UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ

INSTITUTO DE CIENCIAS BIOLOGICAS

FACULDADE DE BIOMEDICINA

THAIS REGINA CASTRO DA SILVA PACHECO

ANÁLISE FENOTÍPICA DE ISOLADOS AMBIENTAIS DO COMPLEXO

Cryptococcus neoformans/Cryptococcus gattii ORIUNDOS DO ESTADO
DO PARÁ, BRASIL

BELÉM-PA
2018
 THAIS REGINA CASTRO DA SILVA PACHECO

ANÁLISE FENOTÍPICA DE ISOLADOS AMBIENTAIS DO COMPLEXO

Cryptococcus neoformans/Cryptococcus gattii ORIUNDOS DO ESTADO
DO PARÁ, BRASIL

Trabalho de Conclusão de Curso apresentado

à Faculdade de Biomedicina da Universidade
Federal do Pará, como requisito parcial para a
obtenção do grau de Bacharel em
Biomedicina.

Orientadora: Profª Drª Solange do Perpétuo Socorro

Evangelista Costa.

BELÉM-PA
2018
 THAIS REGINA CASTRO DA SILVA PACHECO

ANÁLISE FENOTÍPICA DE ISOLADOS AMBIENTAIS DO COMPLEXO

Cryptococcus neoformans/Cryptococcus gattii ORIUNDOS DO ESTADO
DO PARÁ, BRASIL

Trabalho de Conclusão de Curso apresentado

à Faculdade de Biomedicina da Universidade
Federal do Pará, como requisito parcial para a
obtenção do grau de Bacharel em
Biomedicina, aprovado com o conceito
_________________

Orientadora: Profª Drª Solange do Perpétuo Socorro

Evangelista Costa.

Local e Data da defesa: Belém (PA), 20 de fevereiro de 2018.

Banca Examinadora

___________________________________________________
Orientadora: Profª Drª Solange Evangelista do P. Socorro - ICB – UFPA
(Orientadora)

_________________________________________________
Profº. Dr. Antonio Hernández Gutiérrez - ICB-UFPA (1º membro avaliador)

_________________________________________________
Profª. Dr.ª Eliseth Oliveira de Matos- UEPA (2º membro avaliador)

_________________________________________________
Profº. Dr. Francisco Acácio Alves (Membro suplente)
 i

“A educação é o nosso passaporte para o

futuro, pois, o amanhã pertence as
pessoas que se preparam hoje.”

Malcolm X
 ii

DEDICATÓRIA

À minha família, minha fonte de inspiração,

sabedoria, respeito e amor por toda vida. As
minhas amigas e colegas que me deram
suporte emocional para conseguir meus
objetivos. E às pessoas que me auxiliaram de
alguma forma para a conclusão desta etapa.
 iii

AGRADECIMENTOS

Agradeço à Deus, em primeiro lugar;

À minha família pelo apoio estrutural e emocional quando necessitei;
A meu pai e minha mãe, minha base e incentivo de vida.
À minha irmã e melhor amiga Thamires pelo apoio motivacional e por acreditar em
mim quando nem eu mesmo acreditei (obrigada!);
Aos meus sobrinhos Gabriel, Maria Luiza e Helena por serem o motivo do meu sorriso
e felicidade todos os dias e por permitir que a criança que existe em mim nunca morra;
À Prof.ª Solange Costa pela paciência nos momentos difíceis, ajuda e suporte técnico;
A todos os técnicos, Domingos e Odlúcia e aos colegas de laboratório, pelo auxílio
oferecido durante a conclusão deste trabalho;
À Aline pelas amostras utilizadas na conclusão deste trabalho;
Às amigas Ingrid, Michele, Rosian, pelo apoio e palavras de incentivo;
Aos mestres que fizeram parte dessa caminhada e foram fonte de inspiração e
conhecimento durante todo o percurso dessa caminhada;
À Universidade Federal do Pará e à Faculdade de Biomedicina pela oportunidade de
aprendizado e ensino;
E a todos que de alguma forma ajudaram na conclusão deste trabalho.

MUITO OBRIGADA!
 iv

LISTA DE FIGURAS E TABELAS

Figura 1 - Diferenciação de C. gattii (A) e C. neoformans (B) em meio

CGB........................................................................................................................... 14

Figura 2 - Leveduras capsuladas de Cryptococcus observada em microscópio óptico

40x (A) e 100x (B) em tinta
Nanquim.................................................................................................................... 15

Figura 3 - Isolados de Cryptococcus spp no meio ureia de Christensen. Controle

Negativo (A) e amostra positiva (B)............................................................................ 16

Figura 4 - Amostra de Cryptococcus neoformans e C. gattii em ágar níger,

evidenciando a capacidade de produzir melanina em meios contendo composto
fenólicos..................................................................................................................... 16
TABELA 1- Distribuição das espécies de Cryptococcus spp, utilizando o meio
CGB........................................................................................................................... 14
TABELA 2- Distribuição dos resultados referentes à análise fenotípica de 62
amostras de Cryptococcus spp................................................................................. 17
 v

RESUMO

A criptococose é uma infecção potencialmente letal para humanos e outros animais

causada predominantemente por Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii.
Estas espécies apresentam-se como leveduras capsuladas com marcado
neurotropismo, sendo os principais agentes de meningoencefalite de origem fúngica.
O presente estudo teve por objetivo analisar possíveis diferenças fenotípicas de
isolados ambientais oriundos da região amazônica. Sessenta e dois isolados
pertencentes à micoteca do Laboratório de Micologia da Universidade Federal do
Pará, foram semeadas em placas de Petri contendo ágar semente de Níger e
posteriormente, foram submetidas às seguintes provas bioquímicas: produção de
urease, termotolerância a 37ºC e em ágar CGB (L-canavanina-glicina-azul de
bromotimol). As análises dos resultados revelaram que dos 62 isolados, 19 (30,65%)
foram identificadas como C. neoformans e 43 (69,35%) como C. gattii. Cem por
cento destes, apresentaram-se capsulados e com positividade nas provas de urease
e fenolxidase e sensíveis à cicloheximida e 90,32% cresceram à temperatura de 37
°C. Os isolados demonstraram as principais características de virulência analisadas
com poucas diferenças entre as cepas.
 vi

ABSTRACT

Cryptococcosis is a potentially lethal infection for humans and other animals caused
primarily by Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii. These species
present as yeast capsulated with neurotropism, and are the main agents of
meningoencephalitis caused by fungi. The present study aimed to analyze possible
phenotypic differences of environmental isolates from the Amazon region. Sixty-two
isolates belonging to the Mycology Laboratory of the Federal University of Pará were
plateded in Petri dishes containing Niger seed agar and then submitted to the
following biochemical tests: urease production, thermotolerance at 37ºC and CGB (L-
canavanine-glycine-bromothymol blue) agar. The result of the study revealed that of
the 62 isolated samples, 19 (30.65%) were identified as C. neoformans and 43
(69.35%) were identified as C. gattii. All these isolates (100%) were capsulated and
positive in the urease and phenolxidase tests and cycloheximide sensitive and
90.32% were grown at 37 ° C. The isolates showed the main virulence characteristics
analyzed with few differences between strains.
 vii

Sumário

1 - INTRODUÇÃO ............................................................................................................. 1
1.1 - TAXONOMIA...............................................................................................................3
1.2 – ASPECTOS MORFOLÓGICOS.................................................................................4
1.3 - ASPECTOS ECOLÓGICOS.........................................................................................5
1.4 - INTERAÇÃO FUNGO-HOSPEDEIRO..........................................................................5
1.5 - FATORES RELACIONADOS À VIRULÊNCIA.............................................................6
1.5.1 – Cápsula Polissacarídica........................................................................................7
1.5.2 – Melanina..................................................................................................................7
1.5.3 – Termotolerância.....................................................................................................8
1.5.4 – Urease.....................................................................................................................8
2 – OBJETIVOS.................................................................................................................10
2.1 – GERAL.......................................................................................................................10
2.2 – ESPECÍFICOS...........................................................................................................10
3 - MATERIAIS E MÉTODOS...........................................................................................11
3.1 – AMOSTRAS...............................................................................................................11
3.2 - TESTE CGB...............................................................................................................11
3.3 – EXAME DIRETO........................................................................................................12
3.4 – PROVA DA URÉIA....................................................................................................12
3.5 - TERMOTOLERÂNCIA À 37 °C..................................................................................12
3.6 - SENSIBILIDADE À CICLOHEXIMIDA.......................................................................12
3.7 - ATIVIDADE FENOLOXIDASE...................................................................................13
4 - RESULTADOS.............................................................................................................14
4- DISCUSSÃO..................................................................................................................19
5- CONCLUSÃO................................................................................................................22
REFERÊNCIA....................................................................................................................23
 1

1- INTRODUÇÃO

Os fungos são seres eucarióticos, heterotróficos por absorção,

morfologicamente diferenciados como leveduras e fungos filamentosos. Estão
classificados no reino Fungi, que abriga espécies micro e macroscópicas amplamente
distribuídas na natureza, reproduzindo-se tipicamente por esporos. São
extremamente importantes como seres decompositores (espécies sapróbias), mas
também podem causar prejuízos em variados setores das atividades humanas, como
os agravos produzidos à saúde humana/animal, atuando como agentes alergênicos,
produtores de micotoxinas e pelo parasitismo nos tecidos. As infecções fúngicas são
conhecidas como micoses e ocorrem devido à invasão de tecidos e sistemas
biológicos por fungos, acarretando lesões e outros efeitos sintomáticos. As micoses
podem ser ocasionadas por fungos filamentosos ou leveduriformes e classificadas
como micoses superficiais, cutâneas, subcutâneas, sistêmicas e oportunistas (ZAITZ,
2010). Micoses oportunistas estão relacionadas com o acometimento de pacientes
imunocomprometidos tais como pacientes portadores da síndrome da
imunodeficiência adquirida (SIDA), transplantados, pacientes que fazem uso
prolongado por corticosteroide, com lúpus eritematoso sistêmico, dentre outros
(CONSENSO EM CRIPTOCOCOSE, 2008). Os agentes primários são responsáveis
por infecções em hospedeiros considerados saudáveis.
A criptococose, também conhecida como torulose e blastomicose europeia,
é causada por leveduras encapsuladas pertencentes ao complexo Cryptococcus
neoformans/Cryptococcus gattii (DEL POETA, 2012, KWON-CHUN et aI., 2017) as
quais apresentam afinidade pelo Sistema Nervoso Central. Antes da década de 1980,
infecções cosmopolitas causadas por agentes de Cryptococcus spp. eram
consideradas raras e de pouca importância clínica, porém, atualmente a criptococose
se tornou uma das infecções sistêmicas de maior prevalência mundial. A elevação na
incidência dessa doença ocorreu após a descoberta do Vírus da Imunodeficiência
Adquirida (HIV), que ocasiona a Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (SIDA) em
seres humanos (BRASIL, 2013; CONSENSO EM CRIPTOCOCOSE, 2008). Estudos
revelaram que a criptococose é a micose sistêmica mais frequente em pacientes
portadores de HIV/SIDA, estando relacionada com elevado número de óbitos
mundialmente, sendo a meningite criptococócica a forma clínica mais comum da
 2

doença devido ao tropismo do fungo pelo sistema nervoso central (ALMEIDA et al.,
2014).
De acordo com a Organização Mundial da Saúde, até o final de 2016 cerca
de 36,7 milhões de pessoas em todo o mundo viviam com HIV e cerca de 76,1 milhões
de pessoas foram infectadas pelo HIV desde o início da epidemia da doença (UNAIDS,
2017). Estima-se que ocorra cerca de 624.700 mortes por ano, dentro de amplos
intervalos de confiança de 125.000 a 1.124.900 por criptococose, ao redor do mundo
(IDNURM et al., 2015). No Brasil foram notificados mais 17.000 novos casos de HIV
em 2012, tendo o Norte como a região com a menor notificação de casos, porém,
tendo uma taxa de incidência elevada significativamente entre o período de 2000 a
2011 (BRASIL, 2012). No estado do Pará, Santos et al., (2015) realizaram um estudo
transversal de 142 pacientes HIV/AIDS diagnosticados no Hospital Universitário João
de Barros Barreto (HUJBB), que evoluíram para óbito, no período de janeiro/2011 a
janeiro/2012, dos quais 5 (3,5%) foram por meningite criptocócica.
No Brasil, a criptococose causada por Cryptococcus neoformans (San
Felice) é observada em todas as regiões, enquanto que a criptococose causada por
Cryptococcue gattii (Vanbreus. & Takashio) surge como importante endemia nas
regiões Norte e Nordeste (BRASIL, 2012). Estudos sobre a criptococose e seus
agentes na região amazônica ainda são incipientes, destacando-se o relato de 19
casos de criptococose em crianças, das quais nove causadas por C. gattii, sugerindo
que o estado do Pará constitui uma região de alta endemicidade da criptococose por
esta espécie (CORRÊA et al., 1999). De acordo com estes autores, a infecção pelo
complexo C. gattii pode ocorrer de forma precoce, ainda na infância, e permanecer
inativa por um longo período podendo se manifestar mais tardiamente.
Em 2008, Santos et al., identificaram C. gattii como o principal agente de
meningite em pacientes HIV negativos, destas 17% em crianças com 11% causadas
pelo genótipo VGII. Pesquisas ambientais, levaram ao registro do primeiro isolamento
de C. neoformans (VNI) e C. gattii (VGII) na Região Metropolitana de Belém (RMB)
(Costa et al., 2008) e no interior do estado do Amazonas, também se notificou a
ocorrência de C. gattii tipo molecular VGII de origem ambiental (Brito-Santos et al.,
2015). Estes achados demonstram a ocorrência da criptococose na Amazônia e
enfatizam a importância de estudos que visem a análise mais acurada dos agentes
da criptococose bem como estudos ecológicos e epidemiológicos sobre estas
espécies na região
 3

1.1 – TAXONOMIA

O gênero Cryptococcus compreende aproximadamente 100 espécies

descritas, entre as quais as espécies C. neoformans e C. gattii que se destacam como
os principais agentes etiológicos criptococose humana e animal (MITCHELL et al.,
2011). A diversidade genética intraespecífica foi demonstrada à medida que foram
aplicados diferentes métodos de genotipagem para cada sorotipo.
Atualmente são reconhecidas duas espécies: Cryptococcus neoformans
com duas variedades: C. neoformans var. grubii (sorotipo A) (FRANZOT et al., 1999),
C. neoformans var. neoformans (sorotipo D e AD) e Cryptococcus gattii (sorotipos B e
C). Filobasidiella neoformans e F. bacilllispora, referem-se aos seus respectivos
teleomorfos (fase sexuada).
Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii podem ser classificados
em sorotipos e tipos moleculares. Os sorotipos são definidos com base em antígenos
capsulares resultando em quatro sorotipos, de A até D, onde C. neoformans
atualmente contém os sorotipos A, D e um híbrido AD. Os sorotipos B e C são
referentes a C. gattii, podendo existir híbridos entre as espécies C. neoformans e C.
gattii. Já os tipos moleculares são utilizados principalmente em estudos
epidemiológicos de surtos. Conforme Meyer & Trilles (2010) a nomenclatura
recomendada pelo grupo de estudo “Genotyping of Cryptococcus neoformans and C.
gattii” inclui oito tipos moleculares: VNI-VNIV para C. neoformans e VGI-VGIV para C.
gattiii. (IOWA STATE UNIVERSITY CENTER FOR FOOD SECURITY AND PUBLIC
HEALTH, 2013).
Em recente estudo Hagen et al. (2015) propõem e descrevem sete
espécies, incluindo C. neoformans e C. gattii. As espécies têm correspondência a
genótipos anteriormente descritos para C neoformans e C. gattii (VNI-VNIV; VGI-
VGIV) e (AFLP). Como resultado, o número de espécies cientificamente válidas dentro
do complexo Cryptococcus neoformans/C. gatiii tornou-se uma questão controversa
entre os taxonomistas quanto à definição apropriada de uma espécie. Kwon-Chung et
al (2017) propuseram a adoção da nomenclatura "Complexo de Espécies" como uma
solução prática, evitando-se a citação de sete espécies como agentes da
criptococose, referindo-se a estes como complexo C. neoformans e complexo C. gattii,
separadamente o que não implicará na exclusão das espécies propostas.
 4

Com base nas características fenotípicas e genotípicas as espécies do

complexo Cryptococcus neoformans/gattii apresentam a seguinte classificação
sistemática: Reino: Fungi, Filo: Basidiomycota, Subfilo: Agaricomycotina, Classe:
Tremellomycetes, Subclasse: Tremellomycetidae, Ordem: Tremellales, Família:
Tremellaceae, Gênero: Cryptococcus/ Filobasidiella (Mycobank, 2017).
Considerando as dificuldades e complexidade nomenclaturais relacionadas
a estes agentes, neste estudo, optou-se por seguir a taxonomia proposta por Know-
Chung et al., (2002), ou seja, C. neoformans com seu teleomorfo Filobasidiella
neoformans e C. gattii com seu teleomorfo Filobasidiella bacillispora. Assim, C.
neoformans var. grubii e C. neoformans var. neoformans, sorotipos A e D
respectivamente, serão referidos como C. neoformans, e C. neoformans var. gattii
(sorotipos B e C), será referido como C. gattii.

1.2 – ASPECTOS MORFOLÓGICOS

Na fase assexuada ou anamorfa, as leveduras do gênero Cryptococcus spp

se apresentam como células haploides, encapsuladas, arredondadas a ovaladas,
geralmente sem presença de hifas ou pseudo-hifas, reproduzindo-se por brotamento
único ou raramente multibrotamento que se originam de qualquer lugar da parede
celular. Os blastoconídeos resultantes podem permanecer unidos através de um colo
estreito à célula-mãe (CONSENSO EM CRIPTOCOCOSE, 2008).
As fases teleomórficas são designadas de Filobasidiella neoformans e F.
bacillispora, correspondente a C. neoformans e C. gattii, respectivamente (KWON-
CHUNG; BENNET, 1992). A fase sexuada é caracterizada por apresentar hifas
dicarióticas (presença de dois núcleos de origens diferentes) sendo necessária a
compatibilidade bipolar, ou seja, a existência de alelos opostos no locus sexual, MATα
e MATa para que haja a reprodução sexuada. Esses mating-types ou tipos sexuais
apresentam papel importante na epidemiologia e virulência do microrganismo.
Embora existam evidências de que tanto C. neoformans quanto C. gattii possam
relacionar-se em ambiente natural (mas não dentro de hospedeiros animais), esse
comportamento ainda não foi observado ainda fora de laboratório (CONSENSO EM
CRIPTOCOCOSE, 2008).
 5

1.3 – ASPECTOS ECOLÓGICOS

Os principais agentes etiológicos da criptococose são C. neoformans e C.

gattii, os quais apresentam características eco-epidemiológicas distintas.
O agente da criptococose foi isolado pela primeira vez a partir do solo por
EMMONS (1951), que depois demonstrou haver uma relação entre o isolamento do
solo e ninhos de pombos.
As excretas de aves são consideradas um dos principais reservatórios de
C. neoformans, principalmente as de pombos (Columba livia Gmelin), porém já foram
relacionadas também a madeira em decomposição, ambiente de morcego, detritos de
vegetais, oco de árvores, insetos (SOUSA, 2013). Algumas aves, além de pombos,
são importantes reservatórios deste agente como canários e periquitos criados em
cativeiro no ambiente doméstico (FILIÚ et al., 2002; PASSONI et al.,1998; BRASIL,
2012). O ambiente domiciliar, particularmente a poeira doméstica, pode estar
relacionado com a presença deste agente, (SWINNE et al., 1989; PASSONI et al.,
1998; COSTA, 2008 e ALVES et al., 2016).
O habitat natural de Cryptococcus gattii tem sido descrito de isolados
ambientais procedentes de ocos de árvores e madeiras em decomposição,
principalmente em regiões tropicais e subtropicais, mas com ocorrências em formas
de surtos em regiões de clima temperado e frio (HAGEN et al., 2010; MACDOUGALL
et al., 2007).
O primeiro isolamento ambiental foi relatado em 1991 por Ellis & Pfeiffer,
relacionado a eucaliptos (Eucaliptus camaldulensis) na Austrália, porém, a espécie já
foi descrita em outras espécies vegetais em várias partes do mundo, como oiti, cássia
fícus, amendoeiras, inclusive no Brasil (CÁRDENAS, 1998; LAZERA, 2000). Diversos
trabalhos realizados no Brasil, registraram C. gattii associado a habitats naturais
representados por madeira em decomposição em árvores tropicais, descrevendo um
nicho natural potencialmente partilhado por estes agentes, seja em ambientes
urbanos, rurais ou silvestres (BRASIL, 2012).

1.4 - INTERAÇÃO FUNGO-HOSPEDEIRO

A criptococose é uma infecção aguda, subaguda ou crônica, causada

predominantemente por C. neoformans (geralmente oportunista) e C. gattii
(geralmente primária), que comumente envolve o cérebro, o pulmão, os ossos ou a
 6

pele. A infecção nas pessoas, ocorre principalmente pela inalação de pequenas

partículas de origem sexual, basidiosporos (3 µm) ou com as de origem assexual,
blastoconídios pouco capsulados (4 a 5 µm) presentes no ambiente, que inicialmente
pode causar infecção sintomática ou assintomática na área subpleural dos pulmões,
ser erradicada ou, ainda, permanecer dentro de um granuloma em estado latente
(CASADEVALL; PERFECT, 1998), porém a colonização primária do agente também
pode ocorrer na cavidade nasal, além de ocasionalmente entrar no organismo através
de traumas na pele, onde tipicamente causam doença localizada (IOWA STATE
UNIVERSITY CENTER FOR FOOD SECURITY AND PUBLIC HEALTH, 2013).
Em hospedeiros imunocompetentes a criptococose é geralmente limitada,
ou seja, os mecanismos de defesa do organismo do paciente podem eliminar ou
diminuir a infecção causada para um quadro severo relacionado aos pulmões, já em
pacientes imunocomprometidos a infecção não se limita só ao primeiro sítio, podendo
ser disseminada através da corrente sanguínea para outros órgãos e tecidos,
preferencialmente para o sistema nervoso central (SNC) (BICANIC & HARRISON,
2005; KWON-CHUNG & BENNETT, 1992), onde está associada a quadros de
meningite, meningoencefalite ou encefalite com altas taxas de letalidade. Sugere-se
que o neurotropismo do fungo esteja relacionado à disponibilidade de catecolaminas,
e outros substratos no cérebro que podem ser usados pelo fungo para síntese de
melanina (CONSENSO EM CRIPTOCOCOSE, 2008), além da fraca ou ausente
resposta inflamatória no tecido cerebral (SEVERO et al., 1998), sugerindo que o
cérebro sirva mais como local de sobrevivência do que propriamente nutricional
(RODRIGUES et al., 1999).
A criptococose oportunista, afeta principalmente indivíduos com o
sistema imunológico comprometido, como pacientes com HIV, pessoas que fazem uso
de corticoides, imunossupressores, pacientes que fazem uso de medicamentos
inibidores do fator de necrose tecidual, diabéticos, portadores de neoplasias malignas,
cirrose hepática, insuficiência renal, doença pulmonar crônica, sarcoidose e anemia
falciforme (QUEIROZ et al., 2008).

1.5 - FATORES RELACIONADOS À VIRULÊNCIA

Patogenicidade é a capacidade que um microrganismo tem, uma vez

instalado, em causar danos ao hospedeiro. Alguns componentes estruturais e
características de C. neoformans e C. gatttii, atuam como fatores de virulência, que
 7

auxiliam o agente no êxito da doença. Destacam-se entre os principais fatores de

virulência destes agentes a formação de pigmentos melanínicos, a termotolerância, o
desenvolvimento de cápsula polissacarídica e produção de enzimas como urease,
fosfolipase e proteinase (CONSENSO EM CRIPTOCOCOSE, 2008).

1.5.1 – Cápsula Polissacarídica

É muito comum em certos microrganismos o desenvolvimento de estruturas

especializadas que fornecem benefício de sobrevivência durante o ciclo de vida do
mesmo. Dentre algumas destaca-se a cápsula, camada que envolve a célula, sendo
constituída principalmente por polissacarídeos e considerada um dos principais
fatores de virulência de C. neoformans e C. gattii. A cápsula é composta
primariamente por dois polissacarídeos, o glucuronoxilomanana (GXM) e o
galactoxilomanana (GalXM) e por uma pequena proporção de uma mananoproteina
(MP). O GXM é o polissacarídeo mais abundante correspondendo a 90-95% da massa
polissacarídica. Os polissacarídeos GalXM e GXM induzem grupos de citocinas, e a
GalXM induz a apoptose de macrófagos por alterações morfológicas. Além de seu
papel estrutural, essas moléculas têm sido associadas a muitos efeitos deletérios na
resposta imune (ZARAGOZA et al., 2009).
A cápsula contribui para a sobrevivência de alguns microrganismos, pois
oferece resistência em certas condições de estresse tal como desidratação, tendo
papel chave na interação com o ambiente (ZARAGOZA et al., 2009) e protegendo o
agente da ação de células fagocitárias, tais como monócitos, macrófagos e neutrófilos,
fator que contribui para a diminuição da resposta imunológica promovendo a inibição
da fagocitose, da ligação de IgG, do bloqueio da fixação de C3 e da via da ativação
de complemento pela via clássica, supressão da proliferação da expressão das
moléculas de adesão (CONSENSO EM CRIPTOCOCOSE, 2008; PERFECT et al.,
1998; BUCHANAN e MURPHY, 1998).

1.5.2 - Melanina

Melaninas são macromoléculas sintetizadas por polimerização oxidativa de

compostos fenólicos através de uma enzima lacase, a fenoloxidade. São
macromoléculas hidrofóbicas carregadas negativamente, insolúvel em solventes
fisiológicos, e resistentes à degradação ácida, que resultam em pigmentos de
 8

coloração marrom ou preto em substratos difenólicos tais como ágar contendo extrato
de semente de Guizotia abyssinica, componente fundamental na elaboração do meio
ágar niger, descrito por Staib em 1962.
A melanina é um importante fator de virulência para os fungos que a
sintetizam, porém no gênero Cryptococcus apenas C. neoformans e C.gattii são
capazes de sintetizar na presença de substratos difenólicos (KWON-CHUNG et al.,
1986). A melanina está relacionada principalmente ao mecanismo de evasão ao
sistema imunológico do hospedeiro, o que dificulta a sua fagocitose por células
imunológicas do hospedeiro (WANG et al., 1995) bem como provável ação
antioxidante em relação às substâncias produzidas pelos tecidos do hospedeiro.

1.5.3 – Termotolerância

Os agentes da criptococose possuem a capacidade de desenvolver-se na

temperatura corporal de mamíferos, habilidade esta, denominada de termotolerância,
sendo uma característica fundamental para fungos que causam infecções sistêmicas
(PERFECT, 2006). Dentro do reino Fungi poucas espécies estão aptas a causar
doenças invasivas, devido à incapacidade de crescer em temperatura igual ou
superior à 37°C. A habilidade de crescimento a essa temperatura em algumas
espécies está associada à transição para forma de levedura (dimorfismo), como
observado em Histoplasma capsulatum, Paracoccidioides brasiliensis e Blastomyces
dermatitidis (KRAUS et al., 2004). No gênero Cryptococcus, especialmente C.
neoformans e C. gattii são capazes de crescer em temperatura superior a 30ºC. São
raros isolados de outras espécies de Cryptococcus capazes de crescer a 37ºC
(KWON-CHUNG & BENNETT, 1992).

1.5.4 – Urease

A atividade urease tem sido descrita como fator primário na patogênese da

criptococose, esta enzima hidrolisa ureia a amônia e carbamato, que resulta no
aumento localizado do pH sendo utilizado na identificação como resultado de
alterações colorimétricas. O aumento do pH produzido pelo hidróxido de amônia
produz injúria tecidual e permite a sobrevivência da levedura (TAKAHARA,2011). A
grande maioria dos isolados clínicos do complexo C. neoformans/C. gattii são urease
positivo (STEENBERGEN & CASADEVALL, 2003).
 9

Considerando a importância do complexo C. neoformans/C. gattii como

agentes de infecção pulmonar primária e meningoencefalite e a escassez de estudos
sobre estes agentes na região Amazônica, foi proposto estudo com o objetivo de
caracterizar fenotipicamente isolados ambientais de Cryptococcus neoformans e C.
gattii, procedentes do estado do Pará, pertencentes à coleção de fungos do
Laboratório de Micologia da UFPA.
 10

2. OBJETIVOS

2.1 GERAL

Caracterizar fenotipicamente isolados de origem ambiental do complexo

Cryptococcus neoformans/Cryptococcus gattii, procedentes do estado do Pará.

2.2 ESPEFÍFICOS

 Diferenciar fenotipicamente Cryptococcus neoformans de C.

gattii.
 Caracterizar biologicamente os isolados ambientais, quanto aos
seguintes aspectos: atividades urease e fenoloxidase, termotolerância e
sensibilidade à cicloheximida.
 Analisar a presença/ausência de cápsula polissacarídica.
 11

3- MATERIAL E MÉTODOS

Foi realizada a caracterização fenotípica de leveduras do complexo C.

neofomans/C. gattii sendo empregada as seguintes provas: teste CGB, prova da ureia,
pesquisa da cápsula polissacarídica, termotolerância a 37 C°, sensibilidade à
cicloheximida e atividade fenoloxidase (produção de melanina).

3.1 – AMOSTRAS

Para este estudo utilizaram-se sessenta e dois isolados, provenientes de

amostras de origem vegetal (árvores) e de poeira domiciliar, oriundos da região
metropolitana de Marabá e de Igarapé-Miri, cidades localizadas no estado do Pará e
cedidos pelo Laboratório de Micologia do Instituto de Ciências Biológicas (ICB) da
Universidade Federal do Pará (UFPA). Inicialmente as amostras selecionadas foram
reativadas utilizando-se primeiramente ágar níger como forma de verificar a pureza
das amostras e depois repicadas em meio ágar Sabouraud com cloranfenicol.

3.2 - TESTE CGB

A diferenciação das espécies do complexo C. neoformans/C. gattii, foi

realizada com base no método descrito por Kwon-Chung & Rhodes (1986), que
consiste na utilização do meio constituído de canavanina-glicina-azul de bromotimol
(CGB). Neste meio Cryptococcus gattii hidrolisa a glicina, assimilando-a como fonte
de carbono e nitrogênio e apresenta resistência à L-canavanina. O meio CGB tem pH
ajustado para 5,8 e quando ocorre o crescimento do fungo, o pH aumenta, alterando
a coloração do meio de amarelo esverdeado, para azul cobalto. Colônias jovens
crescidas em ágar Sabouraud foram repicadas para o meio CGB e incubadas à
temperatura ambiente (± 28 ºC), sendo analisadas por até 5 dias. A variação na
coloração foi observada segundo os parâmetros descritos por MELO et al., (1993),
onde: 0= nenhuma variação, 1+ = leve variação na cor, 2+ = meio azul-esverdeado,
3+ = azul cobalto e fundo azul-esverdeado, 4+ = azul cobalto, estipulando-se que
quando variações de 0 a 2+ = C. neoformans (SOROTIPOS A-D), 2+ = indeterminado
e = ou > 3+ = C. gatti (SOROTIPOS B-C).
 12

3.3 – EXAME DIRETO

Uma das principais características e que também confere proteção ao

gênero Cryptococcus é a presença da cápsula polissacarídica. Alíquotas (uma alçada)
de colônias jovens de Cryptococcus foram montadas em lâminas com tinta da China
(tinta nanquim) e formol 10% e observadas ao microscópio óptico Olympus. A tinta da
China não penetra na cápsula mostrando a mesma, como um halo claro envolvendo
a levedura, contrastando com um fundo preto. Fotomicrografias das leveduras
capsuladas foram registradas utilizando-se microscópio Nikon Eclipse 80i e programa
NIS-Elements F.

3.4 - PROVA DA URÉIA

Esta prova é utilizada para verificar a habilidade do micro-organismo de

degradar a ureia pela ação da enzima urease, com formação de amônia, que resulta
na alcalinização do meio produzindo a viragem do indicador de pH de neutro para
básico, podendo assim, ser verificado uma coloração de tom róseo que varia de um
tom mais fraco até um mais intenso. Colônias jovens foram repicadas em meio ágar
ureia de Christensen (Christensen, 1946) e incubadas em B.O.D à temperatura de
28ºC pelo período de até 7 dias de acordo com Contin et al. (2011).

3.5 - TERMOTOLERÂNCIA A 37 °C

A prova da termotolerância foi realizada em meio ágar Sabouraud onde

foram repicadas alíquotas da mesma cultura da levedura em dois tubos de ensaio, os
quais foram incubados à temperatura ambiente (± 28°C) (controle positivo) e outro a
37ºC. Foram observados por até 7 dias (CASADEVALL& PERFECT, 1998). Em geral,
C. neoformans e C. gattii crescem em ambas temperaturas.

3.6 - SENSIBILIDADE À CICLOHEXIMIDA

Para realização da prova de sensibilidade à cicloheximida, os isolados

foram inoculados em ágar Sabouraud com cloranfenicol (controle positivo) e em ágar
Sabouraud suplementado com cloranfenicol e cicloheximida (Fungobiotic agar) e
incubados à temperatura ambiente (± 28ºC) por até 7 dias. É um meio comumente
 13

utilizado para o isolamento de fungos patogênicos, principalmente dermatófitos. Age

inibindo o isolamento fungos oportunistas e de certas leveduras patogênicas dos
gêneros Candida e Cryptococcus. A maioria dos isolados de C. neoformans e C. gattii
são sensíveis à ≤ 12 µg/mL de cicloheximida (KWON-CHUNG, 1998).

3.7 - ATIVIDADE FENOLOXIDASE

A atividade da fenoloxidase foi realizada utilizando-se culturas de leveduras

crescidas em ágar Sabouraud com 24-72 horas de crescimento, as quais foram
semeadas por estrias em placas de Petri contendo ágar níger (Guizotia abyssinica).
Neste meio C. neoformans e C. gattii produzem pigmento de coloração marrom,
devido à atividade da enzima lacase (fenol-oxidase) em presença de substrato
contendo compostos fenólicos. As amostras foram observadas em até 48 horas.
 14

4- RESULTADOS

A quimiotipagem dos sessenta e dois isolados ambientais, provenientes do

Laboratório de Micologia, utilizando-se o meio CGB (Fig. 1), mostrou que dezenove
(30,65%) foram identificadas como C. neoformans e quarenta e três (69,35%) de C.
gattii (Tabela 1).

Tabela 1 – Distribuição das espécies de Cryptococcus spp., utilizando o meio CGB.

Espécies Nº de amostras %
C. gattii 43 69,35
C. neoformans 19 30,65
Total 62 100

Figura 1 – Diferenciação de C. gattii (A) e C. neoformans (B)

em meio CGB. Fonte: Autoria própria

A pesquisa das leveduras em exame direto com tinta nanquim mostrou

leveduras encapsuladas, globosas, arredondadas, unibrotantes e sem hifas ou
pseudohifas (Figura 2).
 15

Figura 2 – Leveduras capsuladas de Cryptococcus observada em microscópio

óptico 40x (A) e 100x (B) em tinta Nanquim. Fonte: Autoria própria e COSTA, SPSE

Todos os resultados obtidos através da análise fenotípica são

apresentados na Tabela 2, onde se observa que todos os isolados se apresentaram
como leveduras capsuladas (Figura 2). Todas as cepas exibiram capacidade de
hidrolisar a uréia em meio de Christensen (Figura 3), embora e algumas
apresentassem coloração rósea em tonalidade mais claras. Todos os isolados foram
fenoloxidase positivos demonstrado pela produção de pigmento melanínico em meio
ágar níger até 72 h de incubação (Figura 4) bem como foram sensíveis a 0,5 µg/mL
de cicloheximida. Observou-se diferenças com relação à termotolerância a 37 °C,
onde dos sessenta e dois isolados submetidos à prova, cinquenta e seis (90,32%)
foram termotolerantes e em seis amostras (9,68%) não houve crescimento.

Figura 3 – Isolados de Cryptococcus spp no meio ureia de Christensen. Controle Negativo (A)(Candida spp.) e
amostra positiva (B) (Cryptococcus spp.). Fonte: Autoria própria
 16

Figura 4 – Amostra de Cryptococcus spp. em ágar níger, evidenciando a capacidade de

produzir melanina em meios contendo composto fenólicos. Foto: Autoria própria.

Tabela 2 - Distribuição dos resultados referentes à análise fenotípica de 62 amostras de Cryptococcus spp.

Amostras CGB Atividade Cápsula Termotolerância Sensibilidade à Atividade

Urease a 37 °C cicloheximida Fenoloxidase
MA-1 C. gatti + + - + +
MA-2 C. gatti + + + + +
MA-3 C. gatti + + + + +
MA-4 C. gatti + + + + +
MA-5 C. gatti + + + + +
MA-7 C. gatti + + - + +
MA-8 C. neoformans + + + + +
MA-9 C. neoformans + + + + +
MA-10 C. gatti + + + + +
MA-11 C. gatti + + + + +
MA-12 C. gatti + + + + +
MA-13 C. gatti + + + + +
MA-14 C. gatti + + - + +
MA-16 C. gatti + + + + +
MA-17 C. gatti + + + + +
MA-18 C. gatti + + + + +
MA-19 C. gatti + + + + +
MA-20 C. gatti + + + + +
MA-21 C. gatti + + + + +
MA-22 C. neoformans + + + + +
(Continua)
 17

(Continuação)
Amostras CGB Atividade Cápsula Termotolerância Sensibilidade à Atividade
Urease a 37 °C cicloheximida Fenoloxidase
MA-23 C. gatti + + + + +
MA-24 C. gatti + + + + +
MA-25 C. gatti + + + + +
MA-26 C. gatti + + + + +
MA-27 C. gatti + + + + +
MA-28 C. gatti + + + + +
MA-29 C. gatti + + + + +
MA-30 C. gatti + + + + +
MA-32 C. gatti + + - + +
MA-33 C. gatti + + + + +
MA-34 C. neoformans + + + + +
MA-35 C. gatti + + + + +
MA-36 C. neoformans + + - + +
MA-37 C. neoformans + + + + +
MA-38 C. neoformans + + + + +
MA-39 C. gatti + + + + +
MA-41 C. neoformans + + + + +
MA-42 C. gatti + + + + +
MA-43 C. gatti + + + + +
MA-44 C. gatti + + + + +
001-13 C. gatti + + + + +
002-13 C. gatti + + + + +
005-13 C. neoformans + + - + +
007-13 C. gatti + + + + +
008-13 C. gatti + + + + +
009-13 C. gatti + + + + +
011-13 C. gatti + + + + +
012-13 C. gatti + + + + +
013-13 C. neoformans + + + + +
014-13 C. neoformans + + + + +
015-13 C. neoformans + + + + +
016-13 C. neoformans + + + + +
017-13 C. neoformans + + + + +
019-13 C. gatti + + + + +
020-13 C. gatti + + + + +
021-13 C. neoformans + + + + +
022-13 C. neoformans + + + + +
023-13 C. neoformans + + + + +
024-13 C. gatti + + + + +
025-13 C. gatti + + + + +
026-13 C. neoformans + + + + +
029-13 C. neoformans + + + + +
 18

5- DISCUSSÃO

Os resultados apresentados identificaram as espécies do complexo C.

neoformans/ C. gatti através da realização do teste em meio de cultura canavanina-
azul de bromotimol-glicina (CGB), uma técnica preconizada por KWON-CHUNG et al.,
(1982) para diferenciação destas espécies, demonstrando maior número de C. gattii
entre as amostras ambientais analisadas. De acordo com Klein et al., (2009) este
método é de baixa complexidade e custo-benefício, podendo ser facilmente
incorporado ao fluxo de trabalho clínico para diferenciação destes patógenos. Estes
autores analisaram 102 amostras de leveduras em CGB, ágar níger, obtendo-se 17/17
(100%) de C. gattii com reação positiva e 54/54 (100%) de C. neoformans foram
negativas, ressaltando que uma amostra de C. neoformans foi fracamente reativa em
CGB. Outras espécies como C. curvatus, C. laurentii e C. luteolus também foram CGB
positivas, porém somente C. neoformans e C. gattii produziram melanina em ágar
niger. Outros métodos disponíveis para identificação, como API 20C AUX (bioMérieux,
Durham, NC) Vitek (bioMérieux) e microScan (Siemens, West Sacramento, CA) não
diferenciam entre C. neoformans e C. gattii (Klein et al, 2008).
Amostras fracamente reativas também foram observadas neste estudo,
tendo sido identificadas como C. neoformans. É evidente que técnicas moleculares
permitem um estudo mais acurado, levando inclusive à diferenciação de espécies
crípticas do complexo C. neoformans/C. gattii, porém são métodos dispendiosos,
necessitam de mão-de-obra especializada e não estão facilmente disponíveis para
laboratórios clínicos de países em desenvolvimento e/ou de regiões extensas como a
Amazônia. No entanto, deve-se ressaltar que em se tratando de isolados ambientais
são importantes outros métodos para confirmação, podendo-se incluir testes
bioquímicos que identifiquem características típicas das espécies em questão.
Os resultados do teste CGB demonstram que 43/62 (69,35%) das amostras
foram de Cryptococcus gattii, agente responsável por infecções em indivíduos sem
comprometimento imunológico, agindo como agente patogênico primário (KWON-
CHUNG, 2011; BRASIL, 2012). Cryptococcus neoformans representou 19/62
(30,65%) espécie tipicamente oportunista, relacionado principalmente a quadros de
infecção em indivíduos imunocomprometidos, especialmente, de pacientes com a
síndrome da imunodeficiência adquirida (SIDA), destacando-se como o principal
 19

causador de criptococose em pacientes com essa enfermidade (MOREIRA et al.,

2006; RIBEIRO et al., 2009).
Existem vários fatores de patogenicidade que contribuem para a virulência
do complexo C. neoformans/C. gattii e que podem auxiliar na diferenciação destas
espécies, como por exemplo a capacidade de crescer a 37°C. Bovers et al. (2008)
relatam que C. neoformans e C. gattii são os únicos representantes da ordem dos
Tremellales que podem crescer muito bem a temperaturas acima de 30°C. Neste
estudo a termotolerância foi evidenciada na maioria das cepas, onde 90,32 % das
amostras analisadas apresentaram a habilidade de crescer a 37 °C. Diferentemente,
Gomes et al.(2010) em análise de 15 cepas de origem clínica apenas uma apresentou
esta habilidade, o que chama a tenção, tendo em vista que as cepas são de origem
clínica. Muito embora a habilidade de crescer a 37°C não signifique que o organismo
se torne um patógeno de mamíferos, é, no entanto, um fator essencial para qualquer
patógeno ser capaz de causar uma doença invasiva (KWON-CHUNG et al., 2014).
Dentre os isolados analisados apenas seis amostras não cresceram quando
submetidas à essa temperatura, possivelmente o tempo de armazenamento dos
isolados influenciou na capacidade de crescimento das amostras, e talvez, no
potencial de virulência do agente. Desta forma, os resultados de termotolerância
obtidos neste estudo demonstram que a maioria dos isolados ambientais analisados
têm potencial para causar criptococose sistêmica. De acordo com Kwon-Chung et al.
(2014), mais de 70 espécies de Cryptococcus tem habilidade de crescer robustamente
em temperaturas fisiológicas. A montagem de lâminas com tinta nanquim ou da China
refere-se ao exame direto utilizado para a observação da cápsula polissacarídica, um
teste rápido e diferencial para o gênero. A cápsula foi observada em todas as amostras
analisadas durante o estudo e esta característica é essencial no diagnóstico do
agente. Tais resultados são similares com os achados de Gomes et al (2010) cujos
isolados estudados foram 100% capsulados.
Granger et al (1985) comprovam que o tamanho da cápsula aumenta
durante a infecção e a alta concentração predominante de CO2 em tecidos de
mamíferos, pode estimular a síntese de polissacarídeos capsulares. Bulmer et al.
(1967) demonstrou a importância da cápsula como fator de virulência, onde verificou
que mutantes acapsulados e avirulentos, porém procedentes de cepas capsuladas,
pode retornar ao seu estado capsulado e apresentar variados graus de virulência em
estudos com camundongos. Segundo Zaragoza et al. (2009), dependendo das
condições ambientais específicas o tamanho da cápsula pode variar de tamanho, não
 20

apenas entre cepas diferentes, mas também entre células individuais de uma mesma
cepa. A cápsula auxilia na proteção de C. neoformans contra as defesas do
hospedeiro, pois não são fagocitadas ou mortas por neutrófilos, monócitos ou
macrófagos no mesmo grau que as células acapsulares (BOVERS et al, 2008).
A melanina também é um importante indicador de virulência deste fungo,
um dos principais fatores observados para o diagnóstico da doença, sendo analisada
a formação deste pigmento em meio ágar níger em todos os isolados manipulados
durante a realização deste estudo. Este pigmento, de acordo com Wang (1995),
também está relacionado, principalmente, no complexo de evasão ao sistema
imunológico do hospedeiro, tornando difícil as células imunológicas efetoras
realizarem a fagocitose das leveduras. Alguns estudos realizados sugerem que o
neurotropismo de C. neoformans esteja associado à capacidade deste microrganismo
de converter catecolaminas em melanina (Polacheck et al.,1982).
A prova de urease tem sido utilizada para diferenciar espécies de
dermatófitos bem como gêneros de Ascomycota como Candida de Basidiomycota
como Rodothorula, Malassezia e Cryptococcus (PAIXÃO et al., 2004). Todos os
isolados investigados neste estudo utilizando o meio ágar de Christensen foram
urease-positivos, demonstrando, assim, a utilidade do método. Cryptococcus
neoformans produz muitas enzimas de degradação, algumas das quais têm sido
confirmada como fator de virulência entre as quais a urease e fosfolipase B (KWON-
CHUNG et al., 2014). Embora haja alguns relatos de cepas do complexo C.
neoformans urease-negativas que produziram doenças em humanos, a maioria dos
isolados clínicos produzem grandes quantidades de urease (CONTIN et al., 2011).
Estudos conduzidos por Olszewski et al. (2004) indicaram que a urease contribui para
a habilidade do fungo em atravessar a barreira sangue-cérebro pelo aumento do
sequestro de leveduras dentro de “camas” microcapilares (microcapillary beds).
A sensibilidade à cicloheximida também foi analisada durante o estudo, não
havendo o crescimento das leveduras nesse meio de isolamento seletivo, confirmando
esta característica peculiar do fungo, similar aos resultados de Gomes et al. (2010)
em suas análises de amostras clínicas. De acordo com Kwon-Chung (1998), a maioria
das espécies do complexo C. neoformans/C.gatii são sensíveis a ≤12 µg de
cicloheximida.
Em suma, os isolados ambientais analisados, demonstram as principais
características fenotípicas das espécies ora identificadas, apresentando diferenças
apenas quanto à termotolerância de seis cepas que se mostraram sensíveis a 37°C.
 21

6 - CONCLUSÕES

Os resultados obtidos demonstraram que os isolados analisados

apresentaram as principais características fenotípicas do complexo Crytococcus
neoformans/Cryptococcus gattii.
Considerando que cápsula, melanina, urease, são fatores de virulência,
conclui-se que as cepas de origem ambiental apresentam importantes fatores de
virulência que contribuem para a habilidade de causar infecção.
Em relação à termotolerância houve diferenças entre os isolados, porém a
maioria apresentou capacidade de crescer à temperatura corporal indicando que
isolados ambientais tem potencial para produzir infecção sistêmica.
Estes estudos podem subsidiar outras investigações que busquem
conhecimento dos agentes da criptococose em seu habitat natural e sua correlação
com a incidência da criptococose nesta região ainda com poucos relatos sobre estas
leveduras.
 22

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