UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA

ESCUELA DE CIENCIAS AGRICOLAS, PECUARIAS Y MEDIO AMBIENTE

MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL
INFORME

Preparado por:
YULEIS CASTRO
Código: 941112715252

Presentado a:
MARIA FERNANDA DOMÍNGUEZ

INGENIERIA AMBIENTAL
BUCARAMANGA, COLOMBIA
2014
 PRACTICA 01. METODOS DE SIEMBRA

INTRODUCCIÓN

La siembra de microorganismo es una técnica que permite el crecimiento de las

colonias de estos lo que facilita su estudio a través del microscopio, para lo cual
es necesario un ambiente de trabajo estéril, medidas de seguridad básicas,
muestras de los microorganismos de interés (hongos y bacterias) y medios de
cultivo enriquecidos.

En este laboratorio se emplearon agares con papa para cultivo de hongos

provenientes de estado de descomposición de fresas, papaya y pan, además se
contó con agares de glucosa para las bacterias que fueron tomadas de una
muestra de agua contaminada, se empleó la técnica de siembra en estría en
placa, se dejó a 37 ºC por algunos días.
 OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL.

Identificar y aplicar cada uno de los métodos de siembra empleados en

microbiología ambiental.

OBJETIVOS ESPECIFICOS

 Reconocer y analizar las diferencias en cada una de las técnicas de

siembra practicadas, además de su aplicabilidad.
 Determinar los pasos más importantes en el momento de realizar un
cultivo microbiano con el fin de mitigar errores en la manipulación de
muestras e instrumentos.
 Identificar cada uno de los materiales empleados en las diferentes
técnicas de siembra.
 MARCO TEORICO

¿Cómo se realiza el cultivo?

Sembrar es colocar una muestra de inóculo, en un medio de cultivo para obtener

el crecimiento de los microorganismos. Para ello se extiende la muestra sobre
caja de Petri, que contiene un gel (Agar) al que se han añadido las substancias
que necesitan los microorganismos para crecer. A esto lo llamamos medio de
cultivo.

La "incubación" del medio ya sembrado. En cada caso se requieren unas

condiciones específicas de oxígeno, temperatura, presión, etc. dependiendo del
caso.

Si el cultivo bacteriano tiene éxito, crecerán "colonias" de bacterias en el medio

de cultivo. Estas colonias tienen características de color, forma, tamaño etc.
propias de cada bacteria y esto nos ayuda a identificarlas. También se puede
someter a las bacterias de las colonias a pruebas bioquímicas o de otro tipo para
lograr su identificación. Algunas bacterias son muy difíciles de cultivar, otras
tardan mucho tiempo en crecer y algunas, finalmente, no se han conseguido
cultivar. [1] 1

 Sistemas de Siembra

• Esterilización de los instrumentos de trabajo y de los medios de cultivo.

• Que el inóculo no se contamine, modifique o destruya para lo cual se utiliza

calor directo, flameando las bocas de los tubos de ensayo, matraces, la pipeta
y demás elementos antes y después de su utilización.

• Esterilización del área de trabajo para evitar contaminaciones durante el

manejo del instrumental y de los medios de cultivo. Se utilizan la cámara de flujo
laminar. Si no se dispone de ella, se utiliza un mechero Bunsen. [1]

 Siembra de medio sólido a medio líquido

Marque correctamente los tubos con el número del grupo, sistema de siembra
utilizado y la fecha.

Para crear un ambiente de esterilidad encienda el mechero y trabaje siempre al

lado de él.

Esterilice un asa recta a la llama de un mechero y déjela enfriar

[1] Sánchez, M. (2012). Medios de cultivo y métodos de siembra. Recuperado 20-04-14

de http://www.slideshare.net/tmfvidal/medios-de-cultivo-mtodos-de-siembra
 Tome el tubo que contiene la muestra a sembrar, retire la tapa del tubo, flamee
la boca del tubo.

Introduzca el asa en tubo sin tocar las paredes y tome un poco de colonia del
cultivo, flamee nuevamente la boca del tubo, tápelo y déjelo en una gradilla.

Tome el tubo de caldo nutritivo estéril en el cual va a colocar la muestra,

destápelo, flameando la boca el tubo con el mechero e introduzca el asa con la
muestra obtenida. Realice movimientos de rotación con el asa para emulsionar
con el caldo las paredes del tubo.

Retire el asa, flamee la boca del tubo y tape. Esterilice el asa en el mechero
después de usarla. Incube los tubos a 37ºC por 24 horas. Observar el crecimiento
obtenido. Si no hay crecimiento el caldo queda transparente. [1]

Figura 1. Método de aislamiento por siembra por estría en placa

[2]

 Método de aislamiento por siembra por estría en placa.

Para obtener un cultivo axénico:

(a) esterilizar un asa de siembra por flameado en la llama de un mechero.
(b) introducirla en la suspensión bacteriana para recoger una muestra
(c) sembrar haciendo estrías sobre la superficie de un medio sólido en
una placa Petri
(d) volver a esterilizar el asa, tocar en la zona de la placa ya sembrada y
hacer un segundo grupo de estrías en una región nueva de la placa.
Repetir el proceso una tercera y una cuarta vez, hasta conseguir que los
grupos de células se diluyan y se separen células aisladas.
(e) Después de la incubación, se desarrollan colonias aisladas. Para estar
seguro de que el cultivo es puro, repetir el proceso entero; para ello tomar
una colonia aislada y sembrar por estrías una segunda placa. [1]
  2Siembra de medio líquido a sólido. Se procede en la misma forma
que en la siembra anterior pero con el asa de argolla. Si la siembra es
en tubo recuerde hacer punción y estría. Si es en caja de Petri puede
utilizar diferentes sistemas como estría, agotamiento, rejilla con el fin de
lograr un cultivo puro. [1]

 Siembra de medio sólido a sólido. Se realiza de la misma forma que

en la siembra anterior pero utilizando el asa recta. Los medios sólidos
contienen agar en proporción de 1.5 a 2.0% y se emplean para obtener
colonias aisladas. Las placas de agar se pueden inocular mediante varios
métodos: como estrías, agotamiento y rejilla con el fin de lograr un cultivo
puro. [1]

 Siembra en rejilla. Realice una estría que atraviese el centro del agar.
Luego realice estrías en ángulo recto con respecto a la estría inicial.
Voltee el agar en ángulo de 90 grados y realice estría hasta cubrir todo
el agar. [1]

 Siembra por agotamiento. Tome una placa de agar, marque la base de

la caja de Petri con los números 1, 2 y 3. Coloque la muestra a sembrar
en el número 1, realice estrías hasta la mitad de la caja. Esterilice el asa
y gire la caja hasta el número 2, tome las dos últimas estrías y siga
estriando hasta el número 3. Gire la caja y termine de estriar, tenga
cuidado de no tocar las estrías ya hechas. [1]

 Siembra por estrías

[3]

Técnica de siembra en medio de cultivo en placa de Petri

 Siembra masiva. Tome un hisopo estéril e introdúzcalo en el tubo que

contiene la muestra a sembrar, luego frote toda la superficie del agar. Le

[2] Imágenes del método de aislamiento. Tomadas el 15 -04-2014 de

http://aulavirtual.usal.es/aulavirtual/demos/microbiologia/unidades/documen/uni_02/56/fig/fig31
9.jpg
[3] imágenes de siembra por estrías. Tomado el 15-04-2014
de http://www.umce.cl/delgenalaproteina/modulos/modulo04/modulo04_clip_image00.jpg
[4] López, M & Vinasco, M. (2011). Modulo didáctico de microbiología
ambiental. Universidad Nacional Abierta y a Distancia “Unad”. Bogotá.
Recuperado 10-04-2014 de
http://datateca.unad.edu.co/contenidos/201504/contLinea/index.htm
 evaluación del crecimiento en las placas de agar se hace a través de la
observación de colonias en la superficie. [1]

 Siembra en agar inclinado.

Por punción: Introduzca el inoculo con el asa recta hasta el fondo del
medio con un solo movimiento y teniendo cuidado de hacer el mismo trayecto
de entrada que de salida.
Por estría: Extienda el inoculo sobre el agar inclinado deslizando suavemente
el asa por la superficie en forma de zigzag. [1]

1. Siembra en profundidad. Marque la caja de Petri estéril con el número

de grupo, la fecha y siembra en profundidad. Abra ligeramente la caja de
Petri cerca del mechero.

 Abra un tubo con cultivo de bacterias y con ayuda de una pipeta de

Pasteur plástica, transfiera 1 ml de éste cultivo a la base de la caja de
Petri estéril. Descarte la pipeta en el frasco de boca ancha con clorox.

 Vierta un poco de agar nutritivo en la caja de Petri, tape la caja y luego

realice movimientos suaves sobre el mesón, en el sentido de las agujas
del reloj, luego al contrario, en forma de L y L invertida, y por último en
forma de 8. Esto garantiza una distribución homogénea de las bacterias
en todo el agar para facilitar su posterior recuento.[1]

 Envuelva las cajas de Petri y los tubos con cinta de enmascarar,

márquelos con el número de grupo, la fecha. Luego incube 37º c por 48
horas. [1]

2. Técnica del microcultivo

[4]

Figura 2. Imagen de la técnica del microcultivo de microorganismos

Esta técnica se utiliza en micología para el estudio de estructuras de los hongos

(conidias, ascas, hifas, conidióforos, entre otras) que son muy frágiles y se
deterioran fácilmente, al ser obtenidas para su observación a partir de un
macrocultivó común y corriente. [1]

La técnica consiste en colocar en el interior de una caja de Petri estéril unas

varillas de vidrio estéril y sobre ellas una lámina portaobjetos. Las varillas evitan
que la lámina portaobjetos haga contacto con el fondo de la caja de Petri. Luego
sobre el portaobjetos se coloca el medio de cultivo sólido. Con un asa
previamente flameada se siembra el hongo a analizar en el medio de cultivo,
después se cubre con la laminilla cubreobjetos, y se adiciona en el fondo de la
caja de Petri agua destilada estéril para mantener una atmósfera húmeda.
Después se procede a la incubación a la temperatura requerida y por el tiempo
necesario.

Luego de incubado se retira con cuidado la laminilla cubreobjetos teniendo en

cuenta que en ella se encuentra adherido el hongo. Se monta la laminilla con el
hongo a estudiar sobre un portaobjeto y se procede a su observación en fresco,
o se prepara un frotis con una preparación permanente. [1]

MATERIALES
1. Muestra contaminada con microorganismos
2. Agua peptonada al 0,1% estéril
3. Agar nutritivo en caja de Petri
4. Asa redonda
5. Gradilla
6. Mechero
7. Incubadora
8. Vinipel
9. Marcador de vidrio [5]

METODOLOGIA (SIEMBRA EN AGAR POR ESTRIAS)

Antes de iniciar es necesario esterilizar la zona de trabajo para lo cual, se prende

el mechero y preparar el material, posteriormente se prepara el agua peptonada
con 1 litro de agua destilada más 5 gramos de NaCl y 10 gr de peptona
bacteriológica, se mezcla y se deja homogenizar, para lo cual se deja de 25
minutos en incubación. [5]

[6]
[6]
Coge tubos de ensayo en ellos se vierte 10 ml de agua peptonada previamente
preparada, en estos se vierte la misma cantidad de agua contaminada que es la
muestra. [5]

3 [6] [6]

Una vez transcurrido el tiempo de incubación tomar el asa redonda y esterilizarla

por calor hasta que está se ponga roja, dejar enfriar cerca al mechero. [5]

[6]

El paso a seguir es abrir el recipiente con la muestra y tomar una asada. [5]

[5]Echeverry, L.C. (2013). Guía de laboratorio de microbiología ambiental. Universidad

Nacional Abierta y a Distancia “Unad”.Bogotá

[6] Fotografías tomadas en la realización de la práctica el 12-04-2014 en el laboratorio

del CEAD Bucaramanga.
 [6]

Luego con la mano izquierda se abre la caja de Petri con preparación de

Triglucosa de yodo realizar las estrías, se esteriliza el asa cada vez que se hace
el extendido. [5]

[6]

Para terminar se marcan las cajas Petri en el borde de la base y se envuelven

con papel vinipel, después se disponen boca abajo a 37ºC. Se desinfecta el área
de trabajo. [5]
Nota: todo el procedimiento se realiza cerca al mechero con el fin de disminuir
el riesgo de contaminación, se debe además tener los equipos de bioseguridad.

DIAGRAMA DE FLUJO (PARTE A)

Esterilizar el area

Tomar la muestra
•tubo de ensayo que contiene el agua peptonada
•Homogenizar

Incubación
•Tomar muestra con asa esterilizada
•Tomar caja petri seguir esquema
•Envolver
•Incubar a 37ºC
[5]

METODOLOGIA (SIEMBRA EN AGAR POR PUNCIÓN)

Tomamos los agares enriquecidos con anterioridad con papa-dextrosa para

realizar cultivos de hongos mediante la técnica de punción. [5]

[6]

Se ubica el agar en medio de dos mecheros y tomamos la fruta con la muestra

(fresa, papaya y pan). [5]

[6] [6]

[6]

Luego se procedió tomar el asa recta que se esteriliza al ponerlo en el mechero

hasta que se pone roja, se deja enfriar un poco, luego se toma una muestra
pequeña del hongo que se encontraba en cada uno de los alimentos ya
mencionado y esta es llevaba al agar para la siembra, posteriormente se
esterilizaba el asa y nueva mente se hace el procedimiento mencionado
anteriormente por 3 veces, formando un triángulo con cada punción en el agar
seleccionado. [5]

Seguidamente se marca el cultivo y se envuelve con vinipel, se dejan a

temperatura ambiente para la producción de colonias para su posterior
observación. Este mismo procedimiento se repite para cada muestra, es decir,
fresa, papaya y pan. [5]
DIAGRAMA DE FLUJO (PARTE B)

Selección
• Muestras a utilizar
• Agar enriquecido para (hongos)

Esterilización
• Area de trabajo
• Asa recta

Siembra
• Tomar uan pequeña cantidad de hongo
• Depositarlo haciendo un punto con la asa en el agar
• Repetir el procedimiento 3 veces para formar un
[5]

RESULTADOS Y ANALISIS.

A pesar de que en los procedimientos de las siembras se llevaron a cabalidad

cada uno de los pasos, resultado de colonias fue cero en los dos métodos
empleados porque no se pudo cumplir con la condición de temperatura todo el
tiempo puesto que en las instalaciones hubo un problema con la energía y la
incubadora de microorganismos se apagó por esto no pudimos analizar los
cultivos de bacterias y hogos que hicimos.
 CONCLUSIONES

En el desarrollo de la práctica se concluye que para la aplicación adecuada de

un método de siembra cualquiera es importante la utilización de los mecheros
como fuente de esterilización, además que para la realización de siembra de
estrías es necesario la utilización de un asa redonda ya que en ella queda una
buena parte de la muestra lo cual facilita su extendido, además como la asa solo
tiene contacto una sola vez con la muestra es necesario asegurarse que se
quede en esta.

Por otra parte se puede decir que la siembra de punción es la más idónea a la
hora de elegir un método para cultivo de hongos puesto que su crecimiento es
rápido y para observarlos en el microscopio es mejor que estén aisladas las
colonias.

Las condiciones ambientales en los métodos de cultivo son determinantes

puestos de que estas dependen fundamentalmente la reproducción de los
microorganismos así como ocurre con todos los seres abióticos existentes,
puesto que necesitamos de parámetros específicos para cada etapa de la vida.
 BIBLIOGRAFIA.

1 Sánchez, M. (2012). Medios de cultivo y métodos de siembra.

Recuperado 11-04-14 de http://www.slideshare.net/tmfvidal/medios-de-
cultivo-mtodos-de-siembra.

2 López, M & Vinasco, M. (2011). Modulo didáctico de microbiología

ambiental. Universidad Nacional Abierta y a Distancia “Unad”. Bogotá.
Recuperado 10-04-2014 de
http://datateca.unad.edu.co/contenidos/201504/contLinea/index.html.

3 Echeverry, L.C. (2013). Guía de laboratorio de microbiología ambiental.

Universidad Nacional Abierta y a Distancia “Unad”.Bogotá

4 Fotografías tomadas en la realización de la práctica el 12-04-2014 en el

laboratorio del CEAD Bucaramanga.
 PRACTICA 02. TÉCNICAS DE TINCIÓN.

INTRODUCCIÓN

Los microorganismos permiten fácilmente el paso de luz a través de sus

cuerpos, lo que los hace transparentes a la vista, a menos que contengan
pigmentos que permitan su observación en el microscopio. Es por ello que
debemos teñir a los microorganismos con compuestos que se fijen a sus
estructuras y les confieran color, estos compuestos son los colorantes.

Un colorante es un compuesto orgánico que tiene grupos cromófobos y

auxocromos unidos a anillos bencénicos, conformando lo que se conoce como
un cromógeno. Los grupos cromóforos son radicales que le confieren la
propiedad de color a los anillos bencénicos. El auxocromo es un radical que
imparte al compuesto la propiedad de disociación electrolítica, permitiendo con
esto la fijación del compuesto a diferentes materiales.

Para la tinción de las bacterias se pueden utilizar tinciones simples, diferenciales

y selectivas. Las primeras son aquellas en las cuales se utiliza un solo colorante
y éste tiñe todo el protoplasma de la célula, observándose ésta de un solo color
uniforme. Las tinciones diferenciales son aquellas en las cuales se utilizan dos
colorantes y generalmente un mordente (compuesto que permite fijar el colorante
a un material) que permiten establecer dos grupos de bacterias, uno que acepta
el primer colorante y otro que acepta el segundo colorante, lo que le da un valor
en la clasificación celular (ejemplo: Tinción de Gram y Tinción de Ziehl Neelsen).
Las tinciones selectivas utilizan también dos colorantes, pero uno de ellos tiene
afinidad por ciertas estructuras de la célula, lo que permite su observación
(ejemplo Tinción de esporas, de flagelos, de cápsula, de DNA, etc).

Cuando teñimos una bacteria requerimos hacer un frotis, es decir requerimos

colocar una pequeñísima muestra de una colonia bacteriana o una pequeña gota
de un cultivo líquido, sobre un portaobjetos, extenderla, dejarla secar y fijarla. En
este punto podemos teñir a nuestra bacteria y hacer la observación al
microscopio para conocer la morfología que pueden tener los diferentes
organismos.

Debido al tamaño de las bacterias, todas las observaciones se realizan al

microscopio con el objetivo de inmersión.
 OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL.

 Aplicar los conocimientos adquiridos en el curso para elaborar frotis que

permitan una observación correcta de algunos de los microorganismos
que se cultivaron en el laboratorio.

OBJETIVO ESPECIFICOS

 Practicar tinción simple, tinción diferencial y tinción especial a las

muestras echas en la práctica anterior.

 Analizar qué tipo de bacterias son.

 Identificar estructuras celulares de las bacterias.

 MARCO TEORICO

TÉCNICAS DE TINCIÓN

Las bacterias no teñidas muestran pocos detalles morfológicos; el diagnóstico

bacteriológico generalmente se basa en las diferentes afinidades tintoriales de
las bacterias por lo que para poder observar a los microorganismos es
necesario teñir la célula el cual resulta de un conjunto de reacciones
fisicoquímicos muy complejos, algunas reacciones pueden ser irreversibles y
otras no, por ejemplo algunos colorantes que han teñido en exceso pueden
eliminarse con disolventes adecuados.

La mayoría de los colorantes utilizados en microbiología son derivados de la

anilina, los colorantes están formados por uno o más anillos bencénicos
conectados por uniones químicas bien definidas (cromóforos) que están bien
asociados con la producción de color, teóricamente ciertos radicales químicos
poseen la propiedad de absorber la luz de diferentes longitudes de onda,
además poseen un grupo funcional llamado auxocromo que permite su unión a
componentes con carga contraria presentes en la célula.
Los colorantes se designan como ácidos o básicos, término que no indican
necesariamente sus reacciones de pH en solución, sino más bien si una parte
significativa de la molécula es aniónica o catiónica. Desde el punto de vista
práctico, los colorantes básicos tienen estructuras de naturaleza ácida.

En general, el proceso seguido en todas las tinciones conlleva las siguientes

etapas: extensión, fijación, tratamiento con colorantes y observación.

Extensión: Se realiza sobre un portaobjetos que ha de estar totalmente limpio.

Si la muestra es líquida se hace directamente y, si es sólida, hay que
resuspenderla previamente en una gota de H2O.

Fijación: Tiene por objeto adherir la muestra al portaobjetos y desnaturalizar

las proteínas para facilitar la acción del colorante. Normalmente se realiza con
calor, pasando la muestra repetidamente a 10 cm de la llama del mechero.

Tinción: Se realiza añadiendo los colorantes sobre los microorganismos

sometidos a los procesos anteriores. Puede ser de varios tipos:

TINCIÓN NEGATIVA:
Los colorantes no tiñen el microorganismo, sino el entorno, aumentando de
este modo su contraste. La muestra se extiende sobre una gota del colorante
(nigrosina).4[1]

[1] Biblioteca upibi.tecnicas microbiológicas pate 1 pdf. Reuperado 03-o5- 2024 de

http://www.biblioteca.upibi.ipn.mx/Archivos/Material%20Didactico/T%C3%A9cnicas%20microbi
ol%C3%B3gicas/T%C3%A9cnicas%20Microbiol%C3%B3gicas%20Parte%201.pdf
TINCIÓN SIMPLE:
Se utiliza un solo colorante que puede ser de cualquier tipo. Al igual que la
tinción negativa, sólo nos permite observar la forma, el tamaño y el tipo de
agrupación de las células. [5[[[1]

TINCIÓN DIFERENCIAL:

Se utilizan varios colorantes combinados. Las estructuras celulares se

diferencian en función de los diferentes colorantes que fijan de acuerdo con su
propia constitución química. Los ejemplos clásicos serían la tinción de GRAM o
la de Ziehl-Neelse

La tinción de Gram es uno de los métodos de tinción más importantes. Se utiliza

para diferenciar la morfología celular bacteriana (cocos, bacilos, positivos,
negativos.). Esta tinción se denominada así por el bacteriólogo danés Christian
Gram, quien la desarrolló en 1844.

Sobre la base de su reacción a la tinción de Gram, las bacterias pueden dividirse

en dos grupos, Gram-positivas y Gram-negativas (en este caso, los términos
positivo y negativo no tiene nada que ver con carga eléctrica, sino simplemente
designan dos grupos morfológicos distintos de bacterias). Las bacterias Gram-
positivas y Gram-negativas tiñen de forma distinta debido a las diferencias
constitutivas en la estructura de sus paredes celulares. [2]

TINCIÓN ESPECIAL:

Una tinción o coloración es una técnica auxiliar utilizada en microscopía para

mejorar el contraste en la imagen vista al microscopio. Los colorantes y tinturas
son sustancias que usualmente se utilizan en biología y medicina para resaltar
estructuras en tejidos biológicos que van a ser observados con la ayuda de
diferentes tipos de microscopios [3]

MATERIALES
1. Láminas
2. Laminillas
3. Agua destilada estéril
4. Asas bacteriológicas redonda y asa recta
5. Mechero
6. Azul de metileno
7. Cristal violeta
8. Lugol

[2] López, M & Vinasco, M. (2011). Modulo didáctico de microbiología ambiental. Lección 29.
Técnicas de tinción. Universidad Nacional Abierta y a Distancia “Unad”. Bogotá. Recuperado
03-05-2014 de http://datateca.unad.edu.co/contenidos/201504/contLinea/index.html

[3] presentacion-tinciones-especiales-2013 tomado el 03-05-2014 de

http://www.slideshare.net/agclinica/presentacion-tinciones-especiales-2013-22404515#
9. Alcohol cetona
10. Fucsina básica o safranina
11. Tinta china
12. Microscopio óptico
13. Colonias aisladas de bacterias para observación de bacterias
14. Guantes de látex [4]
6
7METODOLOGIA

1. Coloración simple

Se toma una lámina portaobjetos limpia, se lava con agua destilada. [4]

[5]

Posteriormente se dispone en esta una gota del agua destilada estéril y con una
asa redonda en ambiente estéril se toma una muestra del cultivo bacteriano con
ayuda del asa redonda estéril extender la gota de suspensión a un área no
superior a dos centímetros cuadrados; hecho esto se deja secar la preparación.
[4]

[5] [5]

[4] Echeverry, L.C. (2013). Guía de laboratorio de microbiología ambiental. Universidad

Nacional Abierta y a Distancia “Unad”.Bogotá.

[5] Fotografías tomadas en la realización de la práctica el 27-04-2014 en el laboratorio del CEAD

Bucaramanga.
Posteriormente se fija con calor, pasando tres veces seguidas, nuevamente se
espera un tiempo prudente mientras se enfría la lámina. [4]

[5]

Una vez terminada esta primera parte se procede a iniciar las coloraciones
respectivas, así:
 Dirigirse con los portaobjetos preparados al vertedero.
 Tomar con una pipeta cantidad suficiente de azul de metileno como para
cubrir la suspensión.
 Verter el colorante sobre el preparado. [4]

[5]

 Dejarlo fijar por 5 minutos, eliminar el colorante lavando con agua

suavemente. [4]
 [5]

 Dejar secar y colocar la preparación en la platina del microscopio y

observar con el objetivo. [4]

[5]
DIAGRAMA DE FLUJO (Coloración simple).

Disponer una gota del agua destilada estéril o una gota del cultivo bacteriano
(portaobjetos)

extender la gota de suspensión (Asa redonda)

Se fija con calor

Cubrir la suspencion con colorante

Lavar

Secar y observar
[4]

Observación

Lo que se observó en la muestra de azul de metileno fueron unos

microorganismos azul-violetas como se presenta en la siguiente figura.

[6]

8Lo que se observó en la muestra de cristal violeta fueron unas series de

microorganismos teñidos de morado como se presenta en la siguiente figura.

[6] L. Solórzano. microbiología y bacteriología tomado el 9-05-2014 de

https://www.google.com.co/search?q=imagen+de+tincion+simple+de+la+bacteria+e.+coli.
 [6]

Lo que se observó en la muestra de fucsina fueron unos microorganismos

fucsias como se presenta en la siguiente figura.

[7]

2. Coloración compuesta

Se realiza un frotis de la muestra seleccionada esta se coloca en la rejilla para

coloración y cubrir el frotis con cristal violeta esperando que transcurra 1 minuto.
Lavar con agua el colorante.

Posteriormente se utiliza el segundo colorante que es el lugol, el cual se deja por

1 minuto sobre el frotis, una vez se hayan realizados estos pasos se procede a
la decoloración con la mezcla alcohol-acetona, por 25 segundos. Lavar
inmediatamente con agua.

Finalmente se adiciona el colorante de contraste, fucsina o safranina, por 30

segundos. Lavar con agua.

Por último se escurre el exceso de agua, deja secar y se monta al microscopio

para hacer las observaciones respectivas. [4]

DIAGRAMA DE FLUJO (Coloración compuesta)

 •Cubrir concristal violeta ( 1 minuto)
Frotis
•Lavar

•Lugol (1 min)
Colorante 2
•lavar

•alcohol-acetona (25 s)
decoloración
•Lavar inmediatamente

•Fucsia o safranina (30s)

•Lavar, escurrir
Colorante de
contraste •observar

[4]

Observación

Lo que se observó en la muestra fueron bacilos Gram negativos como se

visualizan en la figuran son de color rosa, rojo o grosella.

[6]

3. Coloraciones especiales.

En el centro de un portaobjetos se coloca una gota de agua, otra de tinta china

y un poco de cultivo bacteriano a estudiar. Todo se debe mesclar suavemente y
sin extender. Seguidamente colocar un cubreobjetos sobre la suspensión y
presionar suavemente evitando la formación de burbujas. Observar
inmediatamente al microscopio y desechar el material en un recipiente con
antiséptico. [4]

DIAGRAMA DE FLUJO (Coloraciones especiales)

 En un portaobjeto se
colocó agua,tinta china
y el cultivo bacteriiano
de E. coli.

se mezclan todo suavemente

y sin extender

poner el cubreobjetos sobre la

suspención y presionar suavemente.

observar de inmediato al microoscopio y desecarla la

muestra en un resipiente con antiseptico.
[4]

Observación

Lo que se observó en la tinta china fueron puntos negros en movimiento como

muestra la siguiente figura.

[6]
 CONCLUSIONES

En esta práctica nos dimos cuenta que las bacterias no aparecen muy diferentes del medio que
las rodea, difieren mucho químicamente esta diferencia química es lo que permite distinguir las
bacterias por tinción, pues generalmente, el colorante reacciona con la célula bacteriana, pero
no reacciona con su medio exterior.

Debido a eso la tinción es importante para la microbiología debido a que:


Proporciona contraste entre el microorganismo y el medio que lo rodea, permitiendo
diferenciar varios tipos morfológicos.

 Permite el estudio de las estructuras internas de la célula bacteriana, tales como

paredes celulares, vacuola o cuerpos celulares.

 Permite el empleo de mayores amplificaciones.

 REFERENCIAS BIBLIOGRAFIA

1 Biblioteca upibi.tecnicas microbiológicas pate 1 pdf. Reuperado 03-o5-

2024 de
http://www.biblioteca.upibi.ipn.mx/Archivos/Material%20Didactico/T%C3
%A9cnicas%20microbiol%C3%B3gicas/T%C3%A9cnicas%20Microbiol
%C3%B3gicas%20Parte%201.pdf

2 López, M & Vinasco, M. (2011). Modulo didáctico de microbiología

ambiental. Lección 29. Técnicas de tinción. Universidad Nacional
Abierta y a Distancia “Unad”. Bogotá. Recuperado 03-05-2014 de
http://datateca.unad.edu.co/contenidos/201504/contLinea/index.html

3 presentacion-tinciones-especiales-2013 tomado el 03-05-2014 de

http://www.slideshare.net/agclinica/presentacion-tinciones-especiales-
2013-22404515#

4 Echeverry, L.C. (2013). Guía de laboratorio de microbiología ambiental.

Universidad Nacional Abierta y a Distancia “Unad”.Bogotá.

5 Fotografías tomadas en la realización de la práctica el 27-04-2014 en el

laboratorio del CEAD Bucaramanga.

6 L. Solórzano. microbiología y bacteriología tomado el 9-05-2014 de

https://www.google.com.co/search?q=imagen+de+tincion+simple+de+la
+bacteria+e.+coli.
 PRACTICA 03. OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA DE HONGOS

INTRODUCCIÓN

El reino fingí se refiere a los organismos eucariotas conocidos como hongos.

Son heterogéneos y polifilético, diferente a las plantas por su pared celular de
quinina y por actuarcomo parasitas (algunos) se les considera otro reino.
La mayoría de los hongos crecen como hifas, estructuras cilíndricas y filiformes
de 2 a 10 micrómetros de diámetro y hasta varios centímetros de longitud. Las
hifas crecen en sus ápices. Las hifas nuevas se forman típicamente por la
aparición de nuevos ápices a lo largo de hifas preexistentes por un proceso
llamado de ramificación, o al extremo apical de las hifas se bifurca, dando lugar
a dos hifas con crecimiento paralelo.
Los hongos poseen células delimitadas por una membrana plasmática rica en
esteroles y que contienen un núcleo que alberga el material genético en forma
de cromosomas.

El moho es un hongo que se encuentra tanto al aire libre como en lugares

húmedos y con baja luminosidad. Existen muchas especies de mohos que son
especies microscópicas del reino fungí que crecen en formas de
filamentos pluricelulares o unicelulares.
Crecen mejor en condiciones cálidas y húmedas; se reproducen y propagan
mediante esporas. Las esporas del moho pueden sobrevivir en variadas
condiciones ambientales, incluso en extrema sequedad, si bien ésta no
favorece su crecimiento normal.
Algunos mohos son tóxicos porque producen mico toxinas que afectan a otros
seres vivos.
 OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL.

Observar algunos representantes de hongos microscópicos que se encuentran

en el ambiente.

Reconocer y familiarizarse con las características microscópicas de los hongos.

OBJETIVO ESPECIFICOS.

 Observar la morfología de los hongos y distinguir las diferentes

estructuras que presentan.

 Diferenciar los diferentes tipos de hongos según su origen materia

orgánica que puedan degradar.
 MARCO TORICO
La célula fúngica es similar a cualquier organismo eucarionte, aunque existen
diferencias subcelulares entre la célula de un hongo inferior a la de uno
superior. Cuando se estudian los hongos se pueden observan dos grandes
grupos: los algodonosos, que se conocen con el nombre de mohos y otros que
forman colonias húmedas y se conocen como levaduras. [1]

La observación microscópica constituye la primera etapa del estudio de los

microorganismos y también del diagnóstico microbiológico ya que permite
conocer algunas características de los microorganismos, como ser: forma,
disposición o agrupación, presencia o ausencia de estructuras (cápsulas,
esporas, flagelos), movilidad, etc.

LOS HONGOS

Los hongos son un reino de seres vivos unicelulares o pluricelulares que no

forman tejidos y cuyas células se agrupan formando un cuerpo filamentoso muy
ramificado tienen alimentación heterótrofa, puesto que no pueden realizar la
fotosíntesis porque no tienen clorofila. Tienen digestión externa, pues vierten al
exterior enzimas digestivas, sustancias proteicas que actúan sobre los
alimentos dividiéndolos en moléculas sencillas, que atacan a los alimentos. Los
hongos absorben los alimentos después de digerirlos.

Según su tipo de vida, los hongos pueden ser saprofitos, parásitos y

simbiontes. Los hongos saprofitos, como el champiñón o la trufa, se alimentan
de sustancias en descomposición. Los hongos parásitos se alimentan de los
líquidos internos de otros seres vivos. Los hongos simbiontes se asocian con
otros organismos y se benefician mutuamente.

Los hongos viven en lugares húmedos, con abundante materia orgánica en

descomposición y ocultos a la luz del sol. También pueden habitar medios
acuáticos o vivir en el interior de ciertos seres vivos parasitándolos

Es una observación cotidiana el hecho que si se deja un trozo de pan en un

lugar húmedo, con el paso del tiempo es probable que crezca sobre él una
pelusa blanca que luego se oscurece, correspondiente al hongo Rhyzopus
stolonifer (o “moho negro del pan”). Esa pelusa es el micelio del hongo, y su
oscurecimiento se debe a la formación de esporangios, estructuras que dan
lugar a millones de esporas (una forma de reproducción de estos organismos)
Los principales métodos aplicados para la observación microscópica de los
cultivos son: la observación en fresco con una solución adecuada, y las
preparaciones en cinta adhesiva.9[2]

[1] Echeverry, L.C. (2013). Guía de laboratorio de microbiología ambiental. Universidad

Nacional Abierta y a Distancia “Unad”.Bogotá.
[2] Biologia y microbiología. Tomado de 05-05-2014 de http://uni-
biologia.blogspot.com/2011/01/montaje-de-preparaciones-en-fresco.html
MATERIALES
1. Cultivo de hongos
2. Láminas portaobjetos
3. Laminillas
4. Azul de lactofenol
5. Microscópio [1]

METODOLOGÍA

Colocar en el centro de la lámina portaobjeto una gota de azul de lactofenol.

Tomar con el asa micológica previamente estéril parte del hongo

Resuspender el ongo en la gota del colorante.

Colocar luego una laminilla encima de esta preparación y esperar 3

minutos.

Finalizado este tiempo montar al microscópio y observar en 10X y 40X.

[1]

CONSOLIDACIÓN DE CONCEPTOS

Hifa septada Hifa cenocítica

[3] [4]
 Artroconidios Conidios
10

[5] [6]

Esporangioforo Blastoconidia

[7] [8]

[3] D. Zubieta. Tomado el 09-05-2014 de http://comunidad.udistrital.edu.co/dazubietac/

[4]Reino Fungí. Tomado el 09-05-2014 de http://www.simbiotica.org/fungi.htm
[5] MCD.MASTER. estructura celular tomado el 03-05-2014 de
http://www.prepaabrahamlincoln.com/es/index.php/biologia-ii/1110-estructura-celular-de-
los-hongos
[6] D. Sacchari. Conidios tomados el 03-05-2014 de
http://sian.inia.gob.ve/repositorio/revistas_ci/canadeazucar/cana23/arti/ramirez_e.htm
[7] Phylum zygomycota: zigomicetes. Tomado el 06-05-2014 de http://www.cobach-
elr.com/academias/quimicas/biologia/biologia/curtis/libro/c29d.htm
[8] Basics of Mycology. Tomado el 08-05-2014 de http://www.studyblue.com/notes/note/n/basics-
of-mycology/deck/6999229
Cuerpo fructífero de un Aspergillus y nombre sus partes

[9]

Cuerpo fructífero de un Penicillium y nombre sus partes

1: Conidióforos.
2: métula.
3: fiálide.
4: ascospora.

[10]

11

[9] Aspergillus y aspergilosis, servicio de microbiología clínica. Tomado el 08-05-2014 de

http://www.uprm.edu/biology/profs/betancourtc/Lab/Aspergilosis.htm
[10]biología ambiental Generalidades sobre el género Penicillium.Tomadas el 08-05-2014 de
http://biologia.laguia2000.com/hongos/generalidades-sobre-el-genero-
Cuerpo fructífero y macroconidias de un Fusarium y nombre sus partes

[11]

Cuerpo fructífero y macroconidias de una Alternaria y nombre sus partes

[12]

penicillium#ixzz32JBLvs00

[11]Clasificación Taxonomica .Tomadas el 08-05-2014 de

http://www.monografias.com/trabajos89/aislamiento-purificacion-e-inoculacion-fusarium-
oxisporum-w-hibiscus-sabdarifa-l/aislamiento-purificacion-e-inoculacion-fusarium-
oxisporum-w-hibiscus-sabdarifa-l.shtml

[12] amantes de la fitopatologia.tomado el 08-05-2014 de

http://amantesdelafitopatologia.blogspot.com/p/fitopatologia.html
 Cuerpo fructífero de un Rhizopus y de un Mucor y nombre sus partes

[13]

[14]

[13] Rhizopus.Tomada 08-05-2014 de http://es.wikipedia.org/wiki/Rhizopus

[14]reino procariota y reino hongo.tomado 09-05-2014 de
http://www.aula2005.com/html/cn1eso/12protoctistes/12protoctisteses.htm
OBSERVACIONES HECHAS EN EL LABORATORIO

Morfología microscópica de Trichoderma

 CONCLUSIONES

Se pudo observar las diferentes características microscópicas y

macroscópicas de la morfología de los hongos, además, de la
caracterización en base a los diferentes montajes realizados en la
práctica.
PR ACTICA 07. OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA DE CIANOBACTERIAS

INTRODUCCION

La aseveración de que las algas verde-azules (cianobacterias) son bacterias y

no algas ha llevado a conceptos alternativos para los dos últimos términos.
Bacteria es ahora frecuentemente utilizado para designar el reino procariota que
incluye las algas verde-azules, mientras que en otros contextos representa
específicamente a aquellos procariotas que no son verde-azules. El término alga,
no tienen implicación biosistemática; abarca muchos linajes filogenéticamente
independientes caracterizados por la evolución de la fotosíntesis oxigénica
(Stanier & Cohen-Bazire, 1977; Sanders, 2004).

En el primer volumen de la segunda edición del manual de Bergey’s se trata al

dominio Archaea, y a las bacterias fototróficas como las Cianobacterias. Las
propiedades empleadas para la diferenciación son: características morfológicas
microscópicas, morfología de las colonias y pigmentación,
Condiciones de crecimiento y nutrición, fisiología y metabolismo, características
genéticas, plásmidos y bacteriófagos, estructura antigénica, patogenicidad y
ecología.

Los procariotas fotosintéticos oxigénicos comprenden una taxonomía simple y

un grupo filogenético, cuya característica principal que los define es la presencia
de dos fotosistemas (PSII y PSI) además del uso del agua como fotoreductor en
la fotosíntesis, aunque la quimio y fotoheterotrofía facultativa puede ocurrir en
algunas especies o cepas, todos los miembros conocidos son fotoautótrofos,
capaces de utilizar el CO2 como la principal fuente de carbono celular (Boone
and Castenholz, 2001)
 OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL.

Realizar el montaje de preparaciones en portaobjetos para la observación

microscópica de la muestra de cianobacterias.

OBJETIVO ESPECIFICOS.

 Identificar cianobacterias en el microscopio.

 Aprender sobre la morfología de las cianobacterias

 MARCO TEORICO
Fotoreductor en la fotosíntesis, aunque la quimio y fotoheterotrofía
Facul Cyanobacteria (del griego ciano = azul) es el nombre de un filo del reino
Bacteria (único del dominio del mismo nombre) que comprende a las
cianobacterias y, en algún sentido, a sus descendientes por endosimbiosis, los
plastos. Las cianobacterias se caracterizan por ser los únicos procariotas que
llevan a cabo fotosíntesis oxigénica, por ello también se les denomina
oxyphotobacteria. [1]

Las cianobacterias presentan membranas internas llamadas laminillas

fotosintetizadoras (lo que las hace autótrofas) dispuestas en un complejo
multilaminar homologable a los tilacoides de los cloroplastos y son las
responsables de realizar el metabolismo fotosintético ya que poseen toda la
maquinaria necesaria para hacerlo (clorofila, pigmentos fotosintéticos
accesorios, factores ATP sintetiza y en general todo el complejo enzimático).

Las cianobacterias poseen sólo una forma de clorofila, La clorofila a (lo que se
considera que gran importancia en la clasificación filogenética), y todas poseen
pigmentos biliprotéicos como las ficobilinas entre las que se encuentra la
ficocianina, que participan como pigmentos accesorios en la fotosíntesis y son
responsables del color azuloso característico de las mayoría de cianobacterias.

Clasificación

 Prochloron
 Cianofitas:Crococales,Nostocales.

Las cianobacterias son microorganismos cuyas células miden sólo unos

micrómetos (µm) de diámetro, pero son más grandes que la mayoría de las otras
bacterias. El citoplasma suele presentar estructuras reconocibles como los
carboxisomas (corpúsculos que contienen la enzima ribulosa-1,5-bisfosfato
carboxilasa RuBisCO, que realiza la fijación el CO2), gránulos de glucógeno,
gránulos de cianoficina, gránulos de polifosfato, vesículas gasíferas (llenas de
gas) y tilacoides, vesículas aplastadas formadas por invaginación de la
membrana plasmática (con la que suelen conservar comunicación o contacto)
donde reside el aparato molecular de la fotosíntesis. Con medios más
sofisticados se pueden reconocer agregados moleculares como ribosomas,
microtúbulos (no homólogos de los eucarióticos).

La envoltura está constituida, como en todas las bacterias gramnegativas, por

una membrana plasmática y una membrana externa, situándose entre ambas
una pared de mureína (peptidoglucano).

Las cianobacterias más comunes son unicelulares cocoides (esferoidales), a

veces agregadas en una cápsula mucilaginosa, o formando filamentos simples.
Los filamentos pueden aparecer agregados en haces, envueltos por mucílago, o
de una manera que aparenta ramificación. Existen además cianobacterias que
forman filamentos con ramificación verdadera. Las cianobacterias contradicen,
como las mixobacterias, el prejuicio según el cual los procariontes no son nunca
genuinamente pluricelulares.

Entre las células de un filamento hay una comunicación íntima, en forma de

microplasmodesmos, y existe además algún grado de especialización de
funciones. La diferencia más notable la ofrecen los heterocistes,células
especiales que sólo se presentan en un clado de cianobacterias. Los
heterocistes aparecen como células más grandes y de pared engrosada
intercaladas en los filamentos. Recientemente se ha confirmado que su pared
presenta celulosa, el polímero más abundante en las paredes celulares de las
plantas. Los heterocistes contienen la maquinaria de fijación del nitrógeno,
proceso que es relativamente incompatible con la de la fotosíntesis.

Otro tipo de células especializadas son los acinetos; son células que vuelven
más grandes, con una pared más gruesa que las células vegetativas, a veces
con pequeñas protuberancias; poseen un citoplasma granuloso debido a la
acumulación de gran cantidad de cianoficina como sustancia de reserva. Entre
la pared y las capas mucilaginosas segregan una nueva capa fibrosa. Tienen un
metabolismo reducido y soportan condiciones de vida desfavorables.

 Estado Cocal: el más sencillo. En el género Chroococcus. generan esporas.

 Estado capsal: grupo de células que forman pequeñas colonias. Género
Gloeocapsa.
 Estado cenobial: Un aumento en el nivel de organización. Géneros
Merismopedia y Microcystis.
 Estado trical: Género Lyngbia, ramificado.[2]

MATERIALES
1. Agua con cianobacterias
2. Láminas portaobjetos
3. Laminillas
4. Microscopio [1]
 PROCEDIMIENTO

primero

colocar en el centro de la lamina portaobjeto una

gota de la muestra.

segundo

se le colocar una laminilla encima de esta

preparación.

Tercero

Esperar 2 minutos.

cuarto.

Montar al microosócpio y observar en 10x,40, y

100x.
[1]

CONSOLIDACIÓN DE CONCEPTOS

1. Explique qué función tiene el carboxisoma en las cianobacterias.

Carboxisoma en cianobacterias: contiene RubisCO 1A. Su membrana está

delimitada por proteínas principales como la CsoS1, en menos abundancia están
CsoS4A y CsoS4B. [3]

2. Explique qué función tiene las vesículas gasíferas en las cianobacterias

Las vesículas gasíferas (llenas de gas, que presentan muchas pero no todas
las formas) y su función es regular la flotabilidad. [3]14

3. ¿Qué son los tilacoides?, ¿Cuál es su función y donde se ubican en las

cianobacterias?

Tilacoides, vesículas aplastadas formadas por invaginación de la membrana

plasmática (con la que suelen conservar comunicación o contacto) donde
reside el aparato molecular de la fotosíntesis.[3]

Sacos membranosos que aparecen en cianobacterias, sin continuidad con la

membrana plasmática.
 En ellos se sitúan los centros de reacción fotosintéticos.
 En su cara externa se disponen los ficobilisomas.

[3] Cuales son las características de una cianobacterias. Tomadas el 10 -05-

2014https://es.answers.yahoo.com/question/index?qid=20080630162124AATcL6e
  El conjunto de tilacoides + ficobilisomas constituyen el aparato
fotosintético de las cianobacterias.[4]

Cianobacterias formadoras
de filamentos simples Heterocisto

[5] [6]15

Anabaena sp Nostoc sp

[7] [8]

[4]Diversidad microbiana y taxonomia. Tomado el 10 -05-2014 de

http://www.diversidadmicrobiana.com/index.php?option=com_content&view=article&id=52&Item
id=68
[5] Tomados el 10-05-2014 de
http://microbes.arc.nasa.gov/images/content/gallery/lightms/publication/lyngbya.jpg
[6]aparición de cianobacterias tomado el 10-05-2014
tbn3.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcRHR2hnfnevskQWWbWOXFaWUn_z7GX6UJ5bL0Kki
RXcTouDyUS0
[7] cyanophyceae: Nostocales: nostocaceae. Tomado el 10-05-2014
http://protist.i.hosei.ac.jp/pdb/images/prokaryotes/nostocaceae/anabaena/anabaena7c.html
[8]cuaderno de campo del treparriscos. Tomado el 10-05-2014 de
http://treparriscosfieldnotebook.blogspot.com/2013_01_01_archive.html
 Volvox sp

[9]

OBSERVACIONES HECHAS EN LABORATORIO

16

[9]volvox sp.photo.tomado el 11-05-2014 de http://www.pbase.com/splluk/image/136768526

 CONCLUSIONES

Se logró reconocer las estructuras típicas y la organización celular de las

cianobacterias, algas y protozoos realizando el montaje de preparaciones en
portaobjetos para la observación microscópica en diferentes muestras de los
microorganismos.