BIOLOGIA MOLECULAR II

Actividad 2

Unidad3
Ingenieria en biotecnología

ADOLFO MENESES RESENDIZ

Matrícula: ES1611311063
 La transformación y la selección de bacterias son pasos clave en la clonación de ADN. La clonación
de ADN es el proceso de hacer muchas copias de un fragmento de ADN específico, como un gen.
Con frecuencia, las copias se hacen en bacterias.
En un experimento de clonación típico, los investigadores primero insertan un fragmento de ADN
específico, como un gen, en otro fragmento circular de ADN llamado plásmido. Este paso
usa enzimas de restricción y ADN ligasa, y se llama ligación.
Después de una ligación, el siguiente paso es transferir el ADN a las bacterias en un proceso
llamado transformación. Luego, podemos utilizar una selección con antibióticos y métodos de
análisis de ADN para identificar las bacterias que contienen el plásmido que estamos buscando.
Los pasos de la transformación y la selección bacteriana

Este es un procedimiento típico para la transformación y selección de bacterias:

1. Bacterias preparadas especialmente se mezclan con ADN (de una ligación, por ejemplo).
2. Se aplica un choque de calor a las bacterias que las "convence" de recolectar el plásmido. La
mayoría de las bacterias no recolecta plásmido, pero algunas sí lo hacen.
3. Los plásmidos que se usan en la clonación contienen un gen de resistencia a antibióticos. Por lo
tanto, todas las bacterias se colocan en una placa con antibióticos para seleccionar las que
recolectaron plásmido.
4. Las bacterias sin plásmido mueren. Cada bacteria conplásmido da lugar a una comunidad de
bacterias idénticas que contiene el plásmido llamada colonia. Una colonia típica se ve como un
pequeño punto blanquecino del tamaño de una cabeza de alfiler.
5. Varias colonias se analizan para identificar una con el plásmido adecuado.
6. Una colonia que contenga el plásmido adecuado se deja crecer a mayor escala y se utiliza para
producir proteína o plásmido.
1. Bacterias preparadas especialmente se mezclan con ADN (de una ligación, por ejemplo).
2. Se aplica un choque de calor a las bacterias lo que provoca que algunas recolecten el plásmido.

3. Los plásmidos que se usan en la clonación contienen un gen de resistencia a antibióticos. Por lo
tanto, todas las bacterias se colocan en una placa con antibióticos para seleccionar las que
recolectaron plásmido.

Diagrama de un plásmido. El plásmido contiene un gen de resistencia a antibióticos, un promotor

para estimular la expresión génica en las bacterias y el gen blanco que se insertó durante la
ligación.
4. Las bacterias sin plásmido mueren. Cada bacteria con plásmido da lugar a una colonia o
comunidad de bacterias idénticas que contiene el plásmido.
5. Varias colonias se analizan para identificar una con el plásmido adecuado (por PCR o con enzimas
de restricción, por ejemplo).
6. Una colonia que contenga el plásmido adecuado se deja crecer a mayor escala y se utiliza para
producir proteína o plásmido.

¿Por qué necesitamos analizar las colonias?

Todas las bacterias que forman colonias deberían contener un plásmido (que proporciona
resistencia a los antibióticos). Sin embargo, no necesariamente es el caso que todas las colonias
que contienen plásmidos tendrán el mismoplásmido.
¿Cómo es que pasa eso? Al cortar y pegar ADN, es posible la formación de productos secundarios
además del plásmido que se pretende construir. Por ejemplo, al tratar de insertar un gen en un
plásmido con una enzima de restricción en particular, puede haber casos donde el plásmido se
cierra en su forma original (sin incorporar el gen) o casos donde el gen está en dirección inversa.
 Izquierda: el gen entra al plásmido en sentido hacia adelante (apuntando en la misma dirección
que la secuencia del promotor). Este es el plásmido deseado de la ligación.

Centro: el plásmido se cierra sin incorporar el gen. Este no es un plásmido útil.

Derecha: el gen entra al plásmido en sentido inverso (apuntando hacia la secuencia del promotor).
Este no es un plásmido útil si queremos expresar el gen en bacterias.

Materiales para comenzar:

 Gen blanco digesto en ambos extremos con una enzima de restricción particular.
 Plásmido cortado con la misma enzima de restricción en un sitio después de un promotor para la
expresión bacteriana. El promotor "apunta" hacia la derecha, lo que significa que impulsará la
transcripción de la secuencia de ADN que se encuentra a la derecha.

Lo que queremos conseguir es:

 Un plásmido recombinante donde se inserta el gen blanco después del promotor, apuntando en la
dirección hacia adelante (orientada por lo que se transcribe para hacer un ARNm que especifica la
proteína deseada).
Izquierda: el gen entra al plásmido en sentido hacia adelante (apuntando en la misma dirección
que la secuencia del promotor). Este es el plásmido deseado de la ligación.

Centro: el plásmido se cierra sin incorporar el gen. Este no es un plásmido útil.

Derecha: el gen entra al plásmido en sentido inverso (apuntando hacia la secuencia del promotor).
Este no es un plásmido útil si queremos expresar el gen en bacterias.
¿Qué importa si un gen entra al revés en el plásmido? En algunos casos, no importa. Sin embargo,
si queremos expresar el gen en las bacterias para producir una proteína, el gen debe apuntar en la
dirección correcta en relación con el promotor, o la secuencia control que induce la expresión
génica. Si el gen estuviera al revés, se transcribiría la cadena equivocada de ADN y no se produciría
ninguna proteína.
Debido a estas posibilidades, es importante recolectar ADN plasmídico de cada colonia y
comprobar si coincide con el plásmido que intentábamos construir. Para analizar el ADN
plasmídico de colonias bacterianas, se utiliza digestión con enzimas de
restricción, PCR y secuenciación de ADN.
Producción de proteínas en bacterias
Supongamos que identificamos una colonia con un plásmido "bueno". ¿Qué sigue? ¿Qué sentido
tiene transformar, seleccionar y analizar?
En algunos casos, las bacterias simplemente se utilizan como "fábricas de plásmido" para hacer
una gran cantidad de ADN plasmídico. El ADN plasmídico se puede utilizar en pasos posteriores de
clonación de ADN (por ejemplo, para construir plásmidos más complejos) o en diversos tipos de
experimentos.
En algunos casos, los plásmidos tienen aplicaciones prácticas directas. Por ejemplo, recientemente
en un ensayo clínico de terapia génica para pacientes con el trastorno genético fibrosis quística, se
utilizaron plásmidos para administrar un gen humano en tejido pulmonar.
En otros casos, las bacterias se pueden utilizar como fábricas de proteínas. Si un plásmido contiene
las secuencias de control adecuadas, se puede inducir a las bacterias a expresar el gen que
contienen al agregar una señal química. La expresión del gen conduce a la producción de ARNm
que se traduce en proteína. Luego, las bacterias pueden lisarse (reventarse) para liberar la
proteína.
La colonia elegida crece en un cultivo grande. Se induce la expresión del gen blanco en las
bacterias de ese cultivo mediante la adición de una señal química al medio de cultivo. Dentro de
cada bacteria, el gen blanco se transcribe en ARNm y el ARNm se traduce en proteína. La proteína
codificada por el gen blanco se acumula dentro de las bacterias.
Las bacterias contienen muchas proteínas y macromoléculas. Debido a esto, la proteína recién
hecha se debe purificar antes de poder utilizarla. Hay una variedad de técnicas diferentes que se
usan para purificar proteínas.

Las células que fabricaron proteína se revientan (lisan) y liberan la proteína y otros contenidos
celulares. Las moléculas extraídas de las células se aplican a una columna que contiene anticuerpos
específicos para la proteína blanco. Así, la columna retiene la proteína y deja pasar las demás
moléculas de la bacteria. En el último paso, después de que todas las proteínas que no nos
interesan se han lavado, las proteínas blanco se liberan de los anticuerpos de la columna y se
recolecta la proteína pura para su uso.
En una técnica llamada cromatografía de afinidad, una mezcla de moléculas extraídas de las
bacterias lisadas fluye a través de una columna, un cilindro que contiene perlas. Las perlas están
recubiertas con un anticuerpo, una proteína del sistema inmunitario que se une específicamente a
una molécula blanco.
Referencias
Amgen Biotech Experience. (2015). Guía para el estudiante. Consultado
en https://www.amgenbiotechexperience.com/sites/abe.edc.org/files/abe_english_student_all_s
equences_05,15.15.pdf
Bacterial transformation: The heat shock method. (Transformación bacteriana: el método de
choque de calor; 2016). En Base de datos educativa de ciencias JoVE. Consultado
en http://www.jove.com/science-education/5059/bacterial-transformation-the-heat-shock-
method.
Gene therapy breakthrough for cystic fibrosis. (Un gran avance en la terapia génica para fibrosis
quística; 3 de julio de 2015). En NHS choices. Consultado
en http://www.nhs.uk/news/2015/07July/Pages/Gene-therapy-breakthrough-for-cystic-
fibrosis.aspx.
Reece, J. B., Urry, L. A., Cain, M. L., Wasserman, S. A., Minorsky, P. V. y Jackson, R. B. (2011). DNA
tools and biotechnology (El ADN como herramienta y la biotecnología). En Campbell biology (10°
ed., págs. 408-435). San Francisco, CA: Pearson.
Wilkin, D. (23 de marzo de 2016). Gene cloning - advanced (Clonación génica avanzada). En CK-12:
conceptos avanzados de biología. Consultado en http://www.ck12.org/book/CK-12-Biology-
Advanced-Concepts/section/9,2/.