Universidad Mayor de San simón

Facultad de Cs. Farmacéuticas y Bioquímicas

IDENTIFICACION MICROBIOLOGICA, MOLECULAR, SEROLOGÍA DE Streptococcus

pneumonaiae y DETERMINACION DE LA SUSCEPTIBILIDAD A PENICILINA Y
ERITROMICINA
EN LA CIUDAD DE COCHABAMBA

 Zulema Bustamante García

 Fátima Funes Espinoza
 Jenny Zamora Balderrama

RESUMEN

El Streptococcus pneumonaiae es patógeno causante de infecciones respiratorias e

inversas, es importante identificar y determinar la susceptibilidad a los antibióticos
utilizados, para realizar las terapias adecuadas. Se identifico de 32 aislamientos de
Streptococcus pneumonaiae a partir de pacientes con infecciones respiratorias e invasivas,
utilizando métodos microbiológicos convencionales y como pruebas confirmatorias
métodos moleculares por reacción en cadena de polimerasa (PCR) ampliando regiones de
los genes lyt A y ply y métodos serológicos para la determinación de antígeno capsular. Se
realizaron antibiogramas para determinar la susceptibilidad de penicilina y Eritromicina.
Resultados revelaron un mayor numero de aislamiento en menores de 10 años y en
mayores de 40 años, en relación a épocas estacionales un mayor número de aislamiento
durante invierno. En pruebas de Susceptibilidad se encontró una sensibilidad disminuida de
Penicilina (SDP) 46,88%, resistencia a Eritromicina 6,25% y resistencia intermedia 15,63%.
Realizando análisis estadístico se observó una correlación baja, por lo que la prueba de la
optoquina es inferior a las pruebas serológicas y molecular.

INTRODUCCION.

Los neumococos, Streptococcus pneumonaiae son diplococos gran positivos por que llevan
una capsula de polisacáridos que permiten su identificación y serotipificacion. Son
habitantes normales de las vías respiratorias superiores en 5 a 40% de los humanos y son
causantes de neumonías, sinusitis, otitis, bronquitis, meningitis y otros procesos infecciosos
del tracto respiratorio.

El neumococo es uno de los primeros agentes causales de neumonías bacterianas y de

otitis aguda en el mundo. La neumonía neumocócica es responsable del 10 a 25% de todas
las neumonías, con una tasa de mortalidad mundial de mas de 1 millón de deseos anuales
en menores de 5 años y en otros mayores de 65años.

Los métodos para la identificación incluyen pruebas microbiológicas como la optoquina,

pero en la actualidad se utilizan otros como la determinación del antígeno (método
serológico) o métodos moleculares como la determinación de genes de virulencia como lyt
A y ply utilizando la reacción de la polimerasa (PCR).

El tratamiento de neumonías se utiliza B-lactámicos como Penicilina y macrólidos como

Eritromicina. Pero en los últimos años se encontraron un incremente de resistencia a los
antibióticos utilizados para Streptococcus pneumonaiae. Por eso se realizaron

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investigaciones sobre este microorganismo implementando nuevos métodos como el

molecular y serológico para una identificación. También se determina la susceptibilidad a
los antibióticos utilizados para las infecciones causadas por el mismo, debido a q en nuestra
región se hace uso indiscriminado de antibióticos, por automedicación y prescripción
médica sin análisis de susceptibilidad con fracasos terapéuticos. Es importante que la
identificación se realice con técnicas de alta sensibilidad, especificidad y estabilidad.

El objetivo del trabajo es identificar las características moleculares y serológicas del

Streptococcus pneumonaiae y su susceptibilidad a penicilina y eritromicina en
Cochabamba.

MATERIALES Y MÉTODOS

Se trabajó con 32 aislamientos de Streptococcus pneumoniae, a partir de pacientes con

infecciones respiratorias.

19 Remitidos:

Laboratorios del Instituto

Gastroenterológico Boliviano
Japonés.
Escuela Técnica de Salud
Hospital Albina Patiño
Seguro Social Universitario
Hospital Elizabeth SETON

8 Laboratorio asistencial de la A partir de 40 muestras

Facultad de Bioquímica y
Farmacia de la Universidad
Mayor de San Simón.
clínicas de pacientes
con diagnóstico de
Neumonía
hospitalizados en el
Complejo Hospitalario
Viedma.

5 Escuela Técnica de Salud e A partir de 103 muestras

Instituto Gastroenterológico clínicas con Diagnostico
presuntivo de
tuberculosis pulmonar y
BARR negativo.

32 TOTAL

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Métodos microbiológicos

Para una identificación microbiológica se realizó:

 Cultivo en medio Agar Sangre

 Tinción de Gram
 Reacción negativa a la Catalasa de la colonia sospechosa
 Prueba de la optoquina.

Susceptibilidad a penicilina y eritromicina

Se realizó un antibiograma, siguiendo el “Método de Kirby Bauer”

SDP
Nombre Antibiótico Disco Halo de inhibición
Oxacilina 1µg < 19mm
Eritromicina 15µg ≤ 15mm
Resistencia intermedia 16-20 mm

Métodos moleculares de confirmación

Se realizó la extracción del ADN. Los cebadores utilizados fueron:

- Lyt A amplifica la región q codifica para la autolisina y genera un producto de

amplificación de 308 pb.
- Ply amplifica una región del gen de la pneumolisina de329pb.

Los productos obtenidos fueron revelados por electroforesis en gel de agarosa al 1,2% y
con bromuro de etidio 0,5 µg/ml.

Métodos serológicos

Para determinar la presencia del antígeno capsular, se utilizó el test BBL

PNEUMOSLIDETM.

Comparación de métodos para reconfirmación de Streptococcus pneumoniae

Con el fin de evaluar los tres métodos con fines de recombinación se trabajó con 27 de los
32 aislamientos iniciales.

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Análisis estadístico

Con el programa SPSS, utilizando la prueba de chi-cuadrado de bondad de ajuste para el

número de muestras.
Para establecer la diferencia de susceptibilidad a los antibióticos se utilizó el test de
proporción.
Para comparar los métodos por su reproducibilidad con fines de reconfirmación, se realizó
una valoración de sensibilidad y especificidad de la prueba molecular y la prueba
serológica frente a la prueba de la optoquina.

RESULTADOS

IDENTIFICION MICROBIOLOGICA Y MOLECULAR DE AISLAMIENTO DE

STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE

Se trabajó con un total de 32 aislamientos de streptococcus pneumoniae, identificados por

la prueba de la optoquina y confirmados por reacción en cadena de la polimerasa PCR.

Se observó que existe un mayor número de aislamiento de streptococcus pneumoniae en

niños menores de 10 años y adultos mayores a 49 años.

SUSCEPTIBILIDAD A LA PENICILINA

De 17 aislamientos el 53,13% de las muestras fueron sensibles a la penicilina.

De 15 aislamientos presentaron sensibilidad disminuida a la penicilina.

SUSCEPTIBILIDAD A LA ERITROMICINA

De 25 aislamientos el 78,13% presentaron sensibilidad a la eritromicina.

De 5 aislamientos el 15,63% tubo sensibilidad intermedia.

De 2 aislamientos el 6,25% fueron resistentes.

COMPARACION DE LA REPRODUCIBILIDAD DE LOS METODOS CON FINES DE

CONFIRMACION DE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE.

SE CONSERVARON las cepas aisladas en el medio de conservación SKIM MIIK a -20 °C,
así mismo se conservó el material genético de cada cepa.

Se realizaron subcultivos. Para esto se trabajó con 27 de las cepas aisladas. Se repitieron
las pruebas aoptoquina y las pruebas serologicas.

En la prueba de optoquina de 21 aislamientos el 77,78% tuvieron sensibilidad a la optoquina

y de 6 aislamientos el 22,22% fueron resistentes.

En la serología de 27 muestras, 26 fueron positivas y una negativa

En la prueba molecular las 27 muestras fueron positivas.

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DISCUSION Y CONCLUSIONES

Durante el periodo de estudio se trabajó con muestras clínicas, obteniéndose 32

aislamientos de Streptococcus pneumoniae. Respecto a grupos etáreos dos grupos fueron
afectados por esta bacteria, niños menores de 10 años y adultos mayores a 49 años; entre
las cuales se presentó un grupo minoritario de 20-25 años: sin embargo, en este grupo el
Streptococcus se comporta como un patógeno oportunista ya que dos de ellos eran VIH+ y
uno padecía lupus eritematoso.

En relación al número de aislamientos obtenidos se observó en los meses de invierno,

según SEDES (2008) reporta mayor frecuencia de infecciones respiratorias y neumonías,
por tanto, aumenta la posibilidad de que el neumococo se encuentre circulando en la
población.

El test de susceptibilidad a penicilina, mostro una sensibilidad de 53 %; La prueba de

susceptibilidad a eritromicina, el 78.13% mostro sensibilidad, 6.25% resistencia. Ambos
resultados obtenidos en este estudio, son datos similares a las que proporciono INLASA
(2005). Por tanto, se dice que todavía existe una buena sensibilidad a la eritromicina en
relación a la penicilina en nuestro país.

La evaluación estadística de valoración de sensibilidad y especificidad para comparar la

reproducibilidad de los métodos de identificación microbiológica, serológica y molecular,
muestra que el método microbiológico de identificación de la optoquina revela un aumento
de resistencia a la optoquina del 22.22% en subcultivos sucesivos de neumococo, con una
sensibilidad de 77.78% debido a diversos factores como algunas mutaciones a nivel del
gen atp C.

La prueba serológica de aglutinación de BBLTM pneumolise, reporto 96,30% positivo y 3,7%

negativo. La prueba molecular dio 100% positividad en los subcultivos. Indica claramente
que los métodos permiten reconocer características genéticas d las bacterias no reveladas
por las técnicas convencionales.

Con el fin de asegurar la especificidad de este método se están implementando la detección

de este microorganismo, ya se reportaron varios trabajos utilizando la PCR en tiempo real,
basada en la identificación de los genes lyt A y ply.

Esta investigación nos permite concluir que Streptococcus pneumoniae causante de

infecciones respiratorias agudas y de neumonías con mayor frecuencia en niños menores
a 10 años y mayores de 49 años durante los meses de invierno. Se observo un alto
porcentaje de susceptibilidad disminuida a la penicilina y en menor porcentaje a la
eritromicina.

En relación a la reproducibilidad de los tres métodos con el fin de reconfirmación, la técnica

microbiológica no es una técnica reproducible recomendando, el uso de las pruebas
moleculares y serológica, por presentar mayor sensibilidad y especificidad

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