MICROBIOLOGlA APLICADA

Manual de Laboratorio

PRÁCTICA Núm. 7
ESTERILIZACiÓN POR CALOR SECO Y CALOR HÚMEDO

1. OBJETIVO

Demostrar la diferencia del efecto del calor seco y húmedo, usando como
indicador la viabilidad de una bacteria.

11. INTRODUCCiÓN

Existen diversos métodos físicos de esterilización y de inhibición del crecimiento

microbiano, como pueden ser el calor, la filtración y la radiación, pero el más
ampliamente usado es el calor, ya sea húmedo o seco, los cuales tienen diferente
penetrabilidad.

Conforme aumenta la temperatura por encima de la temperatura máxima de

crecimiento, se producen efectos letales en los microorganismos.

La muerte de las bacterias por el calor húmedo es consecuencia de la

desnaturalización de sus proteínas, en tanto que en una atmósfera seca se debe a
la oxidación de los constituyentes de la célula.

Los enlaces intracelulares e intermoleculares (puentes de hidrógeno), de las

proteínas de los cuales depende su funcionalidad, son más lábiles cuando las
proteínas están hidratadas que cuando no lo están, de tal manera que el "calor
húmedo" es más efectivo en la desnaturalización de enzimas y otros componentes
proteínicos importantes para la célula que el "calor seco".

Es por eso que se dice que el calor húmedo tiene mayor "penetrabilidad" que el
calor seco.

El calor, de cualquier forma, es utilizado extensamente como un agente letal

bacteriano y se puede aplicar a numerosos instrumentos, materiales y
substancias, con el propósito de matar a las bacterias que ellos contengan.

Este proceso se llama "esterilización" y al material, cultivo o medio de cultivo

sometido a éste, se le denomina entonces "estéril", es decir, desprovisto de toda
forma viviente.

El calor puede ser generado en diversos aparatos y por lo tanto se puede

esterilizar por calor húmedo y por calor seco.
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 Reduca (Biología). Serie Microbiología. 3 (5): 1-14, 2010
ISSN: 1989-3620

CONTROL DE LA ESTERILIZACIÓN

Los procesos de esterilización deben disponer de sistemas o mecanismos que

nos permitan garantizar y controlar que el proceso se ha realizado con éxito. Existen
diferentes mecanismos para ello:

Sistemas de control físico. Lo más básico es el control mecánico de las

temperaturas (sensor de temperatura) que permita realizar un registro de las
temperaturas alcanzadas en el interior durante todo el proceso. Son sistemas
requeridos en los laboratorios acreditados.

Sistemas de control químico. Son habitualmente sistemas constituidos por

cintas adhesivas impregnadas en compuestos químicos termosensibles,
sensibles a radiaciones o al óxido de etileno que cambian de color si el proceso
se ha desarrollado de forma correcta, es decir, si se ha alcanzado la
temperatura adecuada, si ha sido irradiado, o si ha estado expuesto a oxido de
etileno. Estás tiras se adhieren al material a esterilizar de forma que el cambio
de color supone una garantía de la temperatura alcanzada. Se utiliza de forma
rutinaria en los laboratorios de microbiología (Fig. 10).

Figura 10. Cinta adhesiva termosensible para el control de esterilización por calor.

Sistemas de control biológico. Se refieren a la utilización de microorganismos o

esporas resistentes a distintos procesos de esterilización, como temperaturas
elevadas, oxido de etileno, etc. Estas bacterias vienen preparados en tiras
impregnadas o en suspensiones en ampollas cerradas que se exponen al
proceso de esterilización, por ejemplo en autoclave, junto con el material que
se va a esterilizar. Una vez finalizado el proceso, se cultiva el microorganismo
en las condiciones habituales en microbiología. La ausencia de crecimiento
después de un tiempo prudencial de incubación en las condiciones adecuadas
significa que el proceso de esterilización es correcto. Para este fin se suele
trabajar con bacterias que forman endosporas por su especial característica de
resistencia (especialmente termorresistencia) a distintos procesos de

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CONSISTENCIA DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Atendiendo a su consistencia los medios se clasifican en: líquidos semisólidos

y sólidos.
La consistencia del medio de cultivo se logra con la adicción a la fórmula,
de un compuesto denominado AGAR.
El agar en malayo significa jalea. Es una sustancia mucilaginosa que se
obtiene de algas de color purpúreo. Perteneciente al grupo Agarofíto que com-
prende los géneros: Gellidium, Pteroclaida, Gracilaria, y Acanthopeltis, que pro-
liferan principalmente a lo largo de las costas de Japón, China, Ceilán, Malasia
y California meridional.
Las paredes de la planta posee una capa interna, de celulosa y otra más
eterna de sustancias pécticas. Para la producción de agar se extraen las capas
pécticas ricas en agarosa y agaropectina, para ser procesadas industrialmente,
siendo comercializado en forma deshidratada.
Bioquímicamente se trata de un éster sulfúrico de una molécula lineal
galáctano que es insoluble en agua fría pero soluble en agua caliente.
Una solución de 1,5 % de agar forma un gel firme entre 32 y 390 C que no
se funde por debajo de 850 C.
Como lo atacan muy pocas bacterias se emplea básicamente como
solidificante.

Medios líquidos

Los medios líquidos no contienen agar, siendo trabajados en forma de

caldo. Los microorganismos desarrollados en medios líquidos, se mueven con
libertad y su desarrollo provoca la formación de un enturbamiento difuso o
sedimento visible. Ejemplo: Caldo Selenito, agua, peptonada Alcalina, caldo
lactosado, etc.

Fig. 113: Diferentes formas de crecimiento en medios de cultivo líquidos.

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Medios semisólidos

Estos medios contienen un % de agar menor que el empleado para los

medios sólidos, lo que facilita una mayor migración de sustancias y la movilidad
de los gérmenes. Ejemplo: medio de "Cary - Blair" y agar semisólido para
motilidad.

Medios sólidos

Son medios de cultivo que contienen en su composición alrededor de 1,5 %

de agar, cantidad suficiente para la gelificación del medio. La solidez proporcio-
nada por el agar impide a los microorganismos su migración en el cultivo por lo
que se multiplican en un mismo sitio dando lugar a un cúmulo de millones de
descendientes que forman sobre el cultivo estructuras macroscópicas denomi-
nadas colonias de diferentes formas, aspectos y tamaños. Cada género y espe-
cie producirá un tipo de colonia con caracteres culturales diferentes, que
permitirán al investigador orientarse hacia la identificación ulterior de la espe-
cie. Teóricamente cada colonia se genera a partir una o varias bacterias de la
misma especie, aunque ocasionalmente pueden desarrollarse a partir de dos
especies distintas, lo que da lugar a la formación de colonias atípicas. Ejemplo:
Agar Saboreaud Dextrosa, Agar Violeta Rojo Bilis, Agar Sangre, etc.

Fig. 114: Medio de cultivo sólido distribuidos en placas de Petra: a) Medio sin sembrar;
b)Medio sembrado; c)Después de 24 horas de incubación (presencia de colonias).

De lo anterior expuesto se deduce que la cantidad de Agar añadida al medio

de cultivo será directamente proporcional al grado de solidez que adquiera el
medio.

COMPUESTOS NUTRITIVOS BASICOS

Como fue explicado anteriormente, uno de los objetivos de la nutrición

microbiana es la biosíntesis, mediante la cual el microorganismo degrada los
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