Moléculas versus morfología en la evolución aviar: el caso

de las aves "pelecaniformes"

Hasta hace poco, los caracteres morfológicos han sido la principal y prácticamente la única
fuente de evidencia para organizar las especies en categorías más grandes en la
construcción de clasificaciones. El tradicional orden Pelecaniformes (pelícanos, cormoranes,
anhingas y dardos, bobos y alcatraces, fragatas y trópicos) se ha definido por el pie
totipalmato, en el que el hallux se gira hacia adelante y se conecta mediante una red al
dígito II, además del telas entre los dígitos II y III y entre III y IV. En otras aves con patas
palmeadas, solo los tres dedos frontales (dígitos II, III, IV) están conectados por redes, y el
hallux está libre o ausente; Ningún pájaro tiene cinco dedos. De las aves totipalmadas,
todas menos las aves tropicales tienen una bolsa gular obvia; la bolsa gular de la fragata es
inflable y se usa en exhibición, por lo que difiere de las de las otras especies. La
combinación de pies totipalmados y bolsa gular parece tan poco probable que evolucione
más de una vez que la monofilia del grupo ha sido ampliamente aceptada desde que Linneo
(1) los colocó en los géneros Pelecanus (pelícanos, cormoranes, piqueros, anhingas y
fragatas) y Faetón (aves tropicales). También comparten la ubicación de la glándula
excretora de sal dentro de la órbita en lugar de en un surco supraorbital, y carecen de un
parche de incubación que está presente en todas las demás aves marinas y acuáticas. Sin
embargo, varían en la musculatura pélvica, la disposición de la arteria carótida y varios otros
caracteres anatómicos. Las similitudes defienden la monofilia; Las diferencias aumentan la
posibilidad de polifilia. El pie aviar palmeado con dos ​redes entre los tres dedos frontales ha
evolucionado en grupos con orígenes separados, por ejemplo, patos, gaviotas, flamencos y
albatros. ¿Podría la condición totipalmato, que ocurre en menos especies, también tener
múltiples orígenes? Sibley y Ahlquist (2) revisaron la literatura desde 1758 hasta 1990. Se
han realizado muchos estudios morfológicos de los pelecaniformes; los de Lanham (3), Saiff
(4) y Cracraft (5) se encuentran entre los más recientes. Lanham (3) reconoció su diversidad
pero concluyó que las aves totipalmatas forman un orden natural. Asignó a Phaethon y
Fregata para separar subórdenes, los otros géneros al suborden Pelecani, y sugirió que los
parientes más cercanos de los pelecaniformes son los procellariiformes (cizallas, petreles y
albatros). Saiff (4) estudió la región del oído medio de las pelecaniformes y de las garzas y
cigüeñas. Llegó a la conclusión de que el Shoebill (Balaeniceps rex) (Fig. 1), que vive en los
pantanos de África central, está más estrechamente relacionado con los pelecaniformes que
con las garzas y las cigüeñas, y que Faetón se parece a los procellariiformes pero está
bastante lejos de ellos. . Cracraft (5) realizó un "análisis filogenético ... para evaluar la
monofilia de los pelecaniformes y determinar las relaciones interfamiliares dentro del orden".
Analizó 52 caracteres con métodos "numéricos cladísticos" y concluyó que "la monofilia
pelecaniforme estaba altamente corroborada, con 12 sinapomorfías postuladas que
respaldaban la hipótesis". (Fig. 2 superior). Sibley y Ahlquist (2) compararon los genomas
de especies representativas de pelecaniformes y otros grupos principales de aves vivas con
la ​técnica de hibridación de ADN-ADN​. La mayoría de los resultados coincidieron con las
clasificaciones basadas en caracteres morfológicos, pero varios no estuvieron de acuerdo
(Fig. 2 inferior). Una de las salidas más sorprendentes fue la evidencia de que los pelícanos
están más estrechamente relacionados con el Shoebill (Fig. 1) que con las otras aves
totipalmatas. Sin embargo, esta no fue la primera sugerencia de una relación cercana entre
los pelícanos y el Shoebill. Además del estudio de Saiff (4), señalado anteriormente, Cottam
(8) realizó un estudio osteológico de Shoebill, garzas, cigüeñas y pelecaniformes y concluyó
que Shoebill "podría ocupar una familia monotípica en la Orden Pelecaniformes,
posiblemente cerca los Pelecanidae ". JM Lowenstein, de las comparaciones de
radioinmunoensayo de proteínas, concluyó que Pelecanus no está estrechamente
relacionado con los otros taxones de totipalmato. Lowenstein estaba tan sorprendido por
sus resultados que supuso que el material debía haberse degradado y no publicó sus datos,
pero dio permiso a Sibley y Ahlquist para hacerlo (ref. 2, págs. 500-502). Sibley y Ahlquist
(ref. 2, págs. 502-503) concluyeron que "este grupo puede presentar las preguntas más
complejas y controvertidas en la filogenia aviar. Es posible que el pie totipalmato, la falta de
un parche de incubación, la glándula de sal intraorbital , y otros personajes compartidos han
evolucionado más de una vez o son personajes primitivos que se han perdido en los otros
linajes de los Ciconiides? Esta explicación será rechazada por la mayoría de los morfólogos,
pero debe considerarse como una hipótesis alternativa a la monofilia. de las aves
totipalmatas. Instamos a que la posibilidad de la polifila se pruebe mediante estudios
independientes de las moléculas y la morfología. Cualquiera que sea la respuesta correcta,
será instructivo ". En este artículo presentamos los resultados de las comparaciones entre
las secuencias de ADN del mitocondrial 12S rRNA y 16S rRNA genest de 16 taxones
aviares, incluidos los géneros totipalmate. Estos resultados proporcionan evidencia
adicional de que el tradicional Orden Pelecaniformes es polifilético.

MATERIALES Y MÉTODOSADN

Se obtuvieron secuencias dede porciones de dos genes mitocondriales (12S rRNA y 16S
rRNA), con un total de 1.7 kb de secuencia alineada, de cada una de las siguientes 15
especies de aves: Buitre egipcio (Neophron percnopterus), Grebe jorobado (Podiceps
auritus) ), Tropicbird de pico rojo (Phaethon aethereus), Bobo de patas azules (Sula
nebouxii), Cormorán neotrópico (Phalacrocorax brasilianus), Cigüeña negra (Cico- 'nia
nigra), Cóndor de California (Gymnogyps californianus), Cóndor andino (Vultur gryphus) ,
Fragata magnífica (Fregata magnificens), Zapatero (Balaeniceps rex), Pelícano pardo
(Pelecanus occidentalis), Pingüino Adelie (Pygoscelis adeliae), Loon común (Gavia immer),
Loon de garganta roja (Gavia stellata) y Gran Shearwater (Puffinus gravis) ) Las secuencias
correspondientes de una gallina doméstica (Gallus gallus; número de acceso X52392) y un
cocodrilo americano (Alligator mississippiensis; número de acceso L28074) se obtuvieron de
las bases de datos para la comparación. Las regiones secuenciadas corresponden a los
sitios 1760-2128 (12S rRNA) y 2797-3995 (16S rRNA) en la secuencia publicada de Gallus
gallus (9). Los nombres latinos e ingleses de las aves son de la ref. 10. El ADN se amplificó
(PCR) con el uso de cebadores hechos en regiones conservadas entre vertebrados, y estos
mismos cebadores se usaron para la secuenciación de didesoxinucleótidos de ambas
cadenas complementarias. Los 10 cebadores (cinco pares) utilizados fueron 12L5 / 12H4,
16L2a / 16H10, 16L9 / 16H3, 16L1 / 16H13 y 16L4 / 16H12 (11); los no descritos
anteriormente son 16H12 (TTA GGG AGA GGA TTT GAA CCT CTG) y 16H13 (CCG GTC
TGA ACT CAG ATC ACG TA). El par de cebadores de ARNr 12S da como resultado un
fragmento de aproximadamente 400 pb que corresponde a la región descrita en la ref. 12.
Los cuatro pares de cebadores de ARNr 16S producen fragmentos superpuestos que,
cuando se unen, corresponden aproximadamente a 1,2 kb de ese gen de 1,6 kb. El ADN
bicatenario se amplificó (Perlkn-Elmer GeneAmp PCR System 9600) en 25-30 ciclos (940C
durante 15 s, 50'C durante 15 s, 720C durante 45 s) y el ADN monocatenario en 30-35
ciclos ( Temperatura de recocido 55-600C). El ADN bicatenario se purificó en gel y se usó
como plantilla para amplificaciones monocatenarias, con uno de los dos cebadores como
limitantes (1: 100). El ADN monocatenario se filtró con filtros de corte de 30 kDa (Millipore)
antes de la secuenciación con la ADN polimerasa Taq. La alineación de secuencia se
realizó con ESEE (13), y las dos regiones secuenciadas se combinaron para todos los
análisis. Las secuencias alineadas se analizaron con MEGA (14). Los análisis de unión de
vecinos (15), excepto como se indicó, se realizaron con la distancia de Jukes-Cantor (16), y
en la prueba se infirió la confianza estadística de los nodos en los árboles para determinar
la importancia de la diferencia entre la longitud de la rama y cero, expresada como el
complemento de la probabilidad o probabilidad de confianza (PC; referencias 14 y 17). Los
sitios que contienen vacíos y ambigüedades no se incluyeron en los análisis de distancia. El
análisis de parsimonia se realizó con MEGA y PAUP (7), y se incluyeron sitios que
contenían lagunas y desigualdades.

RESULTADOS

Todos los taxones. Las secuencias combinadas de los dos genes mitocondriales
totalizaron 1699 sitios alineados (12S rRNA, 388 pb; 16S rRNA, 1311 pb), incluidos 832
sitios variables y 516 sitios de parsimonia. El análisis filogenético de 16 taxones aviares
(incluido Gallus) con Alligator como raíz dio como resultado un árbol (Fig. 3) que no admite
la monofilia de los "Pelecaniformes" pero concuerda en muchos aspectos con la evidencia
de la hibridación del ADN. En particular, el pelícano se agrupa con el Shoebill, no con el
bobo y el cormorán; los buitres del Nuevo Mundo están más cerca de las cigüeñas y los
pelícanos que de los buitres del Viejo Mundo; y los bribones están más cerca de la cizalla
que del zampullín. Un grupo que contiene los pingüinos, las cigüeñas, los buitres del Nuevo
Mundo, las fragatas, las cizallas, los pelícanos, el Shoebill y los bribones tiene un fuerte
apoyo (CP = 98%) y está de acuerdo con Sibley y Ahlquist (2), quienes los reunieron en el
Parvorder Ciconiida de La Orden Ciconiiformes. Por lo tanto, la evidencia total de ADN
indica que estos grupos de aves comparten una ascendencia común relativamente reciente,
aunque su diversidad morfológica sugiere mayores diferencias filogenéticas. Algunos de los
resultados del análisis de secuencia de ADN no concuerdan con la evidencia de hibridación
de ADN. Los cóndores se agrupan con la fragata (PC = 98%) en lugar de con la cigüeña.
Una alianza entre los buitres y las cigüeñas del Nuevo Mundo cuenta con el apoyo de la
anatomía (18) y un análisis de las secuencias mitocondriales del citocromo b (19), aunque
esos dos estudios no incluyeron comparaciones con un fragata. Los cóndores y las fragatas
parecen tener poco parecido entre sí y no han sido sugeridos como parientes cercanos. Se
requieren datos adicionales para aclarar esta alianza inesperada. 0 0.1 d FIG. 3. Relaciones
filogenéticas de aves y parientes "pelecaniformes" inferidas de secuencias de ADN de los
genes mitocondriales 12S rRNA y 16S rRNA (1.7 kb). El árbol fue construido por el método
de unión de vecinos con la distancia de Jukes-Cantor (d); Los valores de probabilidad de
confianza (CP) se indican en los nodos. Para comparar con la Fig. 2, tenga en cuenta que
los cóndores son buitres del Nuevo Mundo y que el agua de esquileo es un petrelo. El
trópico se agrupa (CP = 93%) con otras dos aves totipalmadas (bobo y cormorán), aunque
en el árbol de hibridación de ADN (Fig. 2 inferior) apareció como el taxón más divergente de
los "pelecaniformes". Una porción más pequeña de la región 16S rRNA (1.1 kb) fue
secuenciada (SBH, resultados no publicados) en otro totipalmato, el Darter africano
(Anhinga rufa), y en un análisis restringido de esa región en todos los taxones (no mostrado)
se agrupó con el grupo de boobycormorant, como se esperaba. La evidencia de hibridación
morfológica y de ADN (Fig. 2) también coloca a los bobos, cormoranes y ligueros (también
llamados anhingas) en un grupo monofilético. Una característica notable de la secuencia de
ADN filogenia (Fig. 3) es la corta longitud de muchas ramas internas. Esto también es
evidente en el árbol de hibridación de ADN (Fig. 2 inferior) y en un análisis de secuencias de
citocromo b (19), lo que sugiere que muchas de las divergencias en este grupo ocurrieron
durante un período de tiempo relativamente corto. Las radiaciones rápidas requieren
secuencias largas de ADN para resolver todos los nodos, por lo tanto, aunque estos datos
responden algunas preguntas, se necesitarán más sitios para una resolución completa de
esta filogenia. El uso de otras correcciones de distancia (Kimura, Tajima-Nei, Tamura,
Tamura-Nei e y; parámetro y = 0.80, calculado a partir de los datos) con la unión de vecinos
produjo resultados casi idénticos, con solo una reordenación menor entre los nodos que
muestra una resolución pobre en Fig. 3. El análisis de parsimonia sin ponderar y con
transversiones ponderadas 10 transiciones cada una dio como resultado un árbol diferente,
el más parsimonioso. En ambos casos, el pelícano se agrupó con el Shoebill, los buitres del
Nuevo Mundo estaban más cerca de las cigüeñas y los pelícanos que de los buitres del
Viejo Mundo, y los bribones estaban más cerca del agua de esquileo que del zampullín. El
árbol de parsimonia ponderado es casi idéntico al árbol de unión del vecino, excepto que el
buitre del Viejo Mundo (Neophron) se agrupa con el pájaro tropical y en regiones donde el
orden de ramificación está mal resuelto en la Fig. 3. Las limitaciones estadísticas del
análisis de parsimonia ponderada tienen discutido en otra parte (20, 21).

Subconjuntos de Taxa. La resolución filogenética puede aumentar cuando se analizan

subconjuntos de taxones. En este caso, el conflicto entre la morfología y las moléculas en
las aves "pelecaniformes" y sus parientes puede reducirse a preguntas que requieren solo
pequeños subconjuntos de taxones. En cada subconjunto, se incluyó el galliforme (Gallus),
el árbol se enraizó con Alligator y se analizaron cada uno de los ocho taxones ciconidianos.
Las afinidades del pelícano se probaron comparando solo el pelícano, el bobo, el cormorán
y otro taxón. La mayor confianza estadística (99%) para la agrupación del pelícano con
algún otro taxón se obtuvo con el Shoebill (Fig. 4A). En otros subconjuntos, el pelícano se
agrupó con el pingüino (94%), el bribón común (94%), el bribón de garganta roja (86%), el
esquileo (86%) y la cigüeña (74%). El pelícano era un taxón hermano del grupo de
cormoranes bobos cuando se incluía la fragata (86%), el Cóndor Andino (76%) o el Cóndor
de California (74%). A menudo se ha propuesto una alianza entre bribones y colimbos, pero
Stolpe (22) encontró diferencias sustanciales entre ellos en la musculatura de las
extremidades posteriores y la anatomía esquelética. Muchos ornitólogos aceptaron la
convergencia como la explicación de las similitudes entre estos dos grupos de aves
buceadoras, pero Cracraft (23) rechazó el trabajo de Stolpe como irrelevante y concluyó que
los bribones y los zampullines son parientes cercanos. Sin embargo, una alianza de
lobo-grebe no es compatible con la hibridación de ADN (Fig. 2). Esta pregunta se probó en
el presente estudio al incluir solo los dos bribones, el colimbo y otro taxón. En todos los
casos, se rompió la alianza loon-grebe y los bribones se agruparon con el taxón agregado
(Fig. 4B): cizalla (98%), pelícano (98%), cóndor de California (98%), cigüeña (98%), Cóndor
Andino (97%), Zapato (96%), fragata (93%) y pingüino (86%). La monofilia de las aves
rapaces diurnas (falconiformes) se probó incluyendo solo el buitre del Viejo Mundo, los dos
cóndores A y otro taxón. En todos los casos, se descubrió que los falconiformes eran
polifiléticos (Fig. 4C) y los cóndores agrupados con el taxón agregado: Shoebill (99% 6),
shearwater (99%), fragata (99% o), Common Loon (97% ), cigüeña (96%), pingüino (94%),
Loon de garganta roja (79% o) y pelícano (73%). Correlaciones entre métodos. La técnica
de hibridación ADN-ADN mide el grado de similitud de secuencia entre genomas completos
(2). Aunque las secuencias de ADN en el presente estudio examinaron solo una pequeña
porción (1,7 kb) de los genomas de estas aves, es posible comparar las estimaciones
cuantitativas de divergencia genética producidas por estos dos métodos. Para la medición
de la secuencia de ADN, utilizamos la distancia de Kimura (solo transversiones, para evitar
sesgos de transición), y para la hibridación de ADN, los valores de AT50H se tomaron de
los promedios en la ref. 2, figuras 357-368. Los dos métodos están altamente
correlacionados (Fig. SA; r2 = 0.90; r2 = 0.72 cuando se usa un subconjunto más pequeño
de valores de AT5OH por pares). El conjunto de datos morfológicos para estas aves (tabla 1
de la referencia 5) se convirtió en una matriz de diferencias por pares para comparar la
divergencia morfológica con la molecular. Como se esperaba de los resultados
filogenéticos, la correlación es pobre [con la secuencia de ADN, r2 = 0.01 (Fig. SB); con
hibridación de ADN, r2 = 0.23 (Fig. SC)]. Tanto el análisis de unión de vecinos como el de
parsimonia pueden explicar algunas diferencias de frecuencia, por lo tanto, una mala
correlación entre la distancia morfológica y molecular no necesariamente indica que esté
proporcionando una estimación pobre (o diferente) de la filogenia. Sin embargo, en este
caso, las estimaciones de la filogenia difieren y existe un mejor acuerdo entre las dos
técnicas moleculares que entre ambas y la morfología.

DISCUSIÓN

Los datos de la secuencia de ADN respaldan los resultados anteriores de la hibridación de

ADN (2) que indicaron que ​el pie totipalmato, la bolsa gular y varios otros caracteres
morfológicos de diagnóstico de los Pelecaniformes de Orden tradicionales no son útiles para
inferir filogenia. En cambio, se encuentra que los pelícanos y las fragatas están más
estrechamente relacionados con las aves con diversas morfologías, como el zapato, los
cóndores, los pingüinos, las cigüeñas, los bribones y las cizallas. Se propuso una Orden
Ciconiiformes ampliada, que combinaba ocho órdenes previamente reconocidas, (2, 24)
para reflejar los resultados del estudio de hibridación de ADN. Los datos de la secuencia de
ADN incluyen taxones que representan siete de las ocho órdenes y respaldan este cambio
importante en la clasificación de las aves. Ejemplos adicionales que apoyan la clasificación
de Sibley et al. se anotan en la ref. 25. Se han sugerido dos enfoques, "evidencia total" y
"congruencia taxonómica", para resolver los conflictos entre las estimaciones moleculares y
morfológicas de la filogenia. Los defensores del método de evidencia total sugieren
combinar todos los datos morfológicos y moleculares en un solo análisis para producir una
estimación única de la filogenia (26). Además de los problemas estadísticos relacionados
con la combinación de datos de secuencia de ADN con caracteres morfológicos, este
método adolece del hecho de que la respuesta está determinada menos por la verdadera
filogenia que por el conjunto de datos con la mayoría de los caracteres, aunque se ha
sugerido ponderación de caracteres (27) ) Los defensores de la congruencia taxonómica
sugieren buscar entre las filogenias en conflicto las regiones de acuerdo para obtener un
consenso (28). Esto evita el problema del tamaño, pero impone una ponderación desigual
de los caracteres y da como resultado una falta de resolución si hay un desacuerdo grave.
Algunos han propuesto combinar elementos de ambos enfoques (29, 30). Cuando los datos
moleculares producen una filogenia robusta que entra en conflicto con la morfología,
sugerimos un tercer enfoque: reevaluar la evidencia morfológica. En tales casos, es
probable que los caracteres morfológicos supuestamente derivados sean primitivos
compartidos o convergentes. A diferencia de la morfología, una proporción considerable de
la variación de nucleótidos es selectivamente neutra (p. Ej., Sitios sinónimos, pseudogenes
y muchas regiones no codificantes y algunas regiones codificantes), por lo que es
improbable una convergencia significativa a nivel molecular. La convergencia morfológica
está muy extendida y bien documentada (p. Ej., Consulte la ref. 31), y deberíamos estar
encantados de encontrar ejemplos interesantes adicionales.