REVISTA ELECTRÓNICA DE INVESTIGACIÓN

EN EDUCACIÓN EN CIENCIAS
ISSN 1850-6666

Contribución a la investigación del azul de metileno como

contaminante de ambientes acuáticos mediante el
método de colorimetría.

Sofía Bocanegra Orozco​1​, ​Luisa Beatriz León Díaz​2​ ,​ ​Maria Paula Arévalo .3

sobocanegra@unal.edu.co , lbleond@unal.edu.co , mparevalog@unal.edu.co

123 ​
Departamento de Biología, Facultad de Ciencias, Sede Bogotá, Universidad Nacional de Colombia.
Carrera 45 N° 26-85 , Bogotá, Colombia.

Resumen

El presente artículo tiene como objetivo analizar la variación de la absorbancia de azul de metileno en relación
con su concentración con el fin de proveer una base de referencia para estudios de dicho colorante como
contaminante acuático. Para esto se realizaron seis diluciones de una solución stock de 20,7 ppm a las cuales
se les midió su absorbancia con un espectrofotómetro visible V1200 Mapada utilizando una longitud de onda
óptima de 650 nm, además se determinó la concentración desconocida en una muestra problema. La ecuación
de la recta fue y = 0, 188x + 2, 08 * 10 −3 y el coeficiente R2 = 0, 997 lo que indica que el instrumento
utilizado es de gran exactitud. Adicionalmente se concluye que el método de colorimetría para este compuesto
resulta poco fiable para concentraciones cercanas a 20,7 ppm por lo que se sugiere la utilización de éste
método para concentraciones inferiores a 0,01M.

Palabras clave:​ ​Azul de metileno, ley de Lambert-Beer, colorimetría, curva de calibración.

Abstract

The objective of this article is to analyze the variation of the absorbance of methylene blue in relation to its
concentration in order to provide a reference for studies of this dye as an aquatic contaminant. ​For this, six
dilutions of a 20.7 ppm solution were made and then its absorption was determined with a visible
spectrophotometer V1200 Mapada using an optimal wavelength of 650 nm, in addition to determining the
unknown concentration in a test sample. The equation of the line was y = 0.188x + 2.08 * 10-3 and the
coefficient R2 = 0.997 which indicates that the instrument has great accuracy.​In addition, it is concluded that
the colorimetric method for this compound is unreliable for concentrations close to 20.7 ppm, so the use of
this method is suggested for concentrations lower than 0.01M.

Keywords: ​Methylene blue, Lambert-Beer Law, colorimetry​,​ calibration curve.

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1.INTRODUCCIÓN
En los últimos años ha ido en aumento la preocupación
de distintos sectores de la sociedad respecto al impacto
ambiental de los distintos desechos químicos (también
llamados contaminantes emergentes) arrojados a los
cuerpos de agua ya sean de origen doméstico, urbano o
industrial (MSc Gil et al., 2012).
Dentro de éstos múltiples residuos se encuentra el Azul
de metileno ( C 16 H 18 Cl N 3 S ), un compuesto
aromático, heterocíclico y catiónico con varios usos
comunes como; antiséptico de uso tópico , tinte básico
para hongos, análisis químicos, algunos tratamientos
médicos y como colorante a nivel industrial.
(Castro-Acuña, 2016); sin embargo este compuesto
tiene un arsenal de efectos adversos en la naturaleza y
para las comunidades aledañas a las fuentes hídricas
contaminadas con este colorante, dado su potencial
carcinógeno (Castro-Acuña 2016) junto a algunas
sintomatologías negativas vistas en los humanos y
efectos mortales en las ratas a cierta concentración
(Avila, 2011)
Teniendo en cuenta tales perjuicios, la amplitud de uso
de este compuesto y la poca regulación frente a su
destinación final en el pasado se ha hecho urgente
encontrar medios eficientes para su separación en el
ambiente lo que lo ha hecho objetivo de varios estudios
como el de L. Lara (2017) que pretende extraer este
colorante mediante fitorremediación con Eichhornia
crassipes​, el de G. Acuña (2016) para su nano
degradación con cristales y otros como el de J
Iannacone (2007) respecto a la ecotoxicidad de este tipo
de colorantes.
Para que los resultados como los que se presentan en
los artículos mencionados anteriormente tengan validez
experimental y científica deben poseer un grado de
medición muy acertado que refieran a una alta
confiabilidad en los datos.(Henríquez, 2003). Por tal
motivo es importante utilizar métodos acertados, en este
caso, para obtener una medición de la concentración de
azul de metileno en un medio acuoso; por estas razones
uno de los métodos ampliamente usados es la
colorimetría que permite la toma de datos de manera
rápida, eficaz, no destructiva y a bajo costo
(Ayres,1970).
La colorimetría consiste en atravesar, con un haz de luz
monocromática, una muestra coloreada diluida de modo
que al comparar su absorbancia respecto a otras de
concentración conocida, en una curva de calibración,
sea posible hallar de manera aproximada el valor de
concentración de analito en la muestra de interés.
(Palomeque, et al 2018)
Los principios físicos de esta técnica se basan en la
interacción de las distintas longitudes de onda del
espectro visible con la materia aplicando los principios
de la ley de Bouguer y la ley Lambert-Beer. La primera
ley describe: a) una proporción entre la luz
monocromática transmitida (P) y la energía radiante
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incidente (P0) denominada Transmitancia, calculada
así: T= P/P0 , y b) un decrecimiento de la energía
transmitida a medida que el camino óptico (espesor o
concentración de la muestra) aumenta, denominando a
la energía resultante Absorbancia; La segunda expone
el mismo principio b) de la ley de Bouguer pero en
términos de que Absorbancia A se calcula como:
A=log(1/T) (Ayres, 1970).
Retomando la importancia de la confiabilidad de los
datos, es pertinente considerar las limitaciones de la
colorimetría en base a sus fundamentos físicos de la ley
de Lambert-Beer éstas son: 1) carencia de
monocromatismo de la luz incidente, y, 2) Cambios
químicos en el sistema, de tal forma que las especies
absorbentes no representan la totalidad de la
concentración. Las desviaciones causadas por estas
limitaciones son muy poco significativas en
concentraciones menores a 0,01M (Ayres, 1970)
Así, a modo de contribución a estudios futuros sobre
este tema, en este artículo se pretende brindar un marco
referencial para la utilización de colorimetría para
hallar la concentración de Azul de Metileno de manera
óptima.
2.METODOLOGÍA
A partir de una disolución madre de 20,7 ppm de azul
de metileno se tomaron alícuotas de 0,5;1;1,5;2,0 y 2,5
ml, con el fin de llevar cuantitativamente su volumen a
10 ml, obteniéndose así, 5 nuevas muestras con un
factor de dilución de 20, 10, 6,67, 5 y 4,
respectivamente. Posteriormente se realizó una muestra
más diluida con un factor de dilución de 200 con
respecto a la solución stock.
Para hallar la concentración de las diluciones se utilizó
la fórmula C f = V Vi *fCi , siendo Ci la concentración de la
disolución de partida, Vi el volumen de la alícuota, Vf
el volumen final (10,00 ml para todos los casos) y Cf la
concentración final.
Para conocer la longitud de onda de trabajo (λmáx) se
midió la absorbancia de la solución stock en un
Espectrofotómetro Visible V1200 en un rango de
longitudes de onda ​350-700 nm​. Con estos datos se
pudo hacer una gráfica de absorbancia como función de
longitud de onda, y la curva obtenida se conoce como el
espectro de absorción o curva espectral.
Con el valor de λmáx se midió la absorbancia de las 6
diluciones y se hizo una gráfica de absorbancia en
función de la concentración (curva de calibración)
basándose en el modelo de ajuste por una línea recta
definido por la ecuación y = mx + b
Finalmente se determinó la concentración de un analito
en una muestra problema m1 midiendo su absorbancia
y reemplazandola en la ecuación de la recta.
Para el análisis estadístico de los resultados obtenidos y
la generación de gráficas se utilizó Excel 2013.
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3.RESULTADOS Y ANÁLISIS
3.1. Análisis de la curva espectral de una disolución
de azul de metileno de concentración 20,7 mg/L.
Teniendo en cuenta los valores reportados en la tabla 1,
se obtuvo la gráfica del espectro de absorción.
Figura 1​. Curva espectral de la disolución stock. (Datos
propios)
El rango de longitudes de onda utilizadas se encuentra
en la región visible del espectro electromagnético,
región de longitudes de onda que puede ver el ojo
humano; esto es, donde la luz aparece como color. Por
lo tanto una solución absorbe una determinada λ ; en
este caso una solución que contenga azul de metileno es
azul porque absorbe el color complementario, el rojo,
de la luz blanca y transmite la luz azul restante.
(Christian, 2009).
La longitud obtenida para la óptima absorbancia de la
solución de azul de metileno concentrada fue de 660
nm, dato que concuerda con lo expuesto teóricamente,
puntos, lo que siempre es de esperar que suceda,
teniendo en cuenta los errores sistemáticos del equipo
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Tabla 1. ​Datos de absorbancia de la solución stock a
diferentes longitudes de onda.
ya que la longitud de onda absorbida en nm para un
color transmitido azul verdoso está en el rango de 620-
750 (Christian, 2009).
Además al comparar dicho valor con el propuesto según
Muñoz et al., (2008) de 664 nm, se evidencia su
similitud, lo que indica gran exactitud del instrumento
de medición. Sin embargo la longitud de onda
empleada en los posteriores análisis es de 650 nm dado
que se utilizó un promedio de los otros grupos de
trabajo. Esto se puede deber a que el espectrofotómetro
que se utilizó fue un modelo diferente al de los otros
grupos.
3.2. Análisis de la curva de calibración del azul de
metileno.
​Tabla 2. ​Datos para la curva de calibración
Figura 2​. Curva de calibración de una disolución de
azul de metileno.
Respecto a la recta generada, hay una relación lineal
entre la absorbancia (Y) y la concentración del analito
(X), cuando la ley de Beer-Lambert se cumple,
establecida como Y: mx + b.
Cualquier desviación de la línea recta de los puntos
individuales es resultado de un error de medición (Hess,
Kask , 1973). Se ve en esta gráfica, una ligera
dispersión de los
así como los errores personales en las medidas; pero la
linealidad general es buena, lo que indica que la ley de
3
Beer-Lambert es aplicable en este sistema (Ramette,
1983).
Según Ramette (1983), una absorbancia diferente de
cero para el agua destilada, (que es el “blanco” o
concentración 0) como en este caso, sea quizá porque
podría haber una ligera discrepancia entre ambas
especies que causan absorción disminuye hasta el punto
en que cada una afecta a la distribución de carga de sus
vecinas. Esta interacción , a su vez, puede alterar su
capacidad para absorber una longitud de onda de
radiación dada. Puesto que el grado de interacción
depende de la concentración, esto causa desviaciones de
la relación lineal entre absorbancia y concentración.
Por lo general, el efecto de las interacciones
moleculares no es significativo a concentraciones por
debajo de 0.01M, aunque se encuentran algunas
excepciones entre ciertos iones o moléculas de gran
tamaño, lo es así con la absortividad molar del catión
del azul de metileno a 436 nm, aumenta 88% a medida
que la concentración del colorante aumenta de 10^-5 a
10^-2 M; aún por debajo
de 10^-6 M , no se observa un estricto cumplimiento de
la ley de Beer (Skoog, 1986). Las concentraciones de
las diluciones medidas están en un rango de 10^-5 a
10^-7 M a 650 nm, cuando la absorbancia es mayor,
ubicándose dentro del rango.
Una medida de linealidad es el coeficiente de
correlación al cuadrado R 2 ,que se determinó con la
función de estimación lineal en Excel. Obteniéndose un
resultado de 0,997 que al ser mayor que 0,995 ​(Harris,
2003) indica un buen ajuste de los datos experimentales
respecto a la línea recta obtenida por mínimos
cuadrados.
3.3. Análisis de la solución problema M1.
La curva de calibración permite determinar la
concentración de soluto en una solución problema, para
ello a esta solución desconocida se le mide
e​xperimentalmente su absorbancia,​en este caso fue de
0,149 y se puede utilizar la ecuación de regresión
y = mx + b para despejar la concentración,
y−b
así: x = m ;
siendo x la concentración, y la absorbancia, m la
pendiente y b el intercepto con el eje y, al reemplazar se
obtiene
0,149−2,08*10 −3
x= 0,188
= 0, 781 ppm
Aunque la ecuación de Lambert- Beer predice que la
línea debe pasar por el origen, puede ocurrir como en
esta ocasión que no resulte así al utilizar datos
experimentales y b ≠ 0. (Solís, 2012). Estas
desviaciones de la proporcionalidad directa entre
absorbancia y concentración pueden deberse a el
instrumento utilizado para medir la absorbancia
(desviaciones instrumentales) o de cambios químicos
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cubetas, por sustancias extrañas en el o los reactivos, o
los reactivos tienen color propio.
Al describir sólo la absorción de las soluciones diluidas,
la Ley de Beer, en este sentido es una ley límite. En
altas concentraciones, la distancia media entre las
que ocurren cuando cambia la concentración
(desviaciones químicas). (Skoog, 2015)
​La concentración obtenida de 0,781 ppm es coherente
con la curva de calibración ya que al ver las
coordenadas de la gráfica se puede determinar que la
concentración desconocida está en el intervalo de 0,4 a
1 ppm.
CONCLUSIONES
- El método de colorimetría para este compuesto
resulta poco fiable para concentraciones
cercanas a 20,7 ppm por lo que se sugiere la
dilucion y utilización de éste método para
concentraciones inferiores a 0,01M, pues las
moléculas de azul de metileno son de gran
tamaño.
- La absorbancia de las diluciones están
directamente relacionadas con la
concentración, y se debe tener especial
atención al evitar una mayor concentración de
la muestra para que la Ley de Beer sea
aplicable, por tal se realizan diluciones que
puedan ser aplicadas.
- En el medio se puede calcular la concentración
de una sustancia encontrada, como por
ejemplo azul de metileno en cuerpos de agua,
cuantitativamente por su absorción.
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