ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL

PRÁCTICA 1
BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

I. CONCEPTOS TEÓRICOS

1.1. PRINCIPIOS DE BIOSEGURIDAD

Está asociado a los procedimientos que se desarrollan en laboratorios clínicos y de
investigación donde se encuentran riesgos potenciales o infecciosos. Para estar
consciente de estos riesgos el personal debe conocer los agentes biológicos, reactivos,
sustancias químicas y equipos que se utilizan. Este conocimiento implica un
entrenamiento apropiado en el reconocimiento del riesgo y la prevención, en la
ejecución apropiada de los procedimientos y en el uso del equipo.
La precaución universal se basa en la idea de que todas las muestras clínicas, líquidos
corporales, tejidos y cultivos son potencialmente infecciosos y deberían ser
manipulados con sentido común y utilizando precauciones básicas. Se recomienda para
esto, prácticas microbiológicas estándares y especiales, así como equipo el que es
recomendado dependiendo del nivel de bioseguridad que se determine. Estas
recomendaciones constituyen precauciones universales para el laboratorio y serán
adoptadas como un estándar mínimo para trabajar con materiales potencialmente
infecciosos.

1.2. NIVELES DE RIESGO BIOLÓGICO

Las actividades en laboratorio microbiológico puede involucrar el manipuleo y
recolección de muestras potencialmente infecciosas (sangre, orina, heces, líquidos
corporales entre otros materiales clínicos).
La determinación de los niveles de riesgo se lleva a cabo considerando el tipo de
transmisión del agente infeccioso y la frecuencia con que el personal está en contacto
con el patógeno. La manipulación de patógenos que se transmiten por aerosoles
infecciosos envuelve un alto riesgo ocupacional que no se encuentra al manipular
agentes que son transmitidos parenteralmente, como el virus de la hepatitis B.
Infecciones transmitidas por aerosoles o gotitas infecciosas incluyen la brucelosis,
tularemia, tuberculosis, ántrax e infecciones rickettsiales entre otros; todas estas
enfermedades, con excepción de la tuberculosis, tienen baja incidencia y distribución
esporádica, características que deben ser tomadas en cuenta para la determinación del
nivel de riesgo. Por ejemplo la manipulación de cultivos y la inoculación de animales de
experimentación con M. tuberculosis implica un riesgo de nivel 3 (BSL3 o biosafety
level 3), porque ponen al personal en contacto continuo con el agente y se ha
determinado que la dosis infecciosa es menor de 10 bacilos.

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Docente: Débora Alvarado Iparraguirre
Departamento de Microbiología y Parasitología – Fac.Ciencias Biológicas - UNMSM
1.3. PRÁCTICAS DE BIOSEGURIDAD
1.3.1. Prácticas de Bioseguridad de Nivel 1 (BSL-1)
Se aplican durante el trabajo con agentes bien caracterizados a los cuales no se les
conoce causa de enfermedad en humanos adultos, y un riesgo potencial mínimo
para el personal de laboratorio y el ambiente. El trabajo en laboratorio es conducido
utilizado solamente prácticas microbiológicas estándares. No se requieren equipos o
facilidades especiales. El laboratorio es conducido y supervisado por un científico
con entrenamiento general en microbiología o una ciencia relacionada.
Prácticas microbiológicas estándares.
1. El acceso al laboratorio es limitado o restringido a discreción del Director cuando
se llevan a cabo experimentos o trabajos con cultivo y muestras.
2. El personal deberá lavarse las manos luego del manipuleo de materiales vivos,
luego de quitarse los guantes y antes de partir del laboratorio.
3. No se permitirá comer, beber, fumar o manipular lentes de contacto o aplicar
cosméticos así como almacenar alimentos para uso humano en las áreas de
trabajo. Los alimentos deberán guardarse fuera del ambiente de trabajo en
refrigeradores designados con ese propósito.
4. Se prohibirá el pipeteo con la boca debiéndose utilizar dispositivos para el
pipeteo mecánico.
5. Deben instituirse políticas para el manipuleo seguro de agujas.
6. Todos los procedimientos deben ser llevados a cabo cuidadosamente para
minimizar la creación de aerosoles.
7. Las superficies de trabajo deben ser descontaminados al menos una vez por día y
luego del salpicado de material viable.
8. Todos los cultivos, estoques y otros desechos deben ser descontaminados antes
de su eliminación. Los materiales que deban ser descontaminados fuera del
laboratorio deberán colocarse en contenedores y cerrarse para su transporte.
9. Puede colocarse en la entrada un signo de biorriesgo (Fig.1) en la entrada del
laboratorio siempre que se utilicen agentes infecciosos. El signo puede incluir el
nombre y número telefónico del Director.
10. Debe efectuarse un programa de control de insectos y roedores.

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 1.3.2. Prácticas de Bioseguridad de Nivel 2 (BSL-2).
Se aplican para el trabajo con agentes de riesgo potencial moderado. El personal de
laboratorio debe tener entrenamiento específico en el manipuleo de agentes
patogénicos y son dirigidos por científicos competentes, el acceso al laboratorio es
limitado cuando se conduce un trabajo, deben tomarse precauciones extremas con
agujas contaminadas y deben realizarse algunos procedimientos en los cuales se
forman aerosoles dentro de cabinas de seguridad biológica. Aparte de las prácticas
microbiológicas estándares (1.3.1) se deberán seguir prácticas especiales.

Prácticas especiales

1. Se restringe el acceso al laboratorio cuando se trabaje con agentes infecciosos.

No se les permite el acceso a personas con un riesgo incrementado de adquirir
infección.

2. El Director del laboratorio establece políticas y procedimientos por medio de los

cuales solamente puedan entrar al laboratorio personas que han sido entrenadas
para riesgos potenciales o cuenten con inmunización.

3. Puede ser colocada una señal de biorriesgo cuando se utilice el agente biológico.
Debe colocarse en el cartel el agente que se esté utilizando, el nivel de
bioseguridad, los requerimientos de inmunización, el nombre y el teléfono del
investigador, algún equipo de protección personal que deberá ser utilizado y
algunos procedimientos requeridos para salir del laboratorio.

4. De ser posible, el personal de laboratorio recibirá inmunización.

5. Deberán colocarse y almacenarse muestras de suero del personal en riesgo

cuando se considere apropiado y dependiendo del agente que se manipule.
Muestras adicionales pueden ser colectadas periódicamente.

6. Los procedimientos de bioseguridad deberán ser incorporados en las operaciones

estándar o en un manual preparado específicamente por el Director del
laboratorio.

7. El Director del laboratorio deberá asegurarse que el personal reciba el

entrenamiento apropiado sobre los riesgos potenciales asociados con el trabajo
que se desarrolla en el laboratorio.

8. Se deberá tener un alto grado de precaución con objetos puntiagudos que

incluyan agujas y jeringas, láminas de vidrio, pipetas, tubos capilares y
escalpelos.

9. Los desechos potencialmente infecciosos, como cultivos, tejidos o muestras de

líquidos sanguíneos, serán colocados en un contenedor con una cubierta que
prevenga su dispersión durante la colección, manipuleo, procesamiento,
almacenamiento y transporte.

10. Los equipos de laboratorio y superficies de trabajo deberán ser

descontaminados con un desinfectante efectivo al término del trabajo con
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 materiales infecciosos y especialmente cuando hayan ocurrido salpicaduras o
derrames.

11. Los accidentes que den como resultado la exposición a materiales infecciosos
deberán ser reportados inmediatamente al director del laboratorio. Se
establecerá tratamiento, vigilancia y se mantendrán reportes escritos.

12. No se permitirá la presencia de animales y plantas que no se estén utilizando

durante el trabajo.

1.3.3. Prácticas de Bioseguridad de Nivel 3 (BSL-3)

Es aplicable en clínica, diagnóstico, enseñanza, investigación o producción cuando
se trabaje con agentes indígenas o exóticos que puedan causar enfermedad seria o
potencialmente letal como resultado de la exposición por la ruta de la inhalación. El
personal de laboratorio deberá tener un entrenamiento en manipulación de agentes
patogénicos potencialmente letales y deberán ser supervisados por científicos
competentes con experiencia en el trabajo con estos agentes.
Todos los procedimientos para la manipulación de materiales infecciosos son
conducidos dentro de cabinas de seguridad y por personal vestido apropiadamente.
El laboratorio deberá tener una estructura característica (www.cdc.gov.). Si no se
cuenta con estas facilidades de construcción los procedimientos de rutina de BSL-3
pueden realizarse en ambientes BSL-2 donde 1) el aire pueda ser desalojado y
descargado fuera del laboratorio, 2) la ventilación tenga un flujo direccional dentro
del ambiente, 3) tenga acceso restringido y 4) se sigan rigurosamente las prácticas
microbiológicas estándar, las prácticas especiales y se cuenten con los equipos de
seguridad para el nivel de bioseguridad 3.

Prácticas especiales
A las recomendaciones indicadas en 1.2.2. se sumarán las siguientes:

1. El Director tendrá la responsabilidad final para evaluar cada circunstancia y

determinar quién puede entrar o trabajar en el laboratorio. No se permitirá el
acceso de menores.

2. El personal recibirá entrenamiento anual o entrenamiento adicional cuando se

establezcan cambios en los procedimientos.

3. El Director del laboratorio es responsable de asegurar que todo el personal

demuestre eficiencia en prácticas y técnicas microbiológicas estándar y en las
operaciones y prácticas específicas a las facilidades del laboratorio antes de
trabajar con organismos a un nivel de bioseguridad 3.

4. Todas las manipulaciones que involucren materiales infecciosos serán

conducidas en cabinas de seguridad biológica.

5. Todos los materiales de desecho contaminados (guantes, mandiles, etc.) serán

descontaminados antes de su eliminación o reuso.

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II. SEGURIDAD QUÍMICA Y OTROS PELIGROS

El trabajo en laboratorio de microbiología expone al personal no sólo a

microorganismos patogénicos, sino también a sustancias químicas peligrosas por lo que
es importante que se tenga los debidos conocimientos acerca de los efectos tóxicos de
esas sustancias.
Las vías de exposición son:
1. Inhalación
2. Contacto
3. Ingestión
4. Jeringuillas
5. Heridas en la piel.
Los fabricantes y/o proveedores de sustancias químicas facilitan hojas informativas con
datos sobre la seguridad de los materiales, formas de inactivación o neutralización del
daño en caso de intoxicación, y otras informaciones sobre los peligros químicos. Esas
hojas deben estar disponibles en los laboratorios donde se utilizan esas sustancias.
En el anexo 5 del Manual OMS sobre bioseguridad en laboratorio (OMS, 2005) se
exponen información y datos básicos sobre seguridad y precauciones apropiadas para
sustancias químicas que se utilizan con más frecuencia en los laboratorios de docencia e
investigación. La lista no es exhaustiva y la ausencia de determinada sustancia no
significa que no sea peligrosa. Todas las sustancias químicas del laboratorio deben
tratarse con precaución y de modo que la exposición se reduzca al mínimo.
El personal que trabaja en el laboratorio microbiológico también puede enfrentarse a
peligros debidos a formas de energía como el fuego, la electricidad, las radiaciones o el
ruido. El uso de mecheros y conexiones de gas hace necesaria la instalación de duchas y
lavaojos cercanos al laboratorio y hace de necesidad que cualquier personal nuevo deba
ser instruido en su uso.

III. PREGUNTAS

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1. Cuáles son los criterios para ubicar a los diferentes microorganismos que se
manipulan en el laboratorio dentro de un nivel de bioseguridad?
2. Un microorganismo puede ubicarse en dos niveles de seguridad? ¿Si así fuera cuales
serían los argumentos?

IV. BIBLIOGRAFÍA

OMS. (2005). Manual de bioseguridad en el laboratorio. (OMS, Ed.) (Tercera, p. 210).

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Glosario

Comburente, que produce combustión

Inflamable, que arde con facilidad
Irritante, que causa irritación
Nocivo, que hace daño o es perjudicial
Tóxico o muy tóxico, puede ser mortal en caso de ingestión y penetración en las vías
respiratorias. Se sospecha que daña la fertilidad o al feto. Puede provocar síntomas
desde alergia o asma hasta dificultades respiratorias graves en caso de inhalación.

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 PRÁCTICA 2

LABORATORIO MICROBIOLÓGICO, EQUIPAMIENTO PARA EL

CULTIVO ESTERILIZACIÓN Y DESINFECCIÓN

I. EL CONTROL DEL CRECIMIENTO MICROBIANO

En el laboratorio de microbiología es importante controlar el crecimiento de los

microorganismos. Controlar el crecimiento microbiano implica matar microorganismos
o inhibir (sin matar) el crecimiento de los mismos. Para esto se utilizan agentes físicos o
químicos. El nombre de los agentes que matan células lleva el sufijo “cida”, como por
ejemplo bactericida, germicida, fungicida, viricida, etc. En cambio, el de los agentes que
inhiben el crecimiento de las células lleva el sufijo “stático”, como bacteriostático,
fungistático, tuberculostático, etc.

En microbiología, esterilización se refiere a la destrucción completa o eliminación de

toda forma de vida en o sobre un material o sustancia que está siendo esterilizada. No
hay grados de esterilización, es decir, que es incorrecto decir que algo está “un poco
estéril” o “muy estéril”. Un objeto o sustancia está estéril o no lo está. Los
procedimientos para la esterilización involucran el uso de calor, radiación, remoción
física de células y sustancias químicas.

En cambio, desinfección se refiere a la eliminación de virus y microorganismos, pero

no de sus esporas en o sobre un material. El procedimiento para la desinfección implica
el uso de agentes químicos denominados desinfectantes sobre objetos inanimados
debido a que estos agentes son tóxicos para los tejidos vivos. Se pueden aplicar
desinfectantes a mesas, pisos, utensilios, etc. Son ejemplos de desinfectantes los
hipocloritos (lejía), formaldehído al 8%, cloruro de mercurio, compuestos fenólicos
(fenol al 5%), sulfato de amonio y compuestos de amonio cuaternario a 0.25 – 1.6%.

Los antisépticos son agentes químicos que cumplen la misma función que los
desinfectantes con la diferencia que son menos tóxicos que éstos, de tal manera que se
pueden aplicar a la piel y las mucosas. Sin embargo, los antisépticos no son lo
suficientemente inocuos como para ingerirlos, sólo se pueden aplicar a las superficies
externas del cuerpo. Son ejemplos de antisépticos etanol al 70%, isopropanol al 70%,
tintura de yodo (I2 al 2% en etanol al 70%), nitrato de plata al 1%, compuestos de
amonio cuaternario a baja concentración (cloruro de benzalconio, cloruro de etilbencilo,
cloruro de didecil dimetil amonio, cloruro de dioctil dimetil amonio), compuestos
fenólicos a baja concentración (ácido carbólico, lysol, hexaclorofeno), entre otros.
Obsérvese que frecuentemente un mismo agente químico puede ser desinfectante o
antiséptico dependiendo de su concentración.

II. ESTERILIZACIÓN

2.1. ESTERILIZACIÓN CON CALOR SECO

La esterilización por calor seco destruye los microorganismos oxidando sus

constituyentes químicos, desnaturalizando las proteínas y los ácidos nucleicos de las
células, así como fragmentando las membranas celulares. Se aplica a materiales que
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deben permanecer secos y que no se alteran a la temperatura y tiempo de esterilización
tales como placas Petri, pipetas, tubos de ensayo, matraces, balones y otros de vidrio
refractario. También se esterilizan por calor seco los materiales de metal como pinzas,
tijeras, espátulas, etc. No se pueden esterilizar por este método los materiales de goma y
de plástico, las soluciones, medios de cultivo, ni materia orgánica.

Debido a que el calor seco no es tan eficiente se requiere aplicar altas temperaturas y
períodos de tiempo más largos. Así, se necesita 160ºC durante 2 horas ó 180ºC durante
1 hora en el horno de convección.

Otras formas de aplicación del calor seco incluyen la incineración para objetos y
animales de experimentación muertos infectados, que deben ser destruidos y el
flameado pasando materiales o instrumentos pequeños, como asas de siembra, pinzas o
espátulas de Drigalsky, a través de la llama de un mechero Bunsen.

Horno de convección Mechero Bunsen

2.2. ESTERILIZACIÓN CON CALOR HÚMEDO

Esterilización con vapor saturado y a presión

Este es el método de esterilización más eficiente y efectivo. Se hace en un equipo

llamado autoclave. Las autoclaves operan manejando dos variables importantes:
tiempo y temperatura. La temperatura/presión habitualmente empleada es 121ºC/15
psi (libras/pulgada cuadrada) por 15 minutes. Pueden usarse tiempos mayores si la
carga de material o los volúmenes a esterilizar son grandes.
Su efectividad se debe a que la alta presión que se usa incrementa la temperatura del
vapor de agua lo cual favorece su capacidad de matar organismos, incluyendo las
esporas que son sumamente termodúricas. El vapor a 100ºC tiene 7 veces más calor
que el agua a la misma temperatura porque se requiere más cantidad de calor para
convertir el agua en vapor que para hacerla hervir.

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 El calor húmedo mata a los microorganismos denaturando sus proteínas esenciales.
El autoclavado es ideal para esterilizar desechos biológicos peligrosos, vestimentas
quirúrgicas, material de vidrio, de jebe o goma, medios de cultivo, soluciones, entre
otros. Sin embargo, determinados materiales de plástico y ciertos instrumentos
médicos (por ejemplo endoscopios de fibra óptica), no pueden autoclavarse y se
esterilizan con agentes químicos y gases. El autoclavado se realiza a 121ºC/15 por
15 minutes que asegura la eliminación de microorganismos esporulados que son los
más resistentes al calor. La esterilización a 132ºC/15 por 4.5 horas se cree que
destruye a los priones.

Autoclave

Diagrama esquemático de una autoclave. Se ilustra la circulación del vapor caliente.

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 El autoclave consta de una cámara de doble pared que se llena de vapor saturado
libre de aire y se mantiene a la temperatura indicada y a la presión establecida
durante un periodo de tiempo determinado. El tiempo de funcionamiento para lograr
la esterilidad depende de la naturaleza del material que se va a esterilizar, del tipo de
envase y del volumen del material. Una temperatura de l00ºC es la suficiente para
matar a todas las formas bacterianas en 2 o 3 minutos, excepto a las esporas, para
matar a éstas se requiere una temperatura de 121ºC/15 por 15 minutes. El autoclave
se puede sustituir por la olla de presión.

Para controlar la calidad del autoclavado se deben utilizar indicadores sensibles al

calor. Existen indicadores químicos que vienen impregnados en cintas tipo
maskintape, los cuales se tornan de color negro si se alcanzó la temperatura
adecuada. También hay indicadores biológicos como endosporas de Bacillus
stearothermophilus. Se coloca el vial conteniendo estas endosporas en el centro del
material a esterilizar y cuando ha terminado el proceso se les adiciona un medio de
cultivo con indicador de pH. Si después de incubarlo hay un viraje de color del
indicador significa que hay crecimiento bacteriano y que por tanto el autoclavado
fue deficiente.

2.3. ESTERILIZACIÓN POR RADIACIÓN GAMMA Y UV

Las ondas de la radiación electromagnética tienen energía, por ejemplo, los rayos X,
rayos gamma, luz ultravioleta (UV), luz visible, luz infrarroja. La energía que posee
la radiación electromagnética es proporcional a la frecuencia de la radiación (ondas
por segundo). La radiación electromagnética de longitud de onda corta como los
rayos gamma y UV, tienen más poder de penetración a la célula y por tanto de
matarla que la radiación electromagnética de longitud de onda larga como la luz
visible o infrarroja. Por esta razón, la irradiación de materiales y sustancias con
rayos gamma y UV es una herramienta poderosa para el control del crecimiento
microbiano y esterilizar.

Las microondas no matan por sí mismas a los microorganismos sino por el calor que
generan. La radiación gamma mata porque genera iones dañinos para la célula como
el ión superóxido (O2 −) y radicales libres hidroxilo (OH•). Se usa el radioisótopo
cobalto-60. Las endosporas son las formas más resistentes a la radiación, en tanto
que las bacterias Gram-negativas son las más susceptibles.

La luz UV a una longitud de onda de 220 a 300nm mata a los microorganismos

dañando su DNA debido a que se forman enlaces covalentes entre timinas
adyacentes formándose los dímeros de timina. Las endosporas son las más
resistentes en tanto que las células vegetativas que se están multiplicando
activamente son las más susceptibles. La lámpara UV y los materiales a esterilizar
deben estar limpios y no cubiertos para una adecuada esterilización. Los parámetros
que deben estandarizarse para la adecuada esterilización de un material dado son la
distancia entre la lámpara UV y el material y el tiempo de exposición.

La persona que realiza este trabajo debe protegerse los ojos y la piel con gafas o
cascos de protección, guantes, mandil, para evitar que la luz UV queme la córnea o
la piel o promueva cáncer a la piel.
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 Este método de esterilización es adecuado para materiales que se dañan por el calor
como plásticos, equipos médicos, entre otros. La esterilización con rayos gamma de
medicamentos y alimentos como frutas, verduras, granos, carnes está aprobada por
la FDA (Food and Drug Administration).

Cabina de seguridad con lámpara UV

2.4. ESTERILIZACIÓN POR FILTRACIÓN

Implica separar o excluir físicamente a todos los microorganismos de líquidos o

gases, al pasarlos a través de filtros de membrana con poros de 0.2μm de diámetro,
en el caso de los líquidos, o a través de filtros HEPA (High Efficiency Particulate
Air), en el caso de los gases o aire.

En el laboratorio de microbiología la esterilización por filtración se aplica

principalmente a soluciones de compuestos que se denaturan con el calor como, por
ejemplo, los antibióticos, drogas inyectables, amino ácidos, vitaminas y factores de
crecimiento, carbohidratos, proteínas, sueros, etc. Asimismo, en el laboratorio de
microbiología el uso más común de los filtros HEPA es para esterilizar el aire de las
cabinas de flujo de laminar.

Los filtros de membrana son de varios tipos, los hay de nitrocelulosa, acetato de
celulosa, policarbonato y PVDF (polyvinylidene fluoruro) o fluoruro de polivinilo.
Los sistemas de filtración son de variados tamaños, los más empleados en el
laboratorio de microbiología son los pequeños para ser usados con jeringas y filtrar
volúmenes de 1, 10 o 20ml, o medianos como para volúmenes de 300, 500 o
1000ml. Hay sistemas grandes que generalmente son de uso industrial, también hay
sistemas portátiles para ser usados en el campo.

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 Embudo con portafiltros de membrana

Filtros de membrana para jeringa

III. PREGUNTAS

1.- Entre los métodos no esterilizantes de control del crecimiento microbiano está la
Pasteurización. Averigüe cómo se realiza y a qué se aplica.
2.- ¿Cuál es la diferencia entre la pasteurización, pasteurización “flash” y ultra
pasteurización (UHT)?
3.- No sólo el calor es un agente para controlar el crecimiento microbiano, también
lo es la temperatura baja. ¿Son o no esterilizantes?
4.- ¿Pueden los microorganismos vivir sin agua?, ¿Hay métodos de control basados
en la eliminación de agua? ¿Qué es la actividad de agua (Aw)?
5.- Los agentes químicos para controlar el crecimiento microbiano en alimentos se
denominan preservantes. ¿Son microbicidas o microbiostáticos? Mencione 3 de los
preservantes más usados y explique la utilidad de cada uno de ellos.
6.- Con un ejemplo explique cómo haría usted el control de calidad de un proceso de
esterilización.

IV GLOSARIO

Horno de convección, logran crear una temperatura uniforme, dentro de sí mismos. No

se trata de que distribuyan la temperatura de manera aleatoria, sino que sus ventiladores
internos logran que la temperatura sea la misma en cada rincón del horno.
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