
de la zona abierta
2.-Poner el cassette sobre una superficie plana y añadir 4 gotas de Buffer
hemolizante sobre el pocillo. Leer los resultados después de 20 minutos a partir de
la adicción del buffer. No leer ni interpretar los resultados pasado 20 minutos. No
prestar atención a la aparición de alguna banda pasados 20 minutos.
3.-Después de la lectura, eliminar el dispositivo IMMUNOQUICK Contact Malaria +4

de acuerdo con los procedimientos reservados al desecho de material
potencialmente infeccioso.
POSITIVO PARA: Plasmodium falciparum y/o
infección mixta Presencia de 3 Bandas distintas.
Una banda púrpura deberá de aparecer a nivel de la ZONA CONTROL y dos bandas púrpura
a nivel de la ZONA HRP II y pan LDH.
El resultado deberá considerarse positivo, incluso si la intensidad de la banda púrpura para
pf es muy débil.
Una banda Test coloreada podrá aparecer antes de 20 minutos en caso de muestras
fuertemente positivas.
NEGATIVO:
Solamente una Banda aparecerá a nivel de la ZONA CONTROL
No aparecerá NINGUNA Banda a nivel HRP II y pan LDH.

Conclusiones
Recomendaciones
Bibliografía
-Howard, R.J. et al. 1986: Secretion off has Malarial Histidein-rich Protein (PF HRP II) from
Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes. J. Biol concealment 103,1269-1277.
-Rock, E.P. et al. 1987: Comparative Analysis off the plasmodium falciparum Histidine-Rich
Proteins HPR-I HPR-II and HPR-III in Malaria Parasitic off Various Origin. Parasitol, 95,209-
227.
Número de INVESTIGACIÓN DE HELICOBACTER PYLORI POR TÉCNICA DE ELISA
la Práctica
#16
1. Detectar anticuerpo IgG al virus del H. pylori en suero o plasma humano.
1. Materiales con potencial riesgo biológico: Los calibradores contienen componentes de origen
humano, que se han sido probados y encontrados no reactivos para el antígeno de superficie de
hepatitis B y anticuerpos contra el VIH Aprobado por la FDA. Sin embargo no hay método de prueba
que puede ofrecer completa seguridad de que el virus VIH, Hepatitis B u otros agentes infecciosos
estén presentes. Estos reactivos deben ser manejados según el Nivel de Bioseguridad
2. No pipetee con la boca. No fume, coma, o beba en el área donde maneje este equipo.
3. Para obtener óptimos resultados, debe apegarse estrictamente al protocolo. Pipeteado exacto y
preciso, así como después de la hora exacta y requerimientos de temperatura prescritos son
esenciales. Cualquier desviación de este puede dar datos no válidos.
1. Micro pozos recubiertos antígeno H. Pylori 12x8x1
2. Diluyente de la muestra: 1 Frasco (listo para usar) 22 ml
3. Calibrador: 1 Vial ( listo para usar) 1 ml
4. Control Positivo: 1 Vial (listo para usar) 1 ml
5. Control Negativo: 1 Vial (listo para usar) 1 ml
6. Conjugado Enzimático: 1 Frasco (listo para usar) 12 ml
7. Sustrato TMB: 1 Frasco (listo para usar) 12 ml
8. Solución de Frenado: 1 Frasco (listo para usar) 12 ml
9. Concentrado de Lavado 20X: 1 Frasco 25 ml
1. Agua destilada o desionizada.
2. Pipetas de precisión.
3. Puntas de pipetas desechables.
4. Lector de micro ELISA con lente a 450nm de longitud de onda con
Una banda de amplitud de 10 nm o menor y un rango de densidad óptica de 0-2 OD o mayor.
5. Papel absorbente o toalla de papel.
6. Papel cuadriculado.
1. Lector de micro ELISA Stat Fax 2100 con lente a 450nm de longitud de onda con una banda de
amplitud de 10 nm o menor y un rango de densidad óptica de 0-2 OD o mayor
2.Impresora Stat Fax 2200
Previo al ensayo, todas las muestras y reactivos deben ser llevados a Temperatura ambiente (18-
26ºC). Mezcle gentilmente todos los reactivos Previos a su uso.
1. Corte el número de pozos a utilizar. Cierre y selle el resto de los pozos no utilizados y refrigérelos
a 2-8°C.
2. Los controles (positivo y negativo) y el calibrador están listos para su uso. Prepare una dilución
de las muestras de 1:21, agregando 10 µl de la muestra a 200 µl del diluyente. Mezclar bien.
3. Dispense 100 µl del suero diluido, calibrador y controles en los pozos designados. Para el reactivo
blanco, dispense 100 µl de diluyente de la muestra en la posición 1A. Golpee el pozo para remover
las burbujas de aire del líquido y mezcle bien. Incubar por 20 minutos a temperatura ambiente.
4. Retire el líquido de los pozos. Lave en tres tiempos con 300 μl de solución de lavado a 1x. Golpee
los pozos sobre una toalla o papel absorbente.
5. Dispense 100 µl de conjugado enzimático en cada pozo e incube 0 minutos a temperatura
ambiente.
6. Retire el conjugado enzimático de los pozos. Lave en tres tiempos con toalla de papel absorbente.
7. Dispense 100 µl de sustrato TMB e incube por 10 minutos a temperatura ambiente.
8. Agregue 100 µl de solución de frenado.
9. Lea la densidad óptica a 450nm con un lector de placa de micro valoración en un plazo de 15
minutos después de haber agregado la solución de frenado
Conclusiones
Recomendaciones
Bibliografía
-Cutler AF; Prasad VM; Santogade P. Four-year trends in Helicobacter pylori IgG serology
following successful eradication. Am J Med 1998.
-Holtmann G; Talley NJ; Mitchell H; Hazell S. Antibody response to specific H. pylori antigens in
functional dyspepsia, duodenal ulcer disease, and health. Am J Gastroenterol 1998.
-Parsonnet J; Replogle M; Yang S; Hiatt R. Seroprevalence of CagApositive strains among
Helicobacter pylori- infected, healthy young adults. J Infect Dis 1997.

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UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

Q F. Lourdes Amalia Suárez C

Campo de PRAXIS PROFESIONAL

Unidad 3 MÉTODOS INMUNOLÓGICOS Y APLICACIONES

Cargo Fecha Firma

Q.F.Gina Johnson H. Mg. Docente TC, 12-11-2018

Q. F. Celeste Carrillo T. M.Sc Docente TC, 12-11-2018

Aprobado Q.F. Nilda Cedeño Albán Mg. Decana

FUNDAMENTO DEL MÉTODO

Conclusiones Apartado a desarrollar por parte del estudiante.

Instrucciones o consideraciones previas

FUNDAMENTO DEL MÉTODO

Actividades por desarrollar/ técnica operatoria

Resultados obtenidos (Observaciones, cálculos, datos, ecuaciones, tablas, gráficos, figura

Instrucciones o consideraciones previas

Actividades por desarrollar/ técnica operatoria

Instrucciones o consideraciones previas

FUDAMENTO DEL MÉTODO

Actividades por desarrollar/ técnica operatoria

Actividades por desarrollar/ técnica operatoria

Etapa 1 Pocillo [µl]

FUNDAMENTO DEL MÉTODO

Los reactivos esenciales requieren de un ensayo Inmunoenzimométrico que contenga anticuerpos de

Actividades por desarrollar/ técnica operatoria

Etapa 1 Pocillo [µl]

FUNDAMENTO DEL MÉTODO

El LH ELISA es un ensayo en fase sólida de inmunoadsorción unido a enzimas (ELISA), basado

Actividades por desarrollar/ técnica operatoria

Etapa 1 Pocillo [µl]

FUNDAMENTO DEL MÉTODO

Actividades por desarrollar/ técnica operatoria

Etapa 1 Pocillo [µl]

FUNDAMENTOS DEL MÉTODO

Actividades por desarrollar/ técnica operatoria

Actividades por desarrollar/ técnica operatoria

FUNDAMENTO DEL MÉTODO:

Etapa 1 Pocillo [µl]

Instrucciones o consideraciones previas

Actividades por desarrollar/ técnica operatoria

Analizar curva de calibración

 Usar los elementos de protección personal.(mandil, guantes etc.)

Instrucciones o consideraciones previas

FUNDAMENTO DEL MÉTODO

Es un inmunoensayo cualitativo para la detección de Plamodium en muestras de suero humano.

3.-Después de la lectura, eliminar el dispositivo IMMUNOQUICK Contact Malaria +4

No aparecerá NINGUNA Banda a nivel HRP II y pan LDH.

Instrucciones o consideraciones previas

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