Guía Practica

FACS – ESFB Elaborado por:

ANÁLISIS
2019 MSc. Juan José Vargas Mamani
FARMACÉUTICO II

PRACTICA Nº 1

MÉTODOS DE CALIBRACIÓN Y SEGURIDAD EN EL LABORATORIO

I. OBJETIVOS:

- Conocer los métodos de calibración de uso más común en el laboratorio

- Aprender las medidas de seguridad en el laboratorio de análisis farmacéutico II
- Aprender el uso del peso patrón y pH patrón.

II. MARCO TEÓRICO:

Calibración
Se entiende por calibración al conjunto de operaciones que establecen, bajo condiciones
específicas, la relación entre las señales producidas por un instrumento analítico y los
correspondientes valores de concentración o masas del conjunto de patrones de calibrado.

Calidad de una Calibración

La calidad de la determinación de una concentración no puede ser mejor que la calidad
intrínseca de la calibración. Los factores que determinan la calidad de una calibración son:

- La precisión de las medidas:

Esta cualidad es estimada a través de la repetitividad y la reproducibilidad de las medidas. La
repetitividad se evalúa a través del cálculo de la desviación estándar relativa (RSD%) de la
medida de los patrones de calibrado. En la práctica puede ocurrir que la repetitividad para los
patrones sea más pequeña que para las muestras, por lo que será necesario preparar
patrones similares a las muestras (simulación de matriz de muestra)) o agregar el analito a
las mismas.

- Exactitud de los patrones.

El valor de concentración o masa asignado a cada patrón trae aparejado un error relacionado
con su preparación. Este error dependerá de la pureza de los reactivos y de que posean un
peso fórmula perfectamente definido, y de las características del material de laboratorio
(pipetas, matraces, etc.). Si los patrones son preparados cuidadosamente, este error en
general resulta pequeño y puede ser despreciado frente al error en las medidas de las señales
producidas por el instrumento.

- Validez de la calibración.
Generalmente es el factor más importante. Cuando se calibra un instrumento se debe tener
una razonable certeza de que éste responderá de igual manera a los patrones así como a las
muestras, aunque éstas posean una matriz relativamente diferente. Si estas diferencias son
muy grandes, pueden llegar a invalidar el proceso de calibración. Es necesario estar
completamente seguro de que el calibrado es válido antes de utilizarlo para obtener el valor
de concentración de muestras incógnita. En caso contrario pueden cometerse serios errores
en la valoración.

- Modelos de Calibración
La forma de calibración más sencilla es la que utiliza un solo patrón. Este método no es en
general lo suficientemente robusto como para utilizarlo en un análisis cuantitativo pero sí para
análisis semicuantitativos. Este modelo es útil sólo cuando el patrón es absolutamente
confiable. Además, se supone que la señal cero del instrumento corresponde al cero de
concentración de la especie que se quiere determinar. Entre el cero y el valor obtenido para
el patrón se realiza una interpolación lineal, pero cálculos de concentración para muestras

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que generen señales mayores que la del patrón no son recomendables. El modelo
correspondiente es:

MÉTODO DE MÍNIMOS CUADRADOS

El método de mínimos cuadrados es la técnica más ampliamente utilizada para ajustar una
recta (o una curva) a un conjunto de puntos. Este procedimiento supone que los errores de
los valores de Y son mucho mayores que los de los valores de X. Esta condición es
normalmente es cierta en una curva de calibrado en la cual la respuesta experimental medida
(valores de Y) es menos cierta que la cantidad del analito (valores de X). Un segundo
supuesto es que las incertidumbres (las desviaciones estándar) de todos los valores de Y son
similares.

La ecuación de la recta es:

Y = mx + b

Donde m es la pendiente y b es la ordenada de origen. La desviación vertical del punto (x, y)

en la figura, es yi – y, donde y es la ordenada de la recta para x = xi

𝑛 ∑(𝑥𝑦) − ∑ 𝑥𝑖 ∑ 𝑦𝑖
𝑚=
𝑛 ∑(𝑥𝑖2 ) − (∑ 𝑥𝑖 )2

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∑(xi2 ) ∑ yi − ∑(xi yi ) ∑ xi
b=
n ∑(xi2 ) − (∑ xi )2

Coeficiente de correlación al cuadrado:

[∑(xi − x̅)(yi − y̅)]2

R2 =
∑(xi − x̅)2 ∑(yi − y̅)2

La raíz cuadrada de este deberá ser cercana a 1 o – 1

PESOS Y PESAS

En el análisis químico cuantitativo ordinario, si se tilia siempre el mismo juego de pesas, no

importa si las masas de los pesos son exactamente las marcadas, a que están en proporción
relativa correcta. La masa de la pesa de 5 g deberá ser exactamente la mitad de de la pesa
de 10 g las otras deberían estar también en proporción. Para establecer esta relación y para
determinar qué factores de corrección deben aplicarse a los pesos individuales de juego
determinado, las pesas deben calibrarse.

Hay varias formas de calibrar pesas. Una de las más simples es suponer temporalmente que
una de las pesas más pequeñas, por ejemplo, la de 10 mg es la correcta y determinar el valor
de las otras pesas con respecto a ella.

DISOLUCIONES DE SUSTANCIAS PATRÓN PRIMARIO

Llamamos sustancias patrón primario a aquellas sustancias lo suficientemente puras y

estables para que baste pesarlas en agua destilada o desioniada, y obtener una solución de
concentración conocida con precisión. Para la preparación de la solución se toma la sustancia
en forma anhidra y se puede secar a temperatura comprendida entre 110 ºC y 150 ºC sin que
se descomponga. Luego se toma el peso exacto requerido para preparar la correspondiente
solución, calculado a partir del peso formula o del peso equivalente.

DISOLUCIÓN DE SUSTANCIAS DE PATRÓN SECUNDARIO

Se denominan sustancias patrón secundario aquellas que no reúnen las condiciones exigidas
para considerarse de tipo primario, son generalmente ácidos o mezclas de ácidos de punto
de ebullición constante, hidróxidos y algunas sales hidratadas en las que es difícil de efecturar
un secado conveniente.

III. MATERIALES Y REACTIVOS:

- Fiola de 25, 50 y 100 ml

- TRIS
- Biftalato ácido de potasio
- Agua destilada
- Balanza analítica
- Espatula
- Calculadora

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IV. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL:

4.1 PREPARACIÓN DE SOLUCIÓN ESTÁNDAR DE BIFTALATO ACIDO DE POTASIO

El ftalato acido de potasio p.a. tiene una purea no menor del 99.9 por ciento; no es
higroscópico, pero no obstante conviene secarlo a 120 ºC durante 2 horas y dejarlo enfriar en
un desecador. Se pesan al 0.1 mg de precisión porciones de 0.6 - 0.7 g de la sal y se las
pasa cuantitativamente a matraces de 250 ml , se agrega 75 ml de agua destilada a cada
matraz y se los tapa y se sacuden suavemente hasta disolución del reactivo. Se titula con
disolución de hidróxido de sodio, usando como indicador fenolftaleína o azul de timol.

PROCEDIMIENTO:

Para principiantes, se prepara una solución aproximadamente 0,1 N. Se pesa, al miligramo,

5,1 g de ftalato ácido de potasio p.a., se disuelven en agua, se lleva a 250 ml en un matraz
aforado y se homogeniza la solución. En las titulaciones con la solución de hidróxido de sodio
se emplean porciones de 25 ml de la solución de ftalato ácido. Las titulaciones individuales
no deben diferir en más de 0,1 ml. Se calcula la normalidad de la solución de hidróxido de
sodio.

4.2 PREPARACIÓN DE SOLUCIÓN ESTÁNDAR DE TRIS

Tris (hidroximetil)aminometano, conocido también como TRIS o THAM, tiene un peso

molecular de 121,14 g/mol. Frente a TRIS el producto comercial se seca durante una hora a
110 ºC por u lapso de 2 horas, luego se enfría en un desecador. Se pesan aproximadamente
0.,24 g (con una precisión de 0,1 mg), se introducen en un Erlenmeyer, se disuelven con agua
destilada y se valora con el ácido correspondiente que se añade desde una bureta de 25 ml.
Como indicador se utiliza el rojo de metilo, que vira de amarillo a rojo.

PROCEDIMIENTO

Para principiantes, se prepara una solución aproximadamente 0,1 N. Se pesa, al miligramo,

3,03 g de TRIS p.a., se disuelven en agua, se lleva a 250 ml en un matraz aforado y se
homogeniza la solución. En las titulaciones con la solución de ácido clorhídrico se emplean
porciones de 25 ml de la solución de TRIS. Las titulaciones individuales no deben diferir en
más de 0,1 ml. Se calcula la normalidad de la solución de ácido clorhídrico.

4.3 CURVA DE CALIBRACIÓN CON DICROMATO DE POTASIO

PROCEDIMIENTO

1. Comenzamos preparando las 8 disoluciones de dicromato utilizando siempre pipetas

y matraces aforados y la balanza de precisión. Se partirá de una disolución trabajo
previamente preparada de concentración 0.25 g/L de dicromato de potasio (K2Cr2O7
Pm = 294.2 g/mol). Cada pareja utilizara esta disolución concentrada para preparar
las siguientes 8 disoluciones más diluidas que serán las que usaremos en el
espectrofotómetro:

Disolución 1: diluir 1 ml de disolución concentrada y aforar a 25 ml.

Disolución 2: diluir 2 ml de disolución concentrada y aforar a 25 ml.
Disolución 3: diluir 4 ml de disolución concentrada y aforar a 25 ml.
Disolución 4: diluir 6 ml de disolución concentrada y aforar a 25 ml.
Disolución 5: diluir 8 ml de disolución concentrada y aforar a 25 ml.

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Disolución 6: diluir 10 ml de disolución concentrada y aforar a 25 ml.

Disolución 7: diluir 12 ml de disolución concentrada y aforar a 25 ml.
Disolución 8: diluir 14 ml de disolución concentrada y aforar a 25 ml.

2. Calcular la molaridad de todas las disoluciones, incluida la concentrada.

3. Con la disolución 4, mediremos el espectro de absorción del dicromato de 325 a 505
nm, realizando primero un blanco con agua pura (consultar con el profesor). A
continuación introducimos una cubeta con la disolución 8(la más concentrada) y
medimos la absorbancia en el intervalo de longitudes de onda fijado tomando valores
cada 20 nm. Repetiremos la operación de manera más fina en la región donde
hayamos observado una mayor absorbancia, tomando valores cada 10 nm.
Establecer, a partir de esta medida, donde se encuentra el máximo de absorción del
ión dicromato. Anotar entonces el valor de absorbancia para esa longitud de onda de
la Disolución 4.
4. Repetir la medida, a la misma longitud de onda (máximo de absorción del dicromato)
para las disoluciones 3,2,1 y de una mezcla problema de concentración desconocida.
Anotar los correspondientes valores de absorbancia frente a concentración para hacer
una recta de calibrado.
5. Procedemos a realizar el análisis de datos:

5.1 Representamos gráficamente el espectro de absorción del dicromato

(absorbancia frente a longitud de onda).
5.2 Representamos la absorbancia en el máximo de las disoluciones 1 – 8 frente a la
molaridad y ajustamos los cuatro puntos a una recta por el método de mínimos
cuadrados. A partir de la regresión lineal obtenida, determinar:

a) El coeficiente de absortividad molar K del anión dicromato

b) La concentración de la muestra problema.

PESADA EN BALANZA ANALÍTICA

Conviene usar un pañuelo o toallita de papel para manipular el recipiente que se va ha

pesar, porque las huellas dactilares pueden variar su masa. Las muestras deben estar a
temperatura ambiente para evitar errores a causa de corrientes de convección del aire.
Una muestra que se ha secado en una estufa necesita unos 30 minutos para que se
enfríe a temperatura ambiente.

V. RESULTADOS:

VI. CUESTIONARIO:

1. ¿Qué es un reactivo estándar?

2. Defina lo que es la absortividad molar.
3. Dibuje las estructuras químicas de los reactivos mencionados.
4. Defina lo que es la ley de Beer – Lambert y mencione sus ecuaciones más importantes
5. De una lista de libros de química analítica existente en la biblioteca central.

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6. A la medida de transaminasas en suero se le denomina se le denomina actividad y se

mide U/L, con los datos que se le proporciona grafique por el método de mínimos
cuadrados y calcule el coeficiente de correlación.

Actividad TGP (U/L) 0 13 28 46 66 90

Absorbancia 0,165 0,240 0,300 0,360 0,410 0,455

7. El ácido pirúvico puede determinarse colorimétricamente por conversión en su 2,4 –

dinitro – fenilhidrazona seguida de la adición de un álcali. Con el fin de calibrar el
colorímetro fotoeléctrico la reacción se llevó a cabo en soluciones que contenían
diversas cantidades de ácido pirúvico, obteniéndose los resultados siguientes:

Acido pirúvico (ug/3 ml) 20 40 60 80 100 125 150 175

Absorbancia 0,130 0,257 0,390 0,515 0,628 0,750 0,855 0,940

Calcule el coeficiente de correlación por el método de mínimos cuadrados.

VII. BIBLIOGRAFÍA:

Pickering W.F. (1980) Química analítica moderna. Ed reverte. España.

Walton Harold (1983) Análisis químico e instrumental moderno. Ed Reverte. España

Dawes E.A. (1965) Problemas cuantitativos de Bioquimica. Ed Acribia. 4º edición. España.

Paz Benjamin, Morales Jessica, Nuñez benjamín (2007) Guía de prácticas y talleres del curso
de bioquímica médica. Universidad privada de Tacna. Perú.

VIII. ANEXOS: