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1) Preparación del agar superior

(a)Inoculación del Células (b) Inoculación del


agar superior con Fago
bacterianas agar superior con
células bacterianas suspensión
fago

Agar superior fundido


Agar superior fundido inoculado con
gérmenes

2) Metalizado y detección

(b) Placas fágicas


detectado el césped
bacteriano
Fago
(a) Vertido de planchas
la mezcla en un
nutriente placa Incubación
Césped de
de agar
bacteriano
células
Agar de fondo huéspedes

Figura 19-2 Procedimiento para la preparación de un césped bacteriano en la capa superior de agar en el que tiene
lugar la detección de colifage.

Toallitas de papel incubadora a 37°C

1. Una muestra de aguas residuales o agua que contenga coliformes será proporcionada por el
instructor.
2. Diluir la muestra 1: 10 y 1: 100 haciendo diluciones de 10 veces en Tris transfiriendo 1,0 ml a 9
ml de tampón Tris.
3. Derretir cuatro tubos de agar blando (tubo de 0,7% agar/3 ml) colocando en un recipiente de vapor
baño o autoclave. Colocar el agar en un baño de agua a 45-48°C y dejar enfriar 15 min para que
la temperatura del agar se ajuste a 45°C.
4. Al primer tubo añadir 1 ml de un cultivo de caldo en fase logarítmica de 𝐸. 𝑐𝑜𝑙𝑖 1 y 1ml de muestra
sin diluir. Retire el tubo del baño de agua y balancee suavemente entre las manos para mezclar la
suspensión durante 2 ó 3 segundos. Limpie el agua del tubo con una toalla de papel y vierta el
agar. Sobre la placa de Petri que contiene agar de fondo. Gire rápidamente la placa a esparcir el
agar superior. Asegúrese de que el agar cubra toda la superficie.
5. Repita el paso 4 utilizando 1 ml de bacterias y 1 ml de cada dilución de fago. Consulte la Figura
19-2.

______________________
1. E. coli cepa ATCC 15597 por lo general producirá el mayor número de placas de las aguas residuales. Una
colonia de E. coli ATCC 15597 se inocula en 3 ml de caldo de soja tripticasa y se incuba durante la noche a
35°C. Tres horas antes de la prueba de fagos, inocular 1 ml de este cultivo. En un frasco fresco que contenga
100 ml de caldo de soja con nutrientes o tripticasa y agitar. Baño de agua de 35°C a 37°C. Incubar durante 3
horas. Esto asegurará que las bacterias estén en la fase logarítmica de crecimiento.

Figura 19-3 Placas de Phage en un césped bacteriano. (Foto: cortesía de K.L. Josephson.)

6. Después de que el agar se haya solidificado, invertir las placas de Petri e incubar a 37°C durante
24 h. Quitar la humedad de la tapa de la placa de Petri. Si una gota de humedad cae sobre la placa
que hará que se extienda por el agar superficie.

Segundo Periodo
Materiales

placas de Petri incubadas del período 1

1. Cuente el número de placas en cada dilución (Figura 19-3) y calcule la concentración de fago en
su muestra original.
2. Registre cualquier diferencia importante en el tamaño o apariencia de las placas.

19.4. TRUCOS DEL OFICIO


HACER:
 Las bacterias deben estar en la fase de crecimiento logarítmico para que la placa fágica sea óptima
formación. Esto significa que una nueva cultura debe ser cultivada bajo una un conjunto definido
de condiciones (temperatura, agitación o no agitación) cada una de ellas tiempo.
 Asegúrese de agitar el tubo que contiene el agar de superposición para sacar el máximo partido
del tubo lo más posible.

NO LO HAGA:

 No permita que las bacterias y los fagos se coloquen demasiado tiempo en el baño de agua (no
más de 1-2 minutos) o los matará el calor.
 No permita que el agar fundido se fije en el baño de agua a 45°C por más tiempo de 1 a 2 horas a
medida que el agua se evapora causando la formación de grumos de agar.

19.5. PELIGROS POTENCIALES


HACER:

 Recuerde que, si está manipulando aguas residuales, éstas pueden contener patógenos. Manejar
con cuidado.

19.6. PREGUNTAS Y PROBLEMAS


1. ¿Cuáles son algunos de los factores que podrían determinar el tamaño de la placa?

2. ¿Por qué utilizamos bacterias en la fase logarítmica de crecimiento para este ensayo?

3. ¿Cuáles son algunas de las fuentes de colifago en el medio ambiente?

4. ¿Por qué son los indicadores potenciales de coliphage?

5. ¿Cómo se produce una placa en un césped bacteriano?

19.7. REFERENCIAS
Bitton, G. (1998) Wastewater Microbiology, 2° edición, Wiley-Liss, Nueva York.

Goyal, S.M., Gerba, C.P., y Bitton, G. (1987) Phage Ecology. John Wiley & Sons, Nueva York.

IAWPRC Study Group (1991) Los bacteriófagos como virus modelo en el agua control de calidad. Water
Research 5, 529-546.