ENFERMEDADES TRATADAS CON TERAPIA

GENICA

La terapia génica consiste en la inserción de

elementos funcionales ausentes en
el genoma de un individuo. Se realiza en
las células y tejidos con el objetivo de tratar una
enfermedad o realizar un marcaje.
La técnica todavía está en desarrollo, motivo por
el cual su aplicación se lleva a cabo
principalmente dentro de ensayos
clínicos controlados, y para el tratamiento de
enfermedades severas o bien de tipo hereditario o adquirido.
Al principio se planteó sólo para el tratamiento de enfermedades genéticas, pero hoy en día
se plantea ya para casi cualquier enfermedad
Entre los criterios para elegir este tipo de terapia se encuentran:

• Enfermedad letal sin tratamiento.

• La causa sea un único gen que esté ya
clonado.
• La regulación del gen sea precisa y
conocida.

Aunque se han utilizado enfoques muy distintos,

en la mayoría de los estudios de terapia génica,
una copia del gen funcional se inserta en el
genoma para compensar el defectivo. Si ésta
copia simplemente se introduce en el huésped, se trata de terapia génica de adición. Si
tratamos, por medio de la recombinación homóloga, de eliminar la copia defectiva y
cambiarla por la funcional, se trata de terapia de sustitución.
Aunque se han utilizado enfoques muy distintos, en la mayoría de los estudios de terapia
génica, una copia del gen funcional se inserta en el genoma para compensar el defectivo. Si
ésta copia simplemente se introduce en el huésped, se trata de terapia génica de adición. Si
tratamos, por medio de la recombinación homóloga, de eliminar la copia defectiva y
cambiarla por la funcional, se trata de terapia de sustitución.
Actualmente, el tipo más común de vectores utilizados son los virus, que pueden ser
genéticamente alterados para dejar de ser patógenos y portar genes de otros organismos.
No obstante, existen otros tipos de vectores de origen no vírico que también han sido
utilizados para ello. Así mismo, el ADN puede ser introducido en el paciente mediante
métodos físicos (no biológicos) como electroporación, biobalística...
 Las células diana del paciente se infectan con el
vector (en el caso de que se trate de un virus) o se
transforman con el ADN a introducir. Este ADN, una
vez dentro de la célula huésped, se transcribe y
traduce a una proteína funcional, que va a realizar
su función, y, en teoría, a corregir el defecto que
causaba la enfermedad.
Tipos de terapia génica
• Terapia génica somática: se realiza sobre
las células somáticas de un individuo, por lo que las
modificaciones que implique la terapia sólo tienen
lugar en dicho paciente.

-Terapia in vivo: la transformación celular tiene lugar dentro del paciente al que se le
administra la terapia. Consiste en administrarle al paciente un gen a través de un vehículo
(por ejemplo, un virus), el cual debe localizar las células a infectar. El problema que presenta
esta técnica es que es muy difícil conseguir que un vector localice a un único tipo de células
diana.

-Terapia ex vivo: la transformación celular se lleva a cabo a partir de una biopsia del tejido del
paciente y luego se le trasplantan las células ya transformadas. Como ocurre fuera del cuerpo
del paciente, este tipo de terapia es mucho más fácil de llevar a cabo y permite un control
mayor de las células infectadas. Esta técnica está casi completamente reducida a células
hematopoyéticas pues son células cultivables,
constituyendo así un material trasplantable.

• Terapia génica germinal: se realizaría

sobre las células germinales del paciente,
por lo que los cambios generados por los
genes terapéuticos serían hereditarios. No
obstante, por cuestiones éticas y jurídicas,
esta clase de terapia génica no se lleva a
cabo hoy en día.

Aplicaciones
Marcaje génico: El marcaje génico tiene como
objetivo, no la curación del paciente, sino hacer
un seguimiento de las células, es decir, comprobar si en un determinado sitio del cuerpo
están presentes las células específicas que se han marcado.

• Terapia de enfermedades monogénicas hereditarias: Se usa en

aquellas enfermedades en las que no se puede realizar o no es eficiente la administración
de la proteína deficitaria. Se proporciona el gen defectivo o ausente.

• Terapia de enfermedades adquiridas: Entre este tipo de enfermedades la más destacada

es el cáncer. Se usan distintas estrategias, como la inserción de determinados genes
 suicidas en las células tumorales o la inserción de antígenos tumorales para potenciar
la respuesta inmune.

Vectores en terapia génica

La gran diversidad de situaciones en las que podría aplicarse la terapia génica hace
imposible la existencia de un solo tipo de vector adecuado. Sin embargo, pueden definirse
las siguientes características para un "vector ideal" y adaptarlas luego a situaciones
concretas:

• Que sea reproducible.

• Que sea estable.
• Que permita la inserción de material
genético sin límite de tamaño.
• Que permita la transducción tanto en
células en división como en aquellas que no
están proliferando.
• Que posibilite la integración del gen
terapéutico en un sitio específico del genoma.
• Que se integre una vez por célula, para
poder controlar la dosis.
• Que reconozca y actúe sobre células
específicas.
• Que la expresión del gen terapéutico pueda ser regulada.
• Que carezca de elementos que induzcan una respuesta inmune.
• Que pueda ser caracterizado completamente.
• Que sea inocuo o que sus posibles efectos secundarios sean mínimos.
• Que sea fácil de producir y almacenar.
• Que todo el proceso de su desarrollo tenga un coste razonable.
Los vectores van a contener los elementos que queramos introducir al paciente, que no van a
ser sólo los genes funcionales, sino también elementos necesarios para su expresión y
regulación, como pueden ser promotores, potenciadores o secuencias específicas que
permitan su control bajo ciertas condiciones.
Podemos distinguir dos categorías principales en vectores usados en terapia génica: virales y
no virales.
Virus
Todos los virus son capaces de introducir su material genético en
la célula huésped como parte de su ciclo de replicación. Gracias a
ello, pueden producir más copias de sí mismos, e infectar a otras
células.
Algunos tipos de virus insertan sus genes físicamente en
el genoma del huésped, otros pasan por varios orgánulos celulares
en su ciclo de infección y otros se replican directamente en el
citoplasma, por lo que en función de la terapia a realizar nos puede
interesar uno u otro.
Algo común a la mayoría de estrategias con virus es la necesidad
de usar líneas celulares "empaquetadoras" o virus helpers, que
porten los genes que les eliminamos a nuestros vectores y que
permiten la infección.
Retrovirus
El genoma de los retrovirus está constituido por ARN de cadena sencilla, en el cual se
distinguen tres zonas claramente definidas: una intermedia con genes estructurales, y dos
flanqueantes con genes y estructuras reguladoras. Cuando un retrovirus infecta a una célula
huésped, introduce su ARN junto con algunas enzimas que se encuentran en la matriz,
concretamente una proteasa, una transcriptasa inversa y una integrasa.
La acción de la retrotranscriptasa permite la síntesis del ADN genómico del virus a partir del
ARN. A continuación, la integrasa introduce este ADN en el genoma del huésped. A partir de
este punto, el virus puede permanecer latente o puede activar la replicación masivamente.
Para usar los retrovirus como vectores víricos para terapia génica inicialmente se eliminaron
los genes responsables de su replicación y se reemplazaron estas regiones por el gen a
introducir seguido de un gen marcador.
Adenovirus
Los adenovirus presentan un genoma de ADN bicatenario, y no
integran su genoma cuando infectan a la célula huésped, sino
que la molécula de ADN permanece libre en el núcleocelular y
se transcribe de forma independiente. Esto supone que el
efecto posicional o la mutagénesis por inserción no se dan en
estos vectores, lo cual no quiere decir que no tengan otros
inconvenientes. Además, debido al hecho de que en su ciclo
natural se introducen en el núcleo de la célula, pueden infectar
tanto células en división como células quiescentes.
A los vectores de primera generación se les eliminó parte del gen E1, básica para la
replicación, y a los de 2.ª, se les eliminaron otros genes tempranos en el ciclo del virus. En
ambos casos, cuando se realiza una infección con una concentración elevada de virus, se
produce la expresión de otros genes que provocan una respuesta inmune considerable.
Por ello, los últimos vectores basados en adenovirus prácticamente han sido desprovistos de
la mayor parte de sus genes, con la excepción de las regiones ITR (regiones repetidas de
forma invertida), y la zona necesaria para la encapsidación
Virus adenoasociados (VAA)
Los AAV son virus pequeños con un genoma de ADN monocatenario. Pueden integrarse
específicamente en el cromosoma 19 con una alta probabilidad. Sin embargo, el
VAA recombinante que se usa como vector y que no contiene ningún gen viral, solo el gen
terapéutico, no se integra en el genoma.
En su lugar, el genoma vírico
recombinante fusiona sus extremos a
través del ITR (repeticiones terminales
invertidas), apareciendo recombinación de
la forma circular y episomal que se
predice que pueden ser la causa de la
expresión génica a largo plazo.
Las desventajas de los sistemas basados
en AAV radican principalmente en la
limitación del tamaño de DNA
recombinante que podemos usar, que es muy poco, dado el tamaño del virus. También el
proceso de producción e infección resultan bastante complejos. No obstante, como se trata
de un virus no patógeno en la mayoría de los pacientes tratados no aparecen respuestas
inmunes para eliminar el virus ni las células con las que han sido tratados.
Herpes virus
Los herpesvirus son virus de ADN capaces de establecer latencia en sus células huésped. Son
complejos genéticamente hablando, pero para su uso como vectores tienen la ventaja de poder
incorporar fragmentos de DNA exógeno de gran tamaño (hasta unas 30 kb). Además, aunque
su ciclo lítico lo realizan en el lugar de infección, establecen
la latencia en neuronas, las cuales están implicadas en
numerosas enfermedades del sistema nervioso, y son por
ello dianas de gran interés.
Los vectores herpesvíricos puestos en marcha han usado
dos estrategias principales:
- La recombinación homóloga entre el genoma del virus
completo y el contenido en un plásmido que llevaba el transgén en la zona que codifica para
genes no esenciales en lo que se refiere a replicación e infección.
- El uso de vectores con orígenes de replicación del virus así como las correspondientes
secuencias de empaquetamiento, y su introducción en estirpes celulares bien coinfectadas
con virus silvestres o bien portadoras del resto de genes del mismo implicados en la
encapsidación y replicación, para permitir la formación de partículas virales recombinantes
con las que realizar el tratamiento.
No obstante, el uso de vectores basados en el HSV (virus del herpes simple), sólo puede
llevarse a cabo en pacientes que no hayan sido infectados previamente por él, pues pueden
presentar inmunidad.
Proteína “pseudotyping” de vectores reales
Los vectores virales descritos anteriormente tienen poblaciones naturales de células huésped
que ellos infectan de manera eficiente. Sin embargo, algunos tipos celulares no son sensibles
a la infección por estos virus.
La entrada del virus a la célula está mediada por
proteínas de su superficie externa (que pueden formar
parte de una cápside o de una membrana). Estas
proteínas interaccionan con receptores celulares que
pueden inducir cambios estructurales en el virus y
contribuir a su entrada en la célula por endocitosis.
En cualquier caso, la entrada en las células huésped
requiere una interacción favorable entre una proteína
de la superficie del virus, y una proteína de la superficie
de la célula. Según la finalidad de una determinada terapia génica, se podría limitar o
expandir el rango de células susceptibles a la infección por un vector. Por ello, se han
desarrollado vectores conocidos como "pseudotyped", en los cuales la cubierta vírica de
proteínas silvestre ha sido remplazada por péptidos de otros virus, o por proteínas
quiméricas, que constan de las partes de la proteína vírica necesarias para su incorporación
en el virión, así como las secuencias que supuestamente a interaccionar con receptores
específicos de proteínas celulares.
Métodos no virales
Estos métodos presentan ciertas ventajas sobre los métodos virales, tales como facilidades
de producción a gran escala y baja inmunogenicidad. Anteriormente, los bajos niveles de
transfección y expresión del gen mantenían a los métodos no virales en una situación menos
ventajosa; sin embargo, los recientes avances en la tecnología de vectores han producido
moléculas y técnicas de transfección con eficiencias similares a las de los virus.
ADN desnudo
Éste es el método más simple de la transfección no
viral. Consiste en la aplicación localizada de, por
ejemplo, un plásmido con ADN desnudo. Varios de
estos ensayos dieron resultados exitosos3. Sin
embargo, la expresión ha sido muy baja en
comparación con otros métodos de transformación.
Oligonucleótidos
El uso de oligonucleótidos sintéticos en la terapia génica tiene como objetivo la inactivación
de los genes implicados en el proceso de la enfermedad.
Existen varias estrategias para el tratamiento con oligonucleótidos
Una estrategia, la terapia "antisentido" utiliza oligonucleótidos con la secuencia
complementaria al RNAm del gen diana, lo que activa un mecanismo de silenciamiento
génico. También se puede usar para alterar la
transcripción del gen defectuoso, modificando
por ejemplo su patrón de edición de intrones y
exones.
También se hace uso de moléculas pequeñas
de RNAi para activar un mecanismo de
silenciamiento génico similar al de la terapia
antisentido
Otra posibilidad es utilizar
oligodesoxinucleótidos como un señuelo para
los factores que se requieren en la activación
de la transcripción de los genes diana. Los
factores de transcripción se unen a los
señuelos en lugar de al promotor del gen
defectuoso, lo que reduce expresión de los
genes diana. Además, oligonucleótidos de ADN monocatenario han sido utilizados para
dirigir el cambio de una única base dentro de la secuencia de un gen mutante.
Al igual que los métodos de ADN desnudo, requieren de técnicas de transformación para
introducirse en la célula.
Cromosomas artificiales
La creación de cromosomas humanos artificiales (HACs) estables es una de las posibilidades
que se baraja en la actualidad como una de las formas de
introducir ADN permanentemente en células somáticas para
el tratamiento de enfermedades mediante el uso de la
terapia génica. Presentan una elevada estabilidad, además
de permitir introducir grandes cantidades de información
genética.
Lipoplexes y poliplexes
El vector de ADN puede ser cubierto por lípidos formando una estructura organizada, como
una micela o un liposoma. Cuando la estructura organizada forma un complejo con el ADN
entonces se denomina lipoplexe.
Hay tres tipos de lípidos: aniónicos, neutros, o catiónicos. Inicialmente, lípidos aniónicos y
neutros eran utilizados en la construcción de lipoplexes para vectores sintéticos. Sin embargo,
estos son relativamente tóxicos, incompatibles con fluidos corporales y presentan la
posibilidad de adaptarse a permanecer en un tejido específico. Además, son complejos y
requieren tiempo para producirlos, por lo
que la atención se dirigió a las versiones
catiónicas. Éstos, debido a su carga
positiva, interaccionan con el ADN, que
presenta carga negativa, de tal forma
que facilita la encapsulación del ADN en
liposomas. Más tarde, se constató que el
uso de lípidos catiónicos mejoraba la
estabilidad de los lipoplexes. Además,
como resultado de su carga, los
liposomas catiónicos interactúan
también con la membrana celular, y se
cree que la endocitosis es la principal vía
por la que las células absorben los
lipoplexes.
Los endosomas se forman como resultado de la endocitosis. Sin embargo, si los genes no
pueden liberarse al citoplasma por rotura de la membrana del endosoma, los liposomas y el
ADN contenido serán destruidos. La eficiencia de ese "escape endosomal" en el caso de
liposomas constituidos solo por lípidos catiónicos es baja. Sin embargo, cuando “lípidos de
ayuda” (normalmente lípidos electroneutrales, tales como DOPE) son añadidos, la eficacia es
bastante mayor. Además, ciertos lípidos (lípidos fusogénicos) tienen la capacidad de
desestabilizar la membrana del endosoma. El uso de ciertos compuestos químicos, como
la cloroquina, permite al ADN exógeno escapar del lisosoma, si bien deben usarse con
precaución, ya que es tóxico y debe usarse en dosis pequeñas para no afectar a la célula
diana de transfección.
No obstante, los lípidos catiónicos presentan efectos tóxicos dependientes de dosis, lo que
limita la cantidad que de ellos se puede usar y por tanto la terapia en sí.
El uso más común de los lipoplexes es la transferencia de genes en células cancerosas,
donde los genes suministrados activan genes supresores del tumor en la célula y disminuyen
la actividad de los oncogenes.
Estudios recientes han mostrado que lipoplexes son
útiles en las células epiteliales del sistema respiratorio 4,
por lo que pueden ser utilizados para el tratamiento
genético de las enfermedades respiratorias como
la fibrosis quística.
Los complejos de polímeros de ADN se denominan
poliplexes y la mayoría consisten
en polímeros catiónicos, regulados por interacciones
iónicas.
Una gran diferencia entre los métodos de acción de
poliplexes y lipoplexes es que algunos poliplexes no
pueden liberar su ADN cargado al citoplasma, por lo
que requieren de la contransfección con agentes que
contribuyan a la liss del endosoma. Existen otros elementos formadores de poliplexes, como
el quitosano o la polietilamina, que si son capaces de liberarse del endosoma.
Métodos hibridos
Debido a las deficiencias de muchos de los sistemas de transferencia génica se han
desarrollado algunos métodos híbridos que combinan dos o más técnicas. Los virosomas son
un ejemplo, y combinan liposomas con el virus inactivado VIH o el virus de la gripe.
Dendrimeros
Un dendrímero es una macromolécula muy ramificada con forma esférica o variable. Su
superficie puede ser funcional de muchas formas y de ésta derivan muchas de sus
propiedades. Además, su tamaño, en la escala nano-
, permite su uso en biomedicina.
En particular, es posible construir un dendrímero
catiónico, es decir, con carga superficial positiva. De
esta forma, interacciona con el ácido nucleico,
cargado negativamente, y forma un complejo que
puede entrar por endocitosis en la célula. Esto es útil
en terapia génica, para introducir genes exógenos.
Los costes de producción son elevados, pero se
están desarrollando técnicas que permiten
abaratarlo, puesto que se trata de una técnica con
una toxicidad muy baja, y su principal desventaja es
a nivel productivo