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PROTOCOLES DE LABORATOIRE D'ENSEIGNEMENT

BIO 6031

MÉTHODOLOGIE BIOCHIMIQUE

BIA 3020

DÉPARTEMENT DES SCIENCES BIOLOGIQUES

SESSIONS HIVER ET ÉTÉ 2010

PROFESSEURS:
NORMAND CHEVRIER
FRANÇOIS DRAGON
MARIO HOUDE
FRANÇOIS OUELLET
2
3
LA SANTÉ ET LA SÉCURITÉ AU LABORATOIRE

Rappel de règles générales

- Porter un sarrau et des souliers fermés en tout temps. Le sarrau doit toujours être propre
et utilisé uniquement au laboratoire. Les cheveux longs doivent être attachés. S’abstenir
de porter chapeau, casquette ou foulard au laboratoire.

- Porter des lunettes de sécurité lors de la manipulation de produits contrôlés (voir


références). Concernant le port des lentilles cornéennes, voir l'encadré de la page 2.

- Utiliser tout équipement individuel ou collectif de protection recommandé, selon la


nature du matériel manipulé et le type de manipulation effectué. A ce propos, s'abstenir
de porter des gants protecteurs hors du laboratoire.

- Utiliser les instruments mis à votre disposition aux fins de pipetage. Ne jamais pipeter à
la bouche.

- S'abstenir de manger, de boire, de fumer, de se bousculer ou d'utiliser une radio


portative personnelle. De plus, laisser vos objets personnels, y compris nourriture et
boisson, dans votre casier.

- Se laver les mains et nettoyer votre surface de travail avec les produits appropriés,
avant et après chaque séance de laboratoire.

- Bien suivre les instructions décrites dans le protocole en ce qui concerne la nature et
l'ordre des réactions et s'informer des dangers reliés aux manipulations à effectuer (lire
les étiquettes et consulter le personnel technique ou les auxiliaires d'enseignement).

- Toujours identifier les contenants utilisés lors d'une expérience et les couvrir de façon
appropriée. S'abstenir de sortir le matériel à l'extérieur du laboratoire.

- Toujours prévenir le personnel technique ou la démonstratrice, le démonstrateur lors


d'un bris de matériel ou d'équipement ainsi que lors d'un déversement quelle que soit la
nature du produit (microorganismes, solvants, acides, etc.).

- Utiliser les procédés recommandés pour l'élimination des différents types de déchets.
4
EN CAS D'ACCIDENT

- Prévenir le personnel technique ou la démonstratrice, le démonstrateur.

- Appeler le Service de la prévention et de la sécurité (Accès direct: téléphones rouges


dans les corridors. Composer le 3131).

- Faire appel à une ou un secouriste.

EN CAS DE GROSSESSE

Les femmes enceintes doivent être particulièrement vigilantes relativement aux produits
manipulés au laboratoire. Prévenir le personnel technique et consultez les fiches signalétiques
pour bien connaître le niveau de risque encouru.

RÉFÉRENCES

- Introduction à la santé et la sécurité dans les laboratoires et lors de la manipulation des


substances à risque. (Document disponible dans toutes les salles de laboratoire, dans les
présentoirs SIMDUT).

- Répertoire des fiches signalétiques des produits utilisés dans les laboratoires.

- Liste des secouristes et des principaux numéros de téléphone à composer en cas


d'urgence.

À propos des lentilles cornéennes

Il n'y a pas d'interdiction de port de lentilles cornéennes dans les laboratoires. L'interdiction
qui est prononcée dans certains laboratoires n'est pas fondée scientifiquement. Toutefois, il
faut rappeler que les lentilles cornéennes ne peuvent en aucun cas être considérées comme
un équipement protecteur : partout où le port de lunettes de protection est exigé, cette
obligation est aussi faite aux porteurs de lentilles.

Il y a des inconvénients au port de lentilles dont les usagers doivent eux-mêmes assumer les
conséquences. D'une part, il y a des risques d'irritation oculaire dans les atmosphères très
sèches ou poussiéreuses. D'autre part, en cas d'urgence, la projection d'agents agresseurs
dans les yeux implique le recours immédiat à la douche oculaire : l'usager doit enlever
rapidement ses lentilles (ce qui n'est pas toujours facile) ou risquer de les perdre sous la
douche; s'il y a perte de conscience, ce seront d'autres personnes qui devront procéder, et il y
a lieu d'informer votre entourage que vous portez des lentilles, afin qu'on puisse intervenir
efficacement.

La décision de porter des lentilles (plutôt que des verres) revient donc à chaque étudiant,
mais elle doit être prise en toute connaissance de cause.
UNIVERSITÉ DU QUÉBEC À MONTRÉAL
DÉPARTEMENT DES SCIENCES BIOLOGIQUES

Prof: Chevrier, N.
BIO 6031/BIA3020 MÉTHODOLOGIE BIOCHIMIQUE Dragon, F.
Houde, M.
Ouellet, F.

OBJECTIF DU COURS

Le cours de Méthodologie biochimique consiste en une activité de synthèse axée sur l'intégration des
connaissances biochimiques que vous avez acquises jusqu'à date à travers les diverses activités
pédagogiques que vous avez suivies. En outre, cette activité de synthèse vise à développer plusieurs
habiletés intellectuelles qui vous seront indispensables pour œuvrer dans votre spécialité, notamment
l'esprit de synthèse, l'esprit critique, le sens de l'organisation, l'autonomie, le travail en équipe et la
communication orale et écrite.

FORMULE PÉDAGOGIQUE

Chaque équipe de deux personnes doit établir son protocole expérimental en se référant au présent
guide et aux divers articles qui sont cités à la fin du document. Ces articles constituent une
bibliographie abrégée que l'étudiant doit compléter. Il est également fortement recommandé à
l'étudiant(e) de réviser les notions de base de la chimie des protéines et de la catalyse enzymatique. Le
protocole doit être remis 4 ou 5 semaines avant le début du travail expérimental. Le professeur
corrigera les protocoles et remettra les commentaires selon l’échéancier remis sur la fiche de
cheminement (1 à 2 semaines). Vous pourrez par la suite récupérer votre protocole et devrez faire les
corrections et les ajustements demandés avant de commencer le laboratoire. Vous pourrez consulter le
professeur sur rendez-vous si vous avez besoin de discuter de votre protocole. L'évaluation du
protocole ne porte pas seulement sur le contenu mais aussi sur la compréhension des informations
qu'on y retrouve. Aucun travail expérimental ne pourra débuter sans l'accord du professeur.

Le travail en laboratoire s'effectue par équipe de deux étudiant(e)s et s'échelonne sur une période de
deux semaines (soit 11 jours incluant le samedi de la première semaine). L'équipe devra remettre un
rapport rédigé sous la forme d'un article scientifique à la date fixée dans l'entente d'évaluation. Le
protocole annoté par le professeur de même que le cahier de laboratoire doivent également être remis
au professeur en même temps que le rapport final.

Le but du laboratoire consiste en l'extraction, la purification et la caractérisation d'une phosphatase


acide d'origine végétale.
2

• EXTRACTION

Pour extraire l'enzyme, vous devez broyer le matériel à l'aide d'un homogénéisateur (Waring
blender) dans un solvant approprié (tampon d'extraction) selon un ratio poids/volume adéquat.
La fraction soluble que vous recueillez après les étapes de filtration et centrifugation correspond
à la fraction brute soluble F1.

• PURIFICATION

La purification de l'enzyme nécessite la précipitation fractionnée des protéines avec du sulfate


d'ammonium ((NH4)2SO4) ou un solvant organique (ex. acétone), des dialyses et des
chromatographies. La fraction obtenue après la précipitation sera la F2, celle obtenue après la 1ère
chromatographie sera la F3, et celle obtenue après la 2e chromatographie sera la F4. Lors de la
rencontre préparatoire au cours, chaque équipe se verra assigner le matériel végétal à utiliser, le
type de précipitation fractionnée (sel ou solvant organique) à faire et un minimum de deux étapes
chromatographiques à effectuer en série. À partir de ces données, chaque équipe doit rédiger de
façon détaillée la procédure expérimentale qu'elle se propose de suivre.

Pour les chromatographies, vous devez indiquer le tampon et la quantité de résine


chromatographique à utiliser, la quantité d'échantillon que vous appliquerez, la vitesse
d'écoulement et le volume des fractions que vous récolterez.

Exemples de types de chromatographie

1. Chromatographie de filtration sur tamis moléculaire


Matrice: Bio-gel a – 0.5 m (Bio Rad)

2. Chromatographie par échange ionique


Matrice: CM Bio-gel (échangeur cationique)
DEAE Bio-gel (échangeur anionique)
Phosphocellulose (échangeur cationique)

3. Chromatographie d'hydrophobicité
Matrice: Phényl-sépharose
Ter-butyl-sépharose

4. Chromatographie d'affinité
Matrice: Concanavaline A-sépharose

Après l’obtention de chacune des fractions (F1 à F4), il faut déterminer les paramètres appropriés
pour compléter le tableau de purification (voir ci-après) avant de procéder à l'étape suivante. Il
faut donc minimalement déterminer le volume des fractions et effectuer un dosage des protéines
et de l'activité enzymatique. De plus, pour chacune des fractions, il faut précipiter une quantité
suffisante de protéines avec de l'acétone en prévision de l'électrophorèse (200 µg pour F1 et F2 et
50 µg pour F3 et F4). S'il y a trop peu de protéines en F 4, cette quantité pourra être diminuée. Les
protéines précipitées à l'acétone devront être séchées et resuspendues à une concentration de 2
µg/µL dans le tampon d'échantillon pour l'électrophorèse.
3

TABLEAU DE PURIFICATION

Les paramètres ci-dessous doivent être déterminés sur toutes les fractions de F1 à F4

Fraction Volume Protéines U Enz Activité Facteur de Rendement


ml mg/ml mg U/ml U Spécifique purification %
total totale U/mg prot.
F1 (brute)*
F2 (…..)
F3 (…..)
F4 (…..)*

* Il faut aliquoter environ 5% de la F1 en plusieurs tubes tandis que la fraction F4 sera entièrement
aliquotée. Ces tubes sont congelés à -20ºC pour la caractérisation. Un nouveau tube sera dégelé à
chaque jour de caractérisation. Il est important de tester votre activité à chaque fois que vous
décongelez un nouveau tube pour vérifier si vous avez perdu de l’activité et, le cas échéant,
ajuster les dilutions. Pour la fraction F4, il faut évaluer si la concentration de protéines est faible
et discuter avec le professeur de la possibilité de stabiliser cette fraction en ajoutant du BSA.

• CARACTÉRISATION

La caractérisation d'une enzyme s'effectue sur la fraction brute F1 et la fraction la plus purifiée
F4. Un minimum de paramètres doivent être déterminés:

• température optimale
• pH optimal
• coefficient de dénaturation thermique
• Km et Vmax
• énergie d'activation
• effets d’activateurs et d'inhibiteurs (incluant un inhibiteur organique phosphorylé)
- déterminer I50 pour deux inhibiteurs de types différents
- utiliser cette I50 pour déterminer la Ki pour chacun de ces deux inhibiteurs
• poids moléculaire (SDS-PAGE et gradient de glycérol)

N.B. Les valeurs de Vmax doivent être exprimées en µmol de produit formé/min/mg de protéine.
4

PLAN DE RÉDACTION DU PROTOCOLE

1. Table des matières

2. Introduction (max. 2 pages): Propriétés des phosphatases et objectifs de l'expérience

3. Échéancier (calendrier de travail)(1)

4. Liste des principaux tampons(2)

5. Dosage des protéines et courbe standard(3)


5.1 Méthode de dosage
5.2 Courbe standard

6. Dosage de l'activité enzymatique et courbe standard(4)


6.1 Méthode de dosage
6.2 Courbe standard

7. Extraction et purification de la phosphatase acide de…


7.1 Extraction…
7.2 Précipitation fractionnée(5)…
- Principe (max. ½ p.)
- Procédure
7.3 Dialyse (si nécessaire)
- Principe (max. ½ p)
- Procédure
7.4 Purification
7.4.1 1ère étape chromatographique (nommez-la)
- Principe (max ½ p.)
- Procédure
7.4.2 2e étape chromatographique (nommez-la)
- Principe (max ½ p.)
- Procédure

8. Caractérisation de la phosphatase acide de … (F1 et FX)(6)


8.1 Détermination de la température optimale
8.2 Détermination du pH optimal
8.3 Linéarité de la réaction dans le temps en conditions optimales(7)
8.4 Détermination du coefficient de dénaturation thermique
8.5 Détermination du Km et de Vmax
8.6 Détermination de l'énergie d'activation(8)
8.7 Identification et justification des choix de substances affectant l’activité de la phosphatase
acide(9)
8.8 Détermination de I50 de 2 inhibiteurs de types différents (dont un est organique phosphorylé)
(9)

8.9 Détermination du Ki pour les deux inhibiteurs sélectionnés


8.10 Électrophorèse sur gel de polyacrylamide (SDS-PAGE)(10)
5

8.11 Gradient de glycérol sur la F2 et la F4

9. Liste des références(11)

10. Réponse aux questions

NOTES:
1
Définissez les étapes quotidiennes à franchir pour les 11 jours de travail expérimental.
2
Énumérez les principaux tampons que vous prévoyez utiliser :
ex: tampon A: Tampon de réaction enzymatique : acétate de sodium 100 mM, pH 5,2
tampon B : Tampon d’extraction : acétate de sodium 100 mM pH 5,5, 1 mM PMSF, 0,1 mM
DTT, 100 mM NaCl, 1% PVP
tampon C: Tampon de chargement et de lavage pour chromatographie DEAE : Tris-HCl 10
mM pH 7,4

Vous devez préparer la majorité des solutions que vous allez utiliser. Par contre, les solutions
suivantes sont habituellement préparées par les techniciens:

- BSA (albumine de sérum bovin) 2% (dissous dans H2O)


- PMSF 100 mM (dissous dans de l’éthanol)
- DTT 100 mM (dissous dans H2O)
- para-nitrophénol (pNP) 10 mM (dissous dans H2O)
- para-nitrophényl phosphate (pNPP) 50 mM (dissous dans H2O)
- acide acétique 6 M, HCl 6 M et NaOH 2 M
- solution de Na2CO3 0,2 M (solution basique d'arrêt de la réaction enzymatique)
- les solutions pour le dosage des protéines (Lowry) (Annexe 1)
- les solutions et les tampons pour l'électrophorèse.
3
Référez-vous à l'annexe 1.

Dans le cas de la courbe standard, préparez un tableau précisant les détails de la procédure:

# BSA 100 µg/ml H2O Quantité Sol. A Sol. B A750 nm


éprouvette (µL) (µL) BSA (mL) (mL)
(µg)
1,2 0 1000 0 5 10 0,5 30
3,4 100 900 10 5 m 0,5 m
' ' ' ' ' i ' i
' ' ' ' ' n ' n

Note: À l'annexe 2 on décrit une procédure d'estimation de la concentration en protéines par


mesure d'absorbance en U.V.
4
Lire attentivement l'annexe 3 et répondre aux questions posées en annexe 7 pour bien comprendre
les conditions à respecter pour préparer un milieu de dosage adéquat.
6

5
Si vous devez faire une précipitation fractionnée avec du sulfate d'ammonium, consultez l'annexe
4.
6
Décrire en détail (en incluant un tableau des pipetages requis, ordre d’addition des réactifs,
composition des blancs, temps de réaction, etc.) la procédure pour chacun des tests de
caractérisation. Donnez tous les détails des calculs relatifs aux traitements des données (formules à
utiliser) et présentez un exemple de graphique nécessaire pour la représentation (et parfois pour le
calcul) de vos données. Expliquez comment calculer (quelles formules et à partir de quelles
données expérimentales et graphiques) les Ki pour les 3 types d'inhibition réversible.
7
Lorsque vos conditions optimales sont établies, vous devez déterminer un temps de réaction et une
dilution enzymatique appropriée pour les différentes expériences.
8
Pour la détermination de l'énergie d'activation, il est utile de consulter la référence suivante: Segel,
1976. Décrivez également les deux méthodes (graphique d’Arrhenius et formule dérivée) pour
calculer l'énergie d'activation ainsi que les expériences requises dans les deux cas.
9
Afin d’identifier des substances qui modulent l’activité de votre phosphatase, vous devez en tester
plusieurs à une concentration reconnue pour agir (activateurs tels des ions divalents, ou des
inhibiteurs) sur des phosphatases avec références à l’appui. Vous devrez présenter les résultats des
effets observés pour les différentes substances sous forme de tableau exprimant le pourcentage
d’activité par rapport au témoin. Si vous effectuez plusieurs concentrations d’une même
substance, un graphique pourrait être plus approprié. Parmi les substances ayant un effet
inhibiteur, vous en choisirez deux (dont un est organique phosphorylé) pour déterminer les I50 et
Ki. Référez-vous à la liste de l'annexe 5. Certains produits tels les ions ne sont pas listés mais
peuvent être disponibles sur demande. Attention: certaines substances peuvent affecter le pH.
10
Référez-vous à l'annexe 6. Faire un tableau résumé des solutions à utiliser (concentrations initiale
et finale, volumes) pour préparer des gels de séparation de 12% polyacrylamide, surmontés de gels
d’empilement de 5%. Ne pas répéter tous les détails qui se trouvent dans l’annexe sur la
préparation des gels!
11
Indiquez ici toutes les références qui ont été citées dans le texte pour documenter chacune des
étapes de votre protocole.

Il est à noter que dans le texte, on cite les références de la façon suivante:
Un auteur : Biswas (1996); deux auteurs : Biswas et Muller (1996); trois auteurs et plus : Biswas
et al. (1996). Dans la liste des références (bibliographie) apparaissent les noms de tous les auteurs,
l’année, le titre, la revue, le volume et les pages (voir la bibliographie du présent document à titre
d'exemple). Pour les livres et chapitres de livres, il faut ajouter la maison d'édition, les éditeurs (s'il
y a lieu), la ville et le nombre de pages (ou les pages consultées).
7

ANNEXE 1

DOSAGE DES PROTÉINES

Réf. Lowry O.H., Rosebrough, N.J., Farr, A.L., Randall, R. 1951. Protein measurement with the Folin
phenol reagent. J. Biol. Chem. 193: 265-275.

Dosage utile entre 20 et 100 µg de protéines par échantillon. Le standard utilisé le plus communément
est l’albumine de sérum bovin (BSA).

Réactifs: Tartrate double Na et K à 2% dans de l'eau distillée


CuSO4 à 1% dans de l'eau distillée
Na2CO3 à 2% dans 0,1 N NaOH

Solution A : Juste avant le dosage, mélangez ces 3 réactifs dans les proportions suivantes:

Tartrate: 1 ml
CuSO4: 1 ml
Na2CO3: 100 ml

Solution B: réactif de Folin-Ciocalteu dilué selon les recommandations du fabricant avec de l'eau
distillée.

Dosage :
+ 5 ml + 0,5 ml
Échantillon ou standard Solution A Solution B Lecture de A750nm
dans 1 ml H2O Attente de Attente de
10 min. 30 min.

Après avoir ajouté la solution A, mélangez immédiatement par inversion et attendez exactement 10
min. Après 10 min, ajoutez la solution B, mélangez à nouveau et attendez 30 min avant de mesurer
l'absorbance à 750 nm. Il est important de mélanger chaque tube dès qu’une solution est ajoutée.

*Veuillez noter que l’échantillon standard est préparé dans l’eau alors que vos échantillons de
phosphatases sont dans différents tampons selon les étapes de purification. Il faut alors préparer un
blanc approprié pour le dosage des protéines. Dans certains cas, il est préférable de faire une
microdialyse ou de précipiter au TCA une partie de votre fraction avant d’effectuer le dosage
(exemple : forte concentration en sel).
8

ANNEXE 2

ESTIMATION DES PROTÉINES PAR ABSORBANCE EN UV

Rapport Facteur pour


A280/A260 cellule de 1 cm

1,75 1,11
1,60 1,08
1,50 1,05
1,40 1,02
1,30 1,005
1,25 1,000
1,20 0,950
1,15 0,901
1,10 0,870
1,05 0,837
1,00 0,804
0,96 0,773
0,92 0,757
0,88 0,717
0,86 0,705
0,84 0,690
0,82 0,670
0,80 0,649
0,78 0,619
0,76 0,597
0,74 0,567
0,72 0,544
0,70 0,510
0,68 0,481
0,66 0,449
0,65 0,429
0,64 0,417
0,62 0,382
0,60 0,361

Pour cette méthode, des lectures d’absorbance sont faites à 280 et 260 nm. Le ratio A280/A260 doit être
calculé et utilisé pour déterminer le facteur de correction dans le tableau ci-haut. On peut estimer la
concentration en protéines (en mg/mL) en multipliant le facteur de la cellule par A280.
9

ANNEXE 3

ACTIVITÉ ENZYMATIQUE

Si vous désirez déterminer l'activité enzymatique à un temps fixe, vous devez vous assurer que la
quantité de produit formé est directement proportionnelle au temps, c'est-à-dire que:

δ P/δ t = constante, sur la période de temps choisie.

Notez que la concentration enzymatique (dilution 1/2, 1/5, 1/10 …) est l'un des facteurs qui gouverne
cette relation entre la quantité de produit formé et le temps de réaction. Il est donc nécessaire, pour
chaque fraction F1 à F4, de faire une cinétique de l'activité enzymatique dans le temps (ex: de 0 à
30 min) et ce à différentes concentrations d'enzyme (ex: dilution 1/2, 1/5, 1/10, etc.). Ceci vous
permettra de visualiser graphiquement l'activité de votre enzyme en fonction de sa concentration
et du temps de réaction.

De plus, le pouvoir tampon ainsi que le volume du mélange réactionnel, servant à déterminer l'activité
enzymatique, doivent être constants d'une expérience à l'autre. Par exemple, vous pourriez avoir un
mélange réactionnel standard composé comme suit:

Tampon X 100 mM pH 5,0 500 µL


Substrat (pNPP) 50 mM 100 µL
Préparation enzymatique (dil 1/5) 50 µL
H2O (ou sel ou autre substance à tester, dissout dans H2O) 350 µL
Volume final = 1 mL

Note: Lorsque vous décrivez la procédure de dosage de l'activité enzymatique, il est bien important
de donner tous les détails pertinents tels que la composition du milieu de dosage (volume,
concentration initiale, concentration finale, quantité de chaque substance), l'ordre d'addition des
substances, le temps de pré-incubation, la température du milieu, comment on démarre la
réaction, le temps de réaction, comment on arrête la réaction, comment on prépare le(s)
blanc(s) de réaction, etc…

Il faut décrire un (ou plusieurs) blanc(s) pour chaque expérience prévue pour la caractérisation.
10

ANNEXE 3 (suite)

COURBE STANDARD

Vous devez également quantifier le produit formé par la réaction. Vous devez donc établir une courbe
standard de l'absorbance du produit (pNP) à son lamdaMAX en fonction de sa concentration. Cette
courbe doit être établie dans les mêmes conditions que celles utilisées pour déterminer l'activité
enzymatique sauf que l'enzyme et le substrat sont remplacés par le produit (vous trouverez le lamdaMAX
dans la littérature).

Faire un tableau détaillant la composition des milieux servant à établir la courbe standard en
complétant les données manquantes. Évitez les petits volumes pour réduire l’imprécision des
pipetages. Faites plutôt des dilutions en séries et pipetez des volumes de plus de 20 µL lorsque cela est
possible.

ex:

# tube pNP Tp acétate H2O Na2CO3 Volume Quantité pNP Absorbance


x mM 100 mM (µL) 0,2M final de pNP (µM) (λ max)
(µL) pH 5,0 (mL) (mL) (µmol)
(µL) -Na2CO3 + Na2CO3
1, 2 0 ? ? 2 3 ? ? ?
3, 4 20 ? ? 2 3 ? ? ?
5, 6
etc…
11

ANNEXE 4

TABLE DE SATURATION EN SULFATE D'AMMONIUM À 0°C

Quantité de sulfate d'ammonium en grammes à ajouter à 100 mL de solution

% SATURATION FINALE EN SEL

% 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100

0 10.7 13.6 16.6 19.7 22.9 26.2 29.5 33.1 36.6 40.4 44.2 48.3 52.3 56.7 61.1 65.9 70.7
%
5 8.0 10.9 13.9 16.8 20.0 23.2 26.6 30.0 33.6 37.3 41.1 45.0 49.1 53.3 57.8 62.4 67.1
10 5.4 8.2 11.1 14.1 17.1 20.3 23.6 27.0 30.5 34.2 37.9 41.8 45.8 50.0 54.4 58.9 63.6
S
A 15 2.6 5.5 8.3 11.1 14.3 17.4 20.7 24.0 27.5 31.0 34.8 38.6 42.6 46.6 51.0 55.5 60.0
T 20 2.7 5.6 8.4 11.5 14.5 17.7 21.0 24.4 28.0 31.6 35.4 39.2 43.3 47.6 51.9 56.5
U
R 25 2.7 5.7 8.5 11.7 14.8 18.2 21.4 24.8 28.4 32.1 36.0 40.1 44.2 48.5 52.9
A 30 2.8 5.7 8.7 11.9 15.0 18.4 21.7 25.3 28.9 32.8 36.7 40.8 45.1 49.5
T 35 2.8 5.8 8.8 12.0 15.3 18.7 22.1 25.8 29.5 33.4 37.4 41.6 45.9
I 40 2.9 5.9 9.0 12.2 15.5 19.0 22.5 26.2 30.0 34.0 38.1 42.4
O
N 45 2.9 6.0 9.1 12.5 15.8 19.3 22.9 26.7 30.6 34.7 38.8
50 3.0 6.1 9.3 12.7 16.1 19.7 23.3 27.2 31.2 35.3
I 55 3.0 6.2 9.4 12.9 16.3 20.0 23.8 27.7 31.7
N 60 3.1 6.3 9.6 13.1 16.6 20.4 24.2 28.3
I
T 65 3.1 6.4 9.8 13.4 17.0 20.8 24.7
I 70 3.2 6.6 10.0 13.6 17.3 21.2
A 75 3.2 6.7 10.2 13.9 17.6
L
E 80 3.3 6.8 10.4 14.1
85 3.4 6.9 10.6
E 90 3.4 7.1
N
95 3.5
S
E
L
12

ANNEXE 5
Inhibiteurs compétitifs :

Organiques: 100 mM 3-phosphoglyceric acid (acide 3-phosphoglycérique)


ADP phosphoénol pyruvate
AMP phosphosérine
ATP phosphothréonine
2-carboxyphenyl phosphate phosphotyrosine
fructose 6-phosphate phytic acid (acide phytique)
fructose 1,6-diphosphate ribose 5-phosphate
glucose 1-phosphate Inorganiques: concentration à déterminer
glucose 6-phosphate potassium phosphate dibasique PM 174,18
β -glycérophosphate monobasique PM 136,09
DL-α -glycérolphosphate sodium phosphate dibasique PM 141,96
α -naphthylphosphate monobasique PM 119,96
phénylphosphate sodium pyrophosphate PM 446,06
tripolyphosphate PM 367,9

Métaux lourds: Solutions déjà préparées

N.B. toujours porter des gants quand on manipule ces produits

Métal Concentration Toxicité


Nitrate de cadmium (cadmium nitrate) 1M toxique: effets cumulatifs
oxidant fort
Acide p-(hydroxymercury)benzoique.Na 0,05 M très très toxique
(p-(hydroxymercury)benzoic acid Na salt)
Iodoacétamide 500 mM toxique
Acétate de plomb (lead acetate) 0,05 M toxique: effets cumulatifs
Chlorure de plomb (lead chloride) 1 mM toxique: effets cumulatifs
Nitrate de plomb (lead nitrate) 0,1 mM toxique: effets cumulatifs
Chlorure de mercure (mercury chloride) 0,1 mM toxique: effets cumulatifs
Nitrate de mercure (mercury nitrate) 10 mM toxique: effets cumulatifs
Sulfate de mercure (mercury sulfate) 10 mM toxique: effets cumulatifs
Acide oxalique (oxalic acid) 100 mM toxique, oxidant fort
Nitrate d’argent (silver nitrate) 100 mM toxique
Arséniate de sodium (sodium arsenate) 100 mM toxique
Fluorure de sodium (sodium fluoride) 100 mM toxique
13

ANNEXE 6
ÉLECTROPHORÈSE SUR GEL DE POLYACRYLAMIDE EN PRÉSENCE DE SDS

Les gels de polyacrylamide sont préparés selon la technique de Laemmli (1970), légèrement modifiée.

Les gels de polyacrylamide de 5%, et de 12% doivent être préparés dans des tubes en plastique jetables
à partir d'une solution stock composée de 29,2% (p/v) acrylamide et 0,8% (p/v) N;N, bismethylène-
acrylamide dissous dans de l'eau distillée. (Voir le tableau à la page suivante).

Pour cette expérience un minigel sera utilisé. Vous devez préparer :


- 10 ml de gel de séparation 12% dans le tampon Tris-HCl, pH 8,8 contenant du SDS
- 4 ml de gel 5% dans le tampon Tris-HCl, pH 6.8 contenant du SDS

Les gels sont polymérisés par l'addition de TEMED (tétramethyl ethylène diamine) (concentration
finale de 0,05%), et de persulfate d'ammonium 10% (concentration finale 0,1%). L'addition du
TEMED et du persulfate d'ammonium dans la solution d'acrylamide (5% ou 12%) se fait au dernier
moment. Les solutions sont mélangées doucement pour éviter la formation de bulles d'air, ce qui
ralentirait la polymérisation des gels.

A l'aide d'une pipette P1000, on introduit la solution de gel 12% entre les plaques de verre de façon à
ce que le gel occupe 6 cm de hauteur. On laisse ensuite les gels polymériser à la température de la
pièce (environ 45 minutes). Lorsque les gels sont polymérisés, on insère le peigne puis on ajoute le gel
de 5% de façon à ce qu'il occupe le reste du volume disponible entre les deux plaques (environ 1 cm de
hauteur) et on laisse polymériser (au moins 45 minutes).

Les protéines (50 à 200 µg) des fractions F1, F2, F3, F4 ... peuvent être dyalisées et concentrées par
lyophilisation. Elles peuvent aussi être précipitées avec 5 volumes d'acétone très froid (-20°C) pendant
au moins une heure, et chacun des précipités est solubilisé à une concentration de 2 µg/µL dans le
tampon d'échantillon pour électrophorèse (0,06 M Tris-HCl, pH 6,8, 2% SDS, 10% glycérol, 5% β-
mercaptoéthanol et 0,002% de bleu de bromophénol (ce dernier est un colorant servant de marqueur
pour le front de migration dans chacun des puits).

Les échantillons sont ensuite incubés à 100°C pendant 2 min. puis déposés dans les puits. Dans un des
puits, déposez les standards de protéines de masses moléculaires connues (5-10 µL).

L'appareil à électrophorèse est alors rempli avec le tampon d'électrophorèse 0,025 M Tris, 0,192 M
glycine et 0,1% SDS, pH 8,3. L'électrophorèse est effectuée à la température de la pièce à 150 V
jusqu'à ce que le bleu de bromophénol ait atteint le bas du gel (environ 75 min.).
14

ANNEXE 6 (suite)
ÉLECTROPHORÈSE : solutions pour les gels Tris-Glycine SDS-PAGE
6% 5 ml 10 ml 15 ml 20 ml 25 ml 30 ml 40 ml 50 ml
H2O 2.65 5.3 7.95 10.6 13.25 15.9 21.2 26.5
30 % mélange Acrylamide-bisa 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 8.0 10.0
1,5 M Tris (pH 8,8) 1.25 2.5 3.75 5 6.25 7.5 10 12.5
10% Sodium dodecyl sulfate 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0,4 0.5
10% Ammonium persulfate 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0,4 0.5
TEMEDb 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03 0,04 0.05
8% 5 ml 10 ml 15 ml 20 ml 25 ml 30 ml 40 ml 50 ml
H2O 2.3 4.6 6.95 9.25 11.6 13.9 18.5 23.1
30 % mélange Acrylamide-bisa 1.33 2.66 4 5.33 6.66 8 10.66 13.33
1,5 M Tris (pH 8,8) 1.25 2.5 3.75 5 6.25 7.5 10 12.5
10% Sodium dodecyl sulfate 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0,4 0.5
10% Ammonium persulfate 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0,4 0.5
TEMEDb 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03 0,04 0.05
10% 5 ml 10 ml 15 ml 20 ml 25 ml 30 ml 40 ml 50 ml
H2O 2.00 4.00 5.95 8 9.9 11.9 15.9 19.8
a
30 % mélange Acrylamide-bis 1.66 3.33 5 6.66 8.33 10 13.33 16.66
1,5 M Tris (pH 8,8) 1.25 2.5 3.75 5 6.25 7.5 10 12.5
10% Sodium dodecyl sulfate 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0,4 0.5
10% Ammonium persulfate 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0,4 0.5
TEMEDb 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03 0,04 0.05
12% 5 ml 10 ml 15 ml 20 ml 25 ml 30 ml 40 ml 50 ml
H2O 1.65 3.3 4.95 6.6 8.25 9.9 13.15 16.45
30 % mélange Acrylamide-bisa 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 16.0 20.0
1,5 M Tris (pH 8,8) 1.25 2.5 3.75 5 6.25 7.5 10 12.5
10% Sodium dodecyl sulfate 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0,4 0.5
10% Ammonium persulfate 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0,4 0.5
b
TEMED 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03 0,04 0.05
15% 5 ml 10 ml 15 ml 20 ml 25 ml 30 ml 40 ml 50 ml
H2O 1.15 2.3 3.45 4.6 5.75 6.9 9.15 11.45
30 % mélange Acrylamide-bisa 2.5 5.0 7.5 10 12.5 15 20 25
1,5 M Tris (pH 8,8) 1.25 2.5 3.75 5 6.25 7.5 10 12.5
10% Sodium dodecyl sulfate 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0,4 0.5
10% Ammonium persulfate 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0,4 0.5
TEMEDb 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03 0,04 0.05

EMPILEMENT (5%) 1 ml 2 ml 3 ml 4 ml 5 ml 6 ml 8 ml 10 ml
H2O 0.68 1.38 2.06 2.75 3.44 4.12 5.5 6.88
30 % mélange Acrylamide-bisa 0.17 0.33 0.5 0.67 0.83 1.0 1.33 1.66
1,0 M Tris (pH 6,8) 0.125 0.25 0.375 0.5 0.625 0.75 1 1.25
10% Sodium dodecyl sulfate 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.08 0.1
10% Ammonium persulfate 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.08 0.1
TEMEDb 0.001 0.002 0.003 0.004 0.005 0.006 0.008 0.01
a
Mélange de 29.2% Acrylamide et de 0.8% de N,N’-methylene-bis-
acrylamide
b
N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine
15

ANNEXE 6 (suite)

COLORATION AU BLEU DE COOMASSIE

Les gels sont retirés des plaques et colorés dans du méthanol-acide acétique-H 2O (40:10:50) contenant
0,1% de bleu de Coomassie R-250 durant 2 h. Ensuite, les gels sont décolorés par plusieurs lavages
successifs dans de l’eau distillée en chauffant au micro-ondes.

Gradient linéaire de glycérol.

Le poids moléculaire natif de l'enzyme sera déterminé par ultracentrifugation sur un gradient linéaire
de glycérol 10-30% dans un tampon 0,1 M Na-acétate pH 5,0. Des tubes serviront à faire sédimenter
des protéines de poids moléculaires connus et à générer une courbe étalon. Les différentes protéines et
leurs poids moléculaires vous seront communiqués au laboratoire. Deux autres tubes serviront pour
vos échantillons F2 et F3 ou F4 selon la quantité d'enzyme disponible. Des gradients de 11 ml seront
générés à l'aide d'un formateur de gradient et vous déposerez délicatement une unité enzymatique
(volume à calculer) de vos échantillons à la surface du gradient. Les tubes seront centrifugés à 40,000
RPM dans un rotor SW41 (Beckman) pendant 30-36 heures. Des fractions de 0,5 ml (10 gouttes)
seront récupérées dans des microtubes de 1,5 ml (environ 20 tubes) à l'aide d'un fractionateur de
gradient (Fraction Recovery System, Beckman) et la DO280 ainsi que l'activité enzymatique seront
déterminées. Le tube contenant le maximum d'activité sera analysé par électrophorèse avec vos
différents échantillons (F1 à F4).
16

ANNEXE 7

Répondre aux questions suivantes:

1. Lorsque l'on veut extraire la phosphatase acide à partir d'un matériel végétal, il est important que
le solvant utilisé permette une extraction efficace de l'enzyme tout en préservant son intégrité
fonctionnelle. Dans quelle mesure le milieu d'extraction que vous vous proposez d'utiliser
permettra d'atteindre cet objectif? Définir le rôle de chacune des composantes de votre milieu
d'extraction.

2. Quand peut-on utiliser la méthode de dosage des protéines par absorbance en U.V. plutôt que la
méthode de Lowry? Expliquez.

3. Pourquoi est-il nécessaire de mesurer la vitesse de réaction enzymatique de la phosphatase acide


en début de réaction (vitesse initiale) plutôt qu'en fin de réaction?

4. Pourquoi la réaction enzymatique (phosphatase acide) est-elle arrêtée en ajustant le pH à 10,5-11,0


avec une base (Na2CO3 ou NaOH)? Est-ce simplement pour inactiver l'enzyme à un pH extrême?
Si oui, pourrait-on utiliser un acide tel que le HCl?

5. Dans quelle mesure les valeurs de Km et Vmax relevées dans la littérature peuvent être utiles pour
la préparation de votre milieu de dosage de l'activité phosphatase acide?

6. Pourquoi est-il nécessaire d'exprimer les valeurs de Vmax par mg de protéines?

7. En supposant que vous ayez un milieu réactionnel pour le dosage de l'activité enzymatique qui soit
le suivant:

Tampon X 100 mM pH 5,0 500 µL


Substrat (pNPP) 50 mM 100 µL
Préparation enzymatique (dil 1/5) 50 µL
H2O (ou sel ou substance autre à tester et dissoute dans H2O) 350 µL
1 mL

a) Dans cet exemple, quelles sont les concentrations finales de tampon et de substrat?

b) Comment pourrait-on avoir les mêmes concentrations finales de tampon ou de substrat à partir
de solutions initiales de concentrations différentes et ce sans modifier le volume final
(STANDARD) de 1 ml? Donnez un exemple.

8. Pour mesurer l'activité phosphatase acide, il faut préparer, en plus du milieu de dosage, un milieu
approprié qui sert de blanc de réaction. Indiquez les volumes respectifs de même que la
concentration initiale et la concentration finale de chacune des composantes de ce milieu.
Expliquez le rôle du blanc de réaction.

9. Pour mesurer la quantité de produit formé (pNP) par la réaction enzymatique, vous devez vous
référer à la courbe standard que vous aurez établie. De quelle façon les valeurs de coefficient
17

d'extinction molaire retrouvées dans la littérature vous sont utiles pour préparer votre courbe
standard de pNP?

10. Pour déterminer l'effet du pH sur l'activité de la phosphatase acide, il est nécessaire d'utiliser
différents tampons pour être capable de couvrir une gamme assez large de pH (ex: pH 3,5 à 8,5).
La valeur de pKa de chaque tampon est une des caractéristiques qui guide votre choix. Expliquer.

S'il faut plusieurs tampons pour couvrir la gamme de pH, il faut des points de pH commun entre
chaque changement de tampon. Pourquoi?

D'autre part, certains tampons, tel le tampon phosphate, peuvent ne pas convenir pour d'autres
raisons. Expliquez.

11. Vous disposez d'un pH mètre et des produits et solutions suivants :

- Acétate de sodium, poudre (CH3COONa.3H2O) : FW 136,08


- Acide acétique, liquide (CH3COOH) : 6 M
- Acide chlorhydrique, liquide (HCl) : 12 M
- Acide éthylènediaminetétraacétique disodique, poudre (EDTA.2Na) : FW 372,24
- Dithiothreitol (DTT): 1 M
- Glycérol: liquide 100% (v/v)
- Sodium dodecyl sulfate (SDS): poudre
- Tris base, poudre (tris(hydroxymethyl)aminomethane) : MW 121,14

Décrire précisément la procédure à suivre pour la préparation des solutions suivantes:

a) Préparez une solution de tampon acétate de sodium 0,2 M pH 5,2.


b) Préparez exactement 150 ml du tampon acétate de sodium 50 mM, pH 5,2, EDTA 5 mM,
DTT 1 mM.
c) Préparez exactement 50 ml du tampon Tris-HCl 25 mM pH 6,8, SDS 2% (p/v), glycérol
10% (v/v), DTT 100 mM.
18

RÉFÉRENCES

MONOGRAPHIES UTILES (LIVRES)

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21

PLAN DE RÉDACTION DU RAPPORT DE LABORATOIRE

Le rapport vaut 50% de la note finale. La pondération suivante est calculée sur 100: Résumé 5%;
Introduction 10%; Résultats 10%; Discussion 25%, Matériel et Méthodes 10%; Références 5%;
Légende, figures et tableaux 20%; Exemples de calculs 5%; Forme (présentation, syntaxe, ortographe,
langage scientifique) incluant le cahier de laboratoire 10%. Le modèle de rédaction doit suivre celui
qui est requis pour la soumission de manuscrits à la revue Plant Physiology (voir p. 24-27).

1. Page 1: Titre abrégé (maximum 60 caractères et espaces), nom et adresse professionnelle des
auteurs ainsi que les coordonnées pour être rejoint (téléphone, fax, courriel). À l'exception de la
page titre, numérotez toutes les pages (comptez la page titre).

2. Page 2: Titre complet, nom des auteurs et adresse de l'institution.

3. Page 3: Résumé Maximum 200 mots. Les objectifs principaux, les méthodes et résultats
principaux obtenus (purification et caractérisation) doivent être présentés pour F1 et Fx. Porter
une attention aux unités utilisées. Les points nouveaux par rapport à la littérature sont
intéressants à souligner.

4. Page 4 et suivantes.

- Introduction. Maximum 5 pages à double interligne. Une revue de littérature sur le rôle et
les propriétés des phosphatases soulignant leur diversité, ressemblances, etc. Une
recherche de la littérature récente est importante (ne pas se limiter aux références fournies
avec le protocole).

- Résultats. Pas de limite de pages. Des titres et sous-titres sont utiles dans cette section
ex: purification de la…, détermination du pH optimal, etc.). Uniquement le texte est
présenté dans cette section. Il faut citer tous les tableaux et toutes les figures dans le corps
du texte de la section résultats. Les étapes chromatographiques sont à expliquer et à
présenter en figures principales (pas en annexe). Tous les éléments importants doivent être
inclus dans les figures (Ex: D.O. lors du chargement, des lavages, moment où l'échantillon
est ajouté, début et fin des gradients, valeur d'activité enzymatique et unités utilisées, etc.).

- Discussion. Maximum 10 pages.

- Matériel et méthodes. Voir exemples de présentation dans les divers articles fournis. Il
ne s'agit pas ici de répéter le format utilisé pour élaborer votre protocole de laboratoire
mais de fournir les informations essentielles pour permettre à d'autres personnes
expérimentées de pouvoir répéter vos expériences. Utilisez des titres pour chaque méthode.
Pour des méthodes très connues (ex. Lowry), vous pouvez référer aux articles publiés.
Maximum 5 pages.

- Littérature citée. En ordre alphabétique. Faites attention de respecter le format demandé


par la revue Plant Physiology (ponctuation, type de caractères, abréviation du journal, etc.).
22

- Tableaux. Pour chaque tableau, il faut indiquer le titre et la légende sur la même page.

- Légendes des figures. Cette section comprend seulement le texte des titres et légendes
des figures.

- Figures (chaque figure sur une page séparée sauf pour les figures composées (A, B, etc.)
qui rapportent des données pouvant être présentées ensemble). Il faut indiquer seulement
« Figure 1 », « Figure 2 », etc. sous chacune des figures.

- Annexes.

- Les courbes standards sont présentées ici sous forme de figures avec des légendes
sur des pages séparées (même style que pour les résultats). Certains résultats non
présentés dans la section résultats, mais qui peuvent servir aux exemples de calculs,
peuvent être ajoutés ici.

- Exemples de calculs. Inclure des titres. Chacune des données utilisées doit provenir
de résultats réels auxquels vous devez vous référer précisément, soit à votre cahier
de laboratoire (no. de page) ou à une des figures ou tableaux présentés dans le
rapport (ex: ordonnée à l'origine pour le calcul du Km apparent lors du calcul des
Ki; la valeur doit être indiquée sur le graphique).

Des exemples de calculs doivent être fournis pour:


- dosage des protéines
- dosage de l'activité enzymatique
- calcul de l'activité spécifique
- calcul du facteur de purification
- calcul du rendement
- calcul du coefficient de dénaturation thermique
- calcul de l'énergie d'activation par la méthode d'Arrhenius et/ou par la méthode
non graphique (Vmax à 2 températures, Segel 1976) selon les résultats obtenus
- calcul du Km
- calcul de I50
- calcul du Vmax (en U/mg de protéines) Un tableau doit montrer les données
brutes (DO d'activité) et les facteurs utilisés (expliqué un à un) pour obtenir les
valeurs finales en U/mg de protéine.
- calcul du Ki pour un inhibiteur compétitif
- calcul du Ki pour un 2e inhibiteur de type différent.
23

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ORGANIZATION
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mail address of author to whom all correspondence should be sent (please note that the Journal will cite only
one corresponding author per article); and journal research area most appropriate for the paper (categories are
listed above).

2. Page 2: Title of article; all authors' full names (necessary for accurate indexing and abstracting); institution
address(es).

3. Page 3: Footnotes in the following order: financial source (if any) and the experiment station or institution
paper number; present address(es) of authors if different from heading; corresponding author with e-mail
address.

4. Page 4: Abstract (include genus and species). Abstracts cannot exceed 250 words or the processing of the
paper will be delayed.

5. Page 5 and subsequent pages: Text (the "introduction" should not exceed 10,000 characters), Results,
Discussion, Conclusion, and Materials and Methods; Acknowledgments (do not use the space to supply
financial source).

6. Literature Cited. (Authors are responsible for accuracy in citations. Citations will be copyedited for format
only.)

7. Figure legends.

8. Tables with brief and concise titles and legends (one table per page).

9. Original figures (one figure per page). See FIGURE PREPARATION.

TEXT REQUIREMENTS
Style and format. Manuscripts should be written in simple declarative sentences and must conform to accepted
standards of English style and usage. Consult recent issues for style and placement of main headings,
subheadings, and paragraph headings and for other details of format.

Nomenclature. In the abstract, at first mention in the text, and in "Materials and Methods," include complete
botanical names (genus, species, and, when appropriate, cultivar) for all experimental plants. Do NOT use the
genus name alone, unless that is the accepted common name. Identify algae and microorganisms by a
collection number or that of a comparable listing. Following first mentions, generic names should be abbreviated
to the initial, except when confusion could arise by reference to genera with the same initial. Common names
can be used after first mention. When the genus name is the accepted common name, the name should be in
lowercase, roman type. Arabidopsis (no italics) is an accepted common name for A. thaliana.

Abbreviations. Do not abbreviate words or measures in the title other than those standard for international
usage. Chemical symbols can be used in the title, but spell out chemical elements. Units of measure can be
abbreviated in the abstract. Please click on the following link for a list of abbreviations that can be used in the
remainder of the text and the running head: List of Abbreviations. Introduce all other abbreviations
parenthetically following the term both in the abstract (if used three times) and at first use of the term in the text.
24

Abbreviations must be used three times in the text (this includes table and figure legends) or the term must be
spelled out.

Units of measure. The metric system is standard, and SI units must be used as much as possible. Use
negative exponents to indicate units in the denominator when three or more units are used (e.g., µmol m-2 s-1
rather than µmol/m2/s).

Numbers and fractions. Write out numerals one through nine, except when used with units of measure. Write
out all numbers or fractions that begin a sentence, or rephrase the sentence to avoid beginning with a numeral.
Use the preposition "to" between numerals (do not use a dash): e.g., "13 to 22 min" and "3°C to 10°C."
Exceptions: in tables, figures, graphs, legends, and within parentheses in the text, dashes are used. Decimals
are preferred over fractions; however, when simple fractions are used, write them out as a hyphenated unit:
"two-thirds."

Statistical treatment. When appropriate, include statistical analysis. Define all statistical measures and models
clearly. Identify the number of independent replications of experimental treatments and the number of times
individual experiments were duplicated.

Solutions. Describe solutions of common acids and bases in terms of normality (N), e.g., 1 N NaOH, and those
of salts in terms of molarity (M). Express fractional concentrations by decimals: 0.1 N acetic acid (not N/10
acetic acid). Define % as (w/w), (w/v), or (v/v); 10% (w/v) signifies 10 g/100 mL. Express concentrations as
micrograms per gram (µg g-1) or micrograms per milliliter (µg mL-1) rather than as parts per million (ppm).

Ions. Represent ions as follows: Na+, Mn3+, Br-, PO43-.

Molecular weight and mass. Two equivalent expressions should be distinguished: "molecular weight" (Mr) is
the ratio of the mass of a molecule to 1/12 of the mass of carbon 12 and is, therefore, dimensionless. "Molecular
mass" (the mass of one molecule of a substance) is not a ratio and can be expressed in daltons (D). Say "the
molecular mass of X is 20,000 daltons" (20 kD) or "the molecular weight (Mr) is 20,000," but do not express Mr in
daltons. Expressions such as "the 20-kD peptide" and "the mass of a band on a gel is 240 kD" are acceptable
for an entity that is not a definable molecule.

Trade names and suppliers. Whenever possible, use the generic name of equipment, chemicals, or other
things used in research, followed by the trade name (capitalized) in parentheses with the name and location of
the manufacturer. Avoid the use of trade names and code numbers of experimental chemical compounds used
in research; rather, identify such compounds by common name (American Standards Association) if such a
name exists, or by chemical name and structural formula.

Materials and methods. This section should reference all standard procedures but must be complete enough
so that results can be verified by other laboratories.

For reports of experiments in which growth rooms were used to simulate the natural environment, growth room
conditions must be described according to the guidelines in Scientific Style and Format, Council of Biology
Editors, 1994, 6th Ed., pp.434–436. The following information must be provided:

• For plants grown under controlled or semi-controlled growth chamber conditions, the primary
parameters needed are the timing and levels of illumination (e.g., 16/8 hr photoperiod at 200 µmol m-2 s-
1
) and the temperature(s) at which the plants were grown.

• For plants grown in greenhouses, the major items needed are (1) the time of year that the plants were
grown, (2) whether any supplemental lighting was provided and, if so, its nature, and (3) details of any
temperature control.

• For both chamber and greenhouse conditions, the application of any fertilization regime, if present,
should also be given.
25

Literature cited. Cite all references in text by last names and year of publication. Grouped text citations should
be arranged from the earliest to most recent year, alphabetized by name within the same year. For entries in
"Literature Cited," alphabetize by first author's last name and follow the styles below exactly for capitalization,
punctuation, and order of elements. The accuracy in the "Literature Cited" section is the responsibility of
the authors. The Journal will only proofread references for format. Any mistakes in reference formats
may affect the conversion of html references.

Journal articles: Author AB, Author BB (1977) Title of article. Plant Physiol 59: 45–59

Book articles: Author AB, Author BB, Author CC (1974) Title of article. In A Smith, B Jones, eds, Title of
Book, Ed 2 Vol 3. Publisher, City, pp 14–19

Theses: Author BC (1974) Title of thesis. PhD thesis. University, City

Online: Author A (year of publication) Title. Source Title, http://www.utopia.com/talent/lpb/muddex/essay

Patent: Author B, Author BC, inventors. January 1, 1997. Endogenous nonstarch polysaccharide hydrolyzing
enzymes. European Patent Application No. XXX

No Authors or Editors: Title of Booklet, Pamphlet, etc. (1975) Publisher (or Company), City

If you are citing an article that only exists as an early online version, including the PubMed ID (PMID) number
will allow reviewers to link directly to the article. At the bottom of the PubMed record for the article, you will find
the PMID number which you should include in the reference as follows:

Author AB, Author BB (2006) Title of article. PMID: 16723506

Write out in full all one-word journal titles. Use the BIOSIS List of Serials for abbreviations of multiple-word
journal titles; write out in full the names of journals not listed there. Unpublished data (submitted articles and
articles in preparation) and personal communications are not acceptable as literature citations, so they must be
referred to parenthetically in the text. Please include initials and last names of all authors. Articles that are "in
press" may be so designated in "Literature Cited." Note: An article may be referred to as "in press" only if it has
been accepted for publication; cite the journal in which the article will appear. For personal communications, it is
the corresponding author's responsibility to ensure that those cited are aware of the citation and have approved
the content of the personal communication.

TABLES
1. Number tables consecutively with Roman numerals.

2. First mention of tables in the text must be in sequential order.

3. Provide each table with a short, concise title followed by a legend that will make the general meaning of the
table comprehensible without reference to the text.

4. Provide a descriptive heading for each column.

5. Do not separate data within the body of the table with new column headings or data. Do not arrange tables in
sections labeled as, e.g., A or B. Instead, create another table to express data unconnected to or separate from
that already presented. Authors will be contacted and asked to supply a new table if submitted in this form.

6. Use superscript lowercase letters to indicate footnotes. Asterisks or other symbols should not be used in
place of the letters and will be changed accordingly.

7. For all submitted tables, please use Word's "create table" feature, with no tabbed text or tables created with
spaces and drawn lines.

8. Do not use color, shading, or graphics in tables.


26

Numerals. Check both tabular data and numerical values reported in the text for the proper number of
significant figures. For decimals smaller than one, insert a zero before the decimal point: 0.349.

Powers. To avoid numbers with many digits, express such numbers as powers of 10. The unit may be changed
by the use of prefixes such as "m" or "µ." For example: enter "5" to express a g value of 0.005 under the
heading g × 10-3 or a g value of 5,000 under the heading g × 103; conversely, express a concentration of 0.0015
M as 1.5 under the heading "concn (mM)."

FIGURE PREPARATION
Figure preparation. Number figures consecutively according to the order in which they are called out in the
text. Manuscripts submitted with substandard figures will be delayed. To assist the editors and reviewers,
please also include the figure number in the figure image itself. Figures should be unambiguous and as
conceptual as possible and provide enough information so that the reader can understand them without
significant input from the text. For those figures that contain more than one panel, designate the panels with
capital letters (no parentheses and no periods following letters) in the upper left-hand corner. Whenever
possible, position panels vertically for one-column reproduction in the journal. For the best possible reproduction
of gel blots, submit combination figures in which the labels and photographs or autoradiographs are composite
images. Format the width of sequence data in the paper to one column.
27

RESPECT DE L'INTÉGRITÉ ACADÉMIQUE


Face à l’importance et à l’ampleur du phénomène de la tricherie et du plagiat dans les universités,
ici et à l’étranger, l’UQAM a amorcé, en janvier 2007, une démarche visant à promouvoir le respect
de l’intégrité académique. Dans ce contexte et inspirée d’une philosophie de « tolérance zéro », la
Commission des études de l’UQAM a modifié son Règlement sur les infractions de nature
académique (R. 18) à sa réunion du 2 décembre 2008.
Endossant cette philosophie de « tolérance zéro » relativement aux actes de plagiat, de fraude et de
tricherie, la Faculté des sciences de l’UQAM souhaite sensibiliser ses étudiants à l’importance du
respect de l’intégrité académique. Puisqu’en sollicitant son admission à l’UQAM, toute candidate,
tout candidat s’engage à suivre les politiques et règlements de l’Université, la Faculté souhaite
informer ses étudiants des différents articles de ce règlement, des actes répréhensibles et des
sanctions applicables. Un extrait de ces articles se trouve ci-dessous. Le Règlement complet et son
application à la Faculté des sciences sont disponibles à l’adresse Web suivante :
http://www.sciences.uqam.ca/decanat/reglements.php
Tous ces efforts visent à assurer la validité de la formation dispensée par la Faculté, ainsi qu’un
traitement équitable de tous afin de maintenir la qualité de ses diplômes.

Article 2 - Infractions de nature académique Article 3 - Sanctions


2.1 Infraction 3.1 L’attribution de la mention «P»
Tout acte de plagiat, fraude, copiage, tricherie, L'étudiante, l'étudiant qui commet une
falsification de document ou création d’un faux infraction est mis en probation et peut se voir
document commis par une candidate, un candidat, imposer une ou plusieurs sanctions. La mise
une étudiante, un étudiant de même que toute en probation génère l’attribution de la
participation à ces actes ou tentative de les mention «P» au dossier informatisé de
commettre, à l'occasion d'un examen, d'un travail l’étudiant, de l’étudiante. La mention «P»
ou d’un stage faisant l'objet d'une évaluation ou n'apparaît pas au relevé de notes de
dans toute autre circonstance, constitue une l'étudiante, l'étudiant mais figure en tout
infraction au sens de ce règlement. temps à son dossier.
2.2 Liste non limitative des infractions Lorsque la sanction est la suspension, une
Sans limiter la généralité de ce qui précède, mention à cet effet apparaîtra au relevé de
constitue notamment une infraction le fait de poser notes pour la durée de la suspension. Dans le
ou tenter de poser l'un des actes suivants ou le fait cas d’une expulsion définitive de l’Université,
d'y participer : une mention à cet effet apparaîtra de
a) la substitution de personnes ou l’usurpation manière permanente au relevé de notes.
d’identité;
b) le plagiat : l'utilisation totale ou partielle du texte 3.2 La mise en probation et autres
ou de la production d'autrui en le faisant passer sanctions
pour sien ou sans indication de référence; a) la mise en probation;
c) l'autoplagiat : le dépôt d'un travail pour fins La mise en probation constitue la
d'évaluation alors que ce travail constitue reconnaissance que l'étudiante, l'étudiant
essentiellement un travail qui a déjà été soumis a commis une infraction au présent
pour fins d'évaluation académique à l'Université règlement.
ou dans une autre institution d'enseignement, La mise en probation peut être imposée
sauf avec l'accord préalable de l'enseignante, sans autre sanction, auquel cas,
l'enseignant; l'enseignant, l'enseignante se voit inviter
à attribuer une notation à l'étudiante,
d) la possession ou l'obtention par vol, manœuvre l'étudiant pour le cours conformément au
ou corruption de questions ou de réponses
résultat obtenu pour les prestations
d'examen;
complétées. La mise en probation sans
e) la possession ou l'utilisation de tout document ou autre sanction signifie que la mention «P»
matériel non autorisé préalablement, pendant un est inscrite au dossier de l'étudiante,
examen ou lors de la réalisation de travaux, l'étudiant et que celle, celui qui en est
incluant le recours aux outils informatiques ou l'objet ne doit commettre aucune autre
moyens technologiques; infraction au présent règlement, à défaut
f) l'utilisation pendant un examen de la copie de quoi, l'une ou l'autre des sanctions
28

d'examen ou de tout autre matériel provenant suivantes lui sera imposée.


d'une autre personne; Outre la mise en probation, l’étudiante,
g) l'obtention de toute aide non autorisée, qu'elle l'étudiant peut se voir imposer une ou
soit collective ou individuelle; plusieurs des sanctions suivantes :
h) l'obtention d'une évaluation non méritée b) l'échec au cours ou à l'activité
notamment par corruption, chantage, créditée;
intimidation ou toute forme de harcèlement ou la c) l'obligation de réussir de trois à six
tentative d'obtenir une telle évaluation; crédits additionnels, hors programme, afin
i) la falsification d'un document ou la création d’un d'obtenir son grade, diplôme, certificat ou
faux document, notamment d'un document attestation; les cours doivent être
transmis à l'Université ou d'un document de identifiés;
l'Université transmis ou non à une tierce d) la suspension de toute activité à
personne, quelles que soient les circonstances; l'Université, pour une période maximale
j) la falsification de données de recherche dans un de neuf trimestres consécutifs;
travail, notamment une thèse, un mémoire, un e) son expulsion définitive de
mémoire-création, un rapport de stage ou un l'Université.
rapport de recherche.