UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

FACULTAD DE QUIMICA E INGENIERIA QUIMICA

E.A.P. INGENIERIA AGROINDUSTRIAL

Practica N°7 y N°8: Aislamiento de Microorganismos

amilolíticos y producción de amilasa en cultivo sumergido
Autores: Cutipa Canchoa, Joel Max Paul; Germani Salazar, Hugo Nash; Guerreo Aponte, Jean Carlos
Edilberto; Leyva Leon, Bianca Geraldyne; Soto Escobar, Alfredo; Camavilca Estrella, Yolsmi Estiv

Laboratorio de Microbiología General y Aplicada. Lima.

RESUMEN
Resumen

Parte I.

Para la práctica se utilizó un sistema de enriquecimiento in situ para aumentar la población

microbiana zimógena y aumentar la probabilidad de aislamiento de microorganismos amilolíticos,
para ello se seleccionó un jardín con un área de 1m^2, se removió el suelo hasta 8 〖cm〗^2 de
profundidad, se agregó uniformemente en todo el área 100gr de almidón y mezclaos completamente
con el suelo.

Humedecimos con agua durante 14 días (a los 6 días añadimos 500 g de almidón). Al pasar los 15 días
en un envase estéril y con ayuda de una cuchara esterilizada recogimos de unos 5 cm de profundidad
la muestra a trabajar.

Pesamos 10 g de la muestra y agregarlos al Erlenmeyer que contiene 90 ml de agua destilada estéril,

agitamos y se realizó las diluciones indicadas. Adicionar a cada placa Petri aproximadamente 15 ml
de agar de aislamiento.

Incubamos las placas a 30°C durante 5-7 días.

Parte II.

Se colocó las placas Petri dentro de una caja de vidrio o plástico (con tapa hermética) conteniendo
yodo metálico hasta que el medio adquiera un color morado. Elegimos la colonia que presente el
mayor halo de hidrólisis (incoloro).

Realizar un trasplante de la colonia elegida a dos tubos en cuñas de APD. Se incubo los tubos a 30° C
hasta la siguiente sesión de prácticas. Realizamos una observación microscópica de la colonia elegida.

Las muestras donde si proliferaron bien fueron en las placas 10-3 y 10-4, debido a la concentración
eficaz que tuvieron, tanto de microorganismo amilolíticos como del método empleado. Se pudo
apreciar la formación de halos, debido a que fue expuesto al Yodo metálico

Parte III.
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Se agregó 3-5 ml de agua destilada estéril a uno de los tubos en cuñas de agar con el microorganismo
aislado. Realizamos una suspensión y determine la concentración de esporas.

Inoculamos las esporas del microorganismo correspondiente a un Erlenmeyer del medio de

producción.

Incube el Erlenmeyer en un baño con agitación a 30°C y 140 RPM. por 7 días.

Al realizar las observaciones al microscopio se observó estructuras de reproducción asexual como

esporas asexuales (conidiosporas), con una cabeza globosa. Estas características microscópicas,
sumadas a las características macroscópicas (dígase color amarillo y un rojizo ladrillo, que luego

cambiará totalmente a un gris ópaco) sirven como base para tratar de decir que se trata de unos hongos
del género Aspergillus. Este género de hongos es muy utilizado en la industria para la obtención de
enzimas amilolíticas.

Se acondicionó a un medio de producción de amilasa

Palabras clave : halos, conidiosporas, enzimas amilolíticas, zimógena, yodo metálico

Abstrac

Part I.

For the practice, an in situ enrichment system can be established to increase the zymogenic microbial
population and increase the probability of isolation of amylolitic microorganisms, for this a garden
with an area of 1m^2 is selected, the soil is eliminated up 8 〖cm〗^2 to deep, uniformly throughout
the 100gr area of starch and mix thoroughly with the soil. Moisten with water for 14 days (after 6 days
add 500 g of starch). After 15 days in a container, sterile and with the help of a sterilized spoon, the
sample to be worked is about 5 cm deep. Weigh 10 g of the sample and add them to Erlenmeyer
containing 90 ml of distilled water, however, the dilutions indicated have been made. Add
approximately 15 ml of isolation agar to each Petri dish. We incubate the plates at 30 ° C for 5-7 days.

Part II

The Petri dishes were placed inside a glass or plastic box (with a tight lid) containing metallic iodine
until the medium acquires a purple color. We chose the colony with the highest hydrolysis halo
(colorless). Carry out a transplant of the chosen colony to two tubes in APD wedges. The tubes are
incubated at 30 ° C until the next practice session. We made a microscopic observation of the chosen
colony.

The samples where they proliferated well were in plates 10-3 and 10-4, due to the effective
concentration they had, both of amylolitic microorganism and of the method used. It was possible to
appreciate the formation of halos, because it was exposed to metallic iodine

Part III
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3-5 ml of distilled water was added to a holding tube with the isolated microorganism. We perform a
suspension and determine the concentration of spores. We inoculate the spores of the microorganism
in a medium of the production medium. Incubate the bath in a shaking bath at 30 ° C and 140 RPM.
for 7 days

When performing the observations under the microscope, asexual reproduction structures were
observed as asexual spores (conidiospores), with a globose head. These microscopic characteristics,
added to the macroscopic characteristics (say yellow and a reddish brick, which will then change
completely to an opaque gray) serve as a basis to try to say that it is a fungus of the genus Aspergillus.
This kind of fungi is widely used in the industry to obtain amylolitic enzymes.

It was conditioned to an amylase production medium.

Key words: halos, conidiospores, amylolytic enzymes, zymogen, metallic iodine

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INTRODUCCIÓN

La presente práctica se realizó con el objetivo de utilizar el sistema de enriquecimiento in situ para
aumentar la población microbiana zimógena y aumentar la probabilidad de aislamiento de
microorganismos amilolíticos y realizar la identificación aproximada de los microorganismos con
mayor potencial y verificar su producción en cultivo sumergido en frascos agitados.

Las amilasas constituyen el segundo grupo de enzimas microbianas en mayor producción industrial. El
aislamiento de microorganismos productores de amilasas (amilolíticas) constituye un tema importante
de la microbiología industrial, puesto que es la base para la disponibilidad de nuevas cepas que
pueden ser utilizadas en producción industrial.
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MATERIALES Y MÉTODOS
PARTE I

Muestra de suelo enriquecido. 4 placas Petri estériles.

1 frasco con tapa rosca con 90 ml de solución 5 tubos de 9 ml de solución salina 0.85%
salina 0.85%

2 pipetas de 1ml estériles.

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PARTE II Asa de siembra.

Caja de plástico con yodo metálico.

Láminas porta y cubre objetos. 1 tubo de ensayo.

1 placa Petri.

PARTE III Y IV Tubo de ensayo con 2ml de reactivo de

Benedict.
Erlenmeyer de 250 ml con 100 ml de medio de
producción de amilasa
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Agitador para matraces. Erlenmeyer con 50 mL de medio de producción

y 10 mL de inoculo del microorganismo.

Pipetas de 1 y 10 mL. Baño María.

PROCEDIMIENTO

Parte I

a. Enriquecimiento in situ

1. Se seleccionó un 1m2 de terreno fértil de la escuela de Ingeniería Agroindustrial.

2. Se removió el suelo hasta 8 cm de profundidad y se le agregó uniformemente en toda el

área 100g de almidón.
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3. Se mezcló completamente con el suelo hasta 8cm de profundidad y se humedeció con

agua.

4. Se mantuvo húmedo el metro cuadrado y después de una semana de haber echado 100g de
almidón, se le volvió a agregar al terreno otros 100g de almidón uniformemente en todo el
terreno.
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5. Se mantuvo el metro cuadrado de área húmedo por 15 días.

b. Muestreo

1. Se realizó dos horas antes de realizar la práctica.

2. Se compró un frasco de boca ancha estéril.

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3. Con una cuchara desinfectada con alcohol, se tomó el suelo por debajo de los primeros 2
cm hasta un total aproximado de 100 g. Se cerró la tapa y se mantuvo guardado en un
lugar fresco hasta realizar la práctica.

c. Aislamiento

1. Se pesó 10g de la muestra y agregarlos al frasco que contiene 90 mL de solución salina

0.85% y se agitó el frasco durante 10 min.
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2. Se realizó diluciones seriadas de 10-1, 10-2, 10-3 y 10-4 y de cada una de estas se tomó
0.1mL y se agregó a una placa Petri estéril.

3. Se adicionó a cada placa Petri 15mL de agar de aislamiento y se realizó la siembra por el
método de diseminación.

4. Se incubo las placas a 25oC durante 5 días.

PARTE II

1. Se colocó las placas Petri dentro de una caja de plástico con tapa hermética conteniendo yodo
metálico hasta que el medio adquiera un color morado.

2. Las colonias de microorganismos amilolíticos presentarán un halo incoloro y se eligió la

colonia que presento mayor halo de hidrólisis.

3. Luego, se realizó un trasplante de la colonia elegida a un tubo de ensayo con medio de cultivo
con los siguientes componentes:

- Extracto de carne : 5g/L

- Almidón: 10g/L

- NaCl: 0.001 g/L

- Agar: 15 g/L
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- pH: 6.5

4. Se incubo a 25oC ( Martes 16/10) hasta la siguiente sesión de prácticas (Jueves 18/10)

5. Del tubo en 4 se trasladó a una placa Petri (Jueves 18/10) y se incubo hasta el día 23/10.

PARTE III (Martes 23/10)

1. En un matraz Erlenmeyer que contenía 50 mL de medio de producción se agregó 10 mL

del microorganismo incubado en la parte II.

2. Luego, se llevó a incubación este matraz Erlenmeyer a 25 oC por 2 días.

3. (Jueves 25/10) Se elaboró el medio de producción de amilasa que contenía lo siguiente :

- Peptona: 8g/L

- Almidón: 10g/L

- NaCl: 0.001 g/L

- FeSO4.5H2O: 0.001 g/L

- MgSO4.5H2O: 2 g/L

- KCl: 1 g/L

- pH: 6.5

4. Luego de esto se introdujo este medio de producción en un matraz Erlenmeyer de 250 mL

que contenía 100mL de producción de amilasa.

5. Después, se agregó a este matraz 10 mL del inoculo del Erlenmeyer incubado el martes
23/10, como se puede observar en la siguiente figura.
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6. Luego de esto se llevó el matraz Erlenmeyer de medio de producción de amilasa con 10

mL del inóculo del Erlenmeyer incubado el martes 23/10 a un agitador de matraces con
200 RPM hasta el día de la siguiente evaluación. (Martes 30/10)

PARTE IV (Martes 30/10)

1. En un tubo de ensayo se calculó aproximadamente 1mL del inoculo del matraz que se dejó a
200 RPM el día martes 23/10 y se agregó a su vez 1mL de reactivo de Benedict
aproximadamente

2. Se llevó este tubo de ensayo a baño maría por más de 3 minutos y se observó los resultados.

.
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RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Resultados

Parte 1

Fig. (1)

Placa petri con el inóculo del tubo N°4 (10-4). Método de difusión fue
utilizado para el sembrado.

Se puede observar el crecimiento de diversas colonias. Lo que nos indica

la diversidad microbiana de la muestra.

(1)

Parte 2

Fig. (2)

Formación de halos, debido a que fue expuesto al Yodo metálico dichos

halos nos indica la presencia de almidón por lo tanto la muestra es
positiva.

(2)

Fig. (3)

Sembrado de una de las colonias para la purificación por el método de estriado

(3)
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Caracterización de la colonia

Tamaño Forma Borde Elevación Textura de

superficie

3.5mm circular ondulado plana corrugada

Consistencia Grado de Cromogénesis Caracteres

adherencia Complementarios

Cremosa moderada Ausente Opaco

Observación al microscopio de la colonia elegida

(4)

Fig. (4)

Observación de la muestra al microscopio, se usó el método de tinción Gram

La bacteria se presenta en forma de bacilo y es Gram (-)

Parte 3

Cultivo sumergido
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Fig. (5)

Se acondicionó a un medio de producción de amilasa

(5)

Parte 4

Determinación de la actividad de amilasa

Fig. (6)

Se determinó los azucares reductores, obteniéndose una

muestra positiva (Prueba de Benedict)

(6)
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Discusión

Del aislamiento de cepas, se eligió a la que presentaba mayor halo de hidrólisis, debido a que esto
sugiere que se trata de un microorganismo con alto potencial en la capacidad de producir enzimas.

Para la identificación de azúcares reductores también se puede usar el reactivo de Benedict ya que
reduce el grupo carbonilo de un aldehído. Un aspecto importante de esta reacción es que la forma
aldehído puede detectarse fácilmente, aunque exista en muy pequeña cantidad.

La gran mayoría de bacterias amilolíticas son gram positivas, y la que más se usa en la industria son
los bacillus, los cuales son capaces de producir gran cantidad de exoenzimas, es muy usado en la
industria cervecera.

En investigaciones paralelas se ha demostrado la alta capacidad de producción de amilasas el hongo

Aspergillus sp, teniendo un mejor desarrollo en sustrato sólido debido a que emula sus condiciones
naturales en la producción de amilasas.

CONCLUCIONES

 Se concluye que se demuestra si hay microorganismos amilolíicos siempre y cuando den

positivo a la prueba de Benedict que se debería mostrar un color Ladrillo, en todo caso
verdoso; pero que cambie de color.

 El Yodo es un indicador para la presencia de estos microorganismos, debido a que se forman

halos, al entrar en contacto con este ya que el yodo se expande de forma gaseosa.

 Se dio con éxito, el aislamiento debido a que se enriqueció correctamente la tierra donde se
iban a formar los microorganismos.

 Los microorganismos para que prosperen se deben dar a condiciones adecuadas, por lo tanto
se usó el medio que contenía almidón.

 Se fue pasando el inoculo de pequeñas cantidades a unas mayores para que el microorganismo
se adapte y prolifere con más éxito.
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BIBLIOGRAFÍA
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 Sánchez, c., Mejía C., Figueroa C., Esquivia M., Agudelo L., Zapataq N. BIOPROSPECCIÓN
DE MICROORGANISMOS NATIVOS AMILOLÍTICOS. Libro de la Facultad de Ciencias
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 ESTUDIO DE MICROORGANISMOS CON CAPACIDAD AMILOLÍTICA. CIENCIA Y
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http://www.uam.es/personal_pdi/ciencias/mflobato/biotecnologia/Practicas10.pdf consultada
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 Vihinen, M. y Mäntsälä, P. 1989. MICROORGANISMOS AMILOLITICOS. REVISIONES
CRITICAS EN BIOQUIMICA Y BIOLOGIA MOLECULAR pág.: 329-418.