ASPECTOS

HISTÓRICOS DE LA
BIOTECNOLOGÍA

Prof. Víctor Vásquez Villalobos, Dr. Ing.

AVANCES HISTÓRICOS DE
BIOLOGÍA MOLECULAR
Deleción: la pérdida de un segmento
1941 Genes codifican las proteínas
cromosómico sin que se altere el número de los
1944 Prueba que el ADN porta la información genética
1953 Determinación de HindIIImismos. del ADN y de la Insulina
estructura
1956 Enfermedad monogénica sustitución de un aa cadena β-hemoglobina
This is a restriction enzyme
1961 Código Genético, ARN mensajero, regulación génica
which recognizes
1967 Wise y Richardson theligasa
aislaron ADN base
1970 Smithsequence
y colegas aislaron
"AAGCTT" y caracterizaron
and cuts la Hind III
1972 Janet Mertz y Ron Davis cortaron y pegaron mol de ADN
between the two A's on each
1973 Stanley Cohen y H. Boyer pusieron ADNr en bacterias
1974 Demostración directa strand.
de delección génica humana
1975 Southern Blotting
1976 Proto-oncogenes
1977 Fred Sanger secuenció el virus de ADN Ф X174
1978 Biblioteca génica humana
1979 RFPL para diagnóstico prenatal, oncogenes celulares
 AVANCES HISTÓRICOS DE
BIOLOGÍA MOLECULAR
1979-81 genes humanos clonados y secuenciados
1982 Tabaco, la primera planta modificada genéticamente
1983 Kary Mullis concibe el PCR / Fred Sanger y colegas
publican la secuencia del λ lambda
1985 Un “gen de enfermedad” aislado por clonación posicional
1986 La secuenciación del ADN es automatizada
1987 Inicia el Proyecto del Genoma Humano
1995 Es secuenciado la bacteria Haemophillus influenzae
1996 Es secuenciada la levadura Saccharomyces cerevisiae
1998 Es secuenciado el nemátodo Caenorhabditis elegans
1999 Es secuenciado el cromosoma 22 humano
2000 Es secuenciada la mosca de la fruta D. melanogaster /
26 de junio se presenta 90% borrador genoma humano
2001 Feb 2001 se completa el genoma humano.
 El método de rotura de Sanger solo puede utilizarse para
secuencias de 200 a 400 nucleótidos

Southern Blotting (Edwin Southern, Oxford, 1975)

Mejora radical de la electrofóresis de gel del DNA

Técnica de biología molecular que permite detectar de

secuencias específicas de DNA en una mezcla compleja de
ácido nucleico, mediante el uso de electroforesis en gel de
agarosa y de hibridación utilizando sondas especificas.
Análisis de DNA por electrofóresis en gel y Southern Blotting
Se muestra la dotación genética (azul) de un individuo homocigoto (A) y uno
heterocigoto (B) para un marcador; tras hibridarse con una sonda específica
(rosa) se observa el resultado del Southern a la derecha
Aplicaciones de la electroforesis

Pueden analizarse las proteínas contenidas en diferentes

líquidos biológicos como alimentos, especialmente lácteos y
cereales.

Este tipo de análisis electroforético tiene aplicaciones en

investigación clínica, tanto humana como animal. Además es
una técnica muy empleada para el análisis de proteínas
alimentarias y últimamente se empleando para realizar
genotipado y detección de OMG (organismos modificados
genéticamente)
En honor a Ed Southern, otros blot parecidos recibieron el
nombre en otros puntos cardinales:

• Southern Blotting: transfiere DNA a l nitrocelulosa

• Northen Blotting: transfiere RNA
• Western Blotting ó inmunoblot: transfiere proteína a un gel
de poliacrilamida con SDS a nitrocelulosa y la proteína
buscada se revela con anticuerpos marcados o mediante otras
pruebas de proteínas.
 SECUENCIACIÓN AUTOMÁTICA DE DNA

Electroforesis capilar, en solo 4 horas se

pueden analizar 40,000 nucleótidos con 96
capilares.

Secuencianción automática de
DNA con elevado rendimiento
(high throughput sequencing)
 MAPAS GENÓMICOS GENÉTICOS

En 1994 se alcanzó el objetivo del proyecto del Genoma Humano de

elaborar un mapa genético con un marcador por cada millón de
pares de bases.

Dos años después se había depurado el mapa tenía un marcador por

cada 600,000 bp, utilizando 5254 microsatélites o STR (Short
Tandem Repets), breves sucesiones repetidas de las bases C-A-C-A-
C-A. Este DNA en tándem aparece en todos los cromosomas. Se
puede calcular su cantidad en un lugar del gen por PCR.

Otros marcadores son RFLP y SNP.

 El método STR tiene un poder de discriminación de un
hombre entre cada 5,180'000,000 individuos.
Es importante notar que si la población mundial actual es de
unos seis mil millones de personas, y si se supone que de ellos
poco menos de la mitad son hombres y que de ellos sólo una
fracción es una subpoblación masculina en edad fértil, pues
entonces el poder de discriminación es prácticamente
absoluto.
Omics Technologies
Foods are digested, absorbed and distributed in the body.
Food stuffs contain macronutrients (carbohydrates, lipids
and proteins) and micronutrients (vitamins, minerals, trace
elements).

These nutrients induce changes at RNA, protein and

metabolite level in the receiving cell or organism.

The corresponding profiling technologies, namely

transcriptomics (gene expression analysis), proteomics
(protein expression analysis) and metabolomics (metabolite
profiling) are applied to better understand and assess these
effects in a holistic fashion.
PROTEÓMICA

SDS: detergente aniónico (tensoactivo)

Principio del PAGE-SDS

NUTRIGENÓMICA Y CANCER
VANESSA ALMENDRO(1) Y PERE GASCÓN (2)
(1) Laboratorio de Oncología Médica.
(2) Servicio de Oncología Médica, Instituto Clínico de Enfermedades Hemato-Oncológicas.
Hospital Clínic. Barcelona (España).
Electroforesis en gel bidimensional (2D-GE)

Imagen de geles en 2D. Se pueden ver las

manchas diferenciadas en color azul y
naranja. Debido a las notorias diferencias,
las manchas no se superponen
 MALDI: gas de iones de proteínas

Los espectrómetros de masas (MS) se desarrollaron para detectar

átomos ionizados de elevada sensibilidad.

Se usan también para analizar pequeñas moléculas inorgánicas y

orgánicas.

Después se ha analizado análisis por MS de proteínas y DNA,

separándose individualmente de su entorno acuoso, trasladándolas
al vacío y dotándolas de una carga sin romperlas. Esto se hizo con
MATRIX-ASSISTED LASER DESORPTION IONIZATION
(MALDI), desarrollado por Franz Hillemkamp y su equipo en la
Universidad de Münster (1980).
Tecnología del ADN (Diagnóstico
Molecular) PCR - REACCIÓN EN
CADENA DE LA POLIMERASA

El PCR utiliza la capacidad de las

Enzimas polimerasas que catalizan la
formación y reparación de ADN (y ARN),
mediante un mecanismo que permite
iniciar y parar su actividad en un punto
específico de una hebra de ADN, para lo cual se
emplean polimerasas obtenidas de
arqueobacterias como Termophillus aquaticus que
resisten temperaturas arriba de los 100°C.
Kary B. Mullis, de Cetus Corporation que concibió
el mecanismo del PCR, en la década de los 80,s
recibió el Premio Nobel en 1993.
Amplificación exponencial

1º ciclo
2 moléculas
DNA doble 2º ciclo
cadena 4 moléculas 3º ciclo
DNA doble 8 moléculas
cadena DNA doble cadena
 Etapas en una PCR
Hay 3 etapas básicas en una PCR:

1. Desnaturalización del DNA (~ 94º C) por 1 min.

2. Apareamiento (Annealing) (Tm primers – 5º C) por 30 seg.
3. Extensión (72º C) 1 min/kb a amplificar.

1- 5 min a 94º
1
1 min a 94º
3 30 seg a Tm – 5º x 35 ciclos
1 min/kb a 72º
2
10 min a 72º

Generalmente se agrega un paso inicial a 94º C por 1 a 5 minutos, y un

paso final a 72º C por 5-10 minutos.
Genética del cáncer

Crecimiento incontrolado clon celular -> Metástasis. Selección natural entre

células somáticas de un organismo que escapan al control del organismos

Tipos:

•Leucemia (glóbulos blancos)

•Linfoma (linfocitos)
•Sarcoma (mesodermo: huesos, músculos)
•Carcinoma (epitelio: piel, glándulas, mama)
85% cánceres

Teoría mutacional y teoría vírica -> Fusión:

Mutaciones somáticas
Genética del cáncer

Metástasis
Genética del cáncer
Causas genéticas

Tres tipos de genes:

• Oncogenes: promueven proliferación celular (protooncogén). Muy conservados

evolutivamente. Patrón autosómico dominante

• Genes supresores de tumores (TS): Inhiben la proliferación celular. Patrón autosómico

recesivo. (P53, el guardían del genoma – se expresa ante la falta de oxígeno, toxicidad
ambiental, daños DNA)

• Genes mutadores: genes que aumentan la tasa de mutación del conjunto del genoma

Metáfora del autobús

•Acelerador = protooncogén
•Freno = TS genes
•Saboteador = genes mutadores

• Causas ambientales
 Virus de influenza
 Existen tres tipos de virus: A, B y C
 El virus A se subdivide en grupos
dependiendo de 2 proteínas:
Hemaglutinina (H) y Neuromaminida (N)
 Existen 17 variedades H y 9 variedades N
 Los virus que circulan a nivel mundial:
H1N1, H1N2 y H3N2
 Imagen de microscopía
electrónica del virus H1N1
(80–120 nanómetros de
diámetro)
También denominado virus "H3N2v" ) con el gen matriz (M) del
virus H1N1.
Tipos de vacuna según su uso en humanos

• Influenza Estacional
– Trivalente:
• A(H1N1).
• A(H3N2).
• B
• Influenza Pandémica
– Monovalente:
• A(H1N1)
 The Development of Monoclonal
Antibodies

Mouse Chimeric Humanized Fully Human

100% ~34% ~10% 100%

Mouse Protein Mouse Protein Mouse Protein Human Protein

cetuximab panitumumab
(IgG1) (IgG2)

Yang XD, et al. Crit Rev Oncol Hematol 2001;38:17-23.

 Anticuerpos monoclonales en la cura del ebola
Se trata de una terapia con anticuerpos monoclonales desarrollados
por varios grupos de investigación - Mapp Biopharmaceutical,
Inc., LeafBio en San Diego, Defyrus Inc. de Toronto, el
gobierno de EE.UU. y la Agencia de Salud Pública de Canadá
- para el tratamiento del Ébola.

La droga se produce en Kentucky a partir de plantas de tabaco

transgénicas (genéticamente modificadas)

Zmapp implica un cóctel de anticuerpos monoclonales, que son

moléculas de laboratorio que imitan la respuesta inmunitaria del
cuerpo. Para crearlos, los científicos lo dieron a ratones con Ébola
y observaron la respuesta del sistema inmunológico del animal.
Después de identificar los anticuerpos en los ratones que lucharon
contra la enfermedad, crearon anticuerpos casi idénticos a partir de
plantas para su uso en seres humanos.
 El genoma viral tiene cuatro genes combinados que evitan que las
células dendríticas de la piel, la nariz, los pulmones y el aparato
digestivo envíen señales para activar las células del sistema inmunitario.
 Agroinfiltration
Schematic representation of how monoclonal antibodies are generally made from hybridomas. To make ZMapp, the
genes encoding for the antibodies were extracted from the hybridomas, genetically engineered to replace mouse
components with human components, and transfected into tobacco plants[1]
Favipiravir 5-fluoro-2-oxo-1H-pyrazine-3-carboxamide
Ébola: Crean nuevo mapa con
regiones de África en riesgo por
el virus (08.09.2014)
Simulating a global Ebola outbreak
Vacuna contra el ébola logra inmunizar a primates a largo plazo
Lunes, 08 de Setiembre 2014 | 7:24 am

En una primera fase del ensayo, los primates recibieron una dosis de la vacuna
basada en el vector adenoviral ChAd3, mientras que ocho semanas después se
les administró una segunda dosis de refuerzo con un vector distinto, basado en el
virus modificado Ankara (MVA).

esta combinación ha resultado la más efectiva hasta ahora en primates, si bien los
científicos subrayan que una única dosis de la vacuna ChAd3 es suficiente para
otorgar protección completa a corto plazo y una defensa parcial durante varios
meses.

Al tiempo que se investiga una vacuna contra el ébola, especialistas de la Agencia

de Salud Pública de Canadá ultiman los test en primates del fármaco experimental
ZMapp, que ha demostrado su eficacia para contrarrestar el virus hasta cinco días
después de la infección.
Tratamiento de la enfermedad
El elevado número de casos y la alta mortalidad del brote, llevó a
los expertos de la OMS a permitir el uso ético de tratamientos
experimentales. Entre los tratamientos experimentales destacan el
suero ZMapp, probado por primera vez en dos cooperantes
estadounidenses contagiados en Liberia, TKM-Ebola142 y
Brincidofovir. Otros estudios, como los que se están realizando en
España, tratan de bloquear la transmisión del virus con diferentes
métodos. También se está tratando a los enfermos con suero
sanguíneo con anticuerpos obtenido de supervivientes a la
infección, como el de la religiosa Paciencia Melgar, MIC.
Declining NAD+ Induces a Pseudohypoxic State Disrupting
Nuclear-Mitochondrial Communication during Aging
Cell, Volume 155, Issue 7, 19 December 2013, Pages 1624-1638

Ever since eukaryotes subsumed the bacterial ancestor of mitochondria, the nuclear
and mitochondrial genomes have had to closely coordinate their activities, as each
encode different subunits of the oxidative phosphorylation (OXPHOS) system.
Mitochondrial dysfunction is a hallmark of aging, but its causes are debated.
We show that, during aging, there is a specific loss of mitochondrial, but not
nuclear, encoded OXPHOS subunits. We trace the cause to an alternate PGC-1α/β-
independent pathway of nuclear-mitochondrial communication that is induced by a
decline in nuclear NAD+ and the accumulation of HIF-1α under normoxic
conditions, with parallels to Warburg reprogramming. Deleting SIRT1 accelerates
this process, whereas raising NAD+ levels in old mice restores mitochondrial
function to that of a young mouse in a SIRT1-dependent manner. Thus, a
pseudohypoxic state that disrupts PGC-1α/β-independent nuclear-mitochondrial
communication contributes to the decline in mitochondrial function with age,
a process that is apparently reversible.
ASPECTOS HISTÓRICOS DE
LA BIOTECNOLOGÍA