SEPARACIÓN DE CELULAS EN Los linfocitos B son responsables de la

SANGRE PERIFÉRICA, MEDIANTE producción de anticuerpos, mientras que los

EL PROCESO DE GRADIENTE DE linfocitos T producen moléculas de
DENSIDAD Y CENTRIFUGACION. señalización que conducen a la eliminación
de células enfermas o células extrañas.
Los linfocitos están aislados de la «capa
SEGUNDO INFORME LABORATORIO.
leucocitaria» (concentrados de sangre total
sin suero). Las PBMCs se pueden separar de
Autores: Angie Julieth Ramírez; Darcy otros componentes de la sangre, tales como
Karely Gómez; Vladimir Castañeda, Julitza eritrocitos y granulocitos, mediante
Galvis, Nicol Juliana Betancourt. (03.09.19) centrifugación gradiente de densidad usando
Ficoll-Paque PLUS. Ficoll-Paque tiene una
densidad. Debido a su densidad más elevada,
los eritrocitos, los granulocitos y las células
1. INTRODUCCION. muertas pasarán por la capa de Ficoll,
mientras que los linfocitos y los monocitos,
debido a una menor densidad, se acumularán
La sangre es un tejido líquido, que compone en la barrera gradiente de plasma.
gran parte de nuestros cuerpos humanos, que
circula desde nuestros capilares, venas y 2. METODOS.
arterias de todo ser vertebrado. El color rojo  EXTENDIDO DE SANGRE.
de la sangre es debido a la presencia del  Con el micro pipeta, distribuir las
pigmento hemoglobínico, contenido en los muestras de sangre en las laminillas.
eritrocitos. La función de la sangre es
transportar desde componentes como
hormonas, vitaminas, nutrientes, anticuerpos,
oxígeno, dióxido de carbono, calor,
electrolitos, y hasta desechos.
Además de estar compuesta de una forma
igual de plasma y células sanguíneas. Estos
incluyen eritrocitos (glóbulos rojos),
leucocitos (glóbulos blancos) y trombocitos
(plaquetas). Los leucocitos están divididos en
diferentes tipos de células. Estos incluyen
linfocitos y monocitos, que (en cooperación
con otras células) forman la base del sistema
inmunitario innato y a los que nos referimos
como células mononucleares de sangre
periférica (PBMC), debido a su único núcleo.
El término linfocito engloba dos categorías
muy importantes, linfocitos B y linfocitos T.

1
 Con el micro pipeta, poner un punto
de sangre, sobre la lámina.
 Acomodar, la otra lamina de tal
forma. que, al presionar, pueda
extenderse la sangre por el borde.
2
 Procedemos a extender la sangre
sobre la lámina.
 TINCION.
Concepto.
El procedimiento de tinción antes visto en
el anterior informe nos permite realzar la
morfología y composición sin necesidad
de dañar la muestra. En cierta forma no
tiñe la célula, si no que su acción es fijarse
en ciertas zonas específicas de la célula,
permitiendo la identificación mediante la
exposición de las partes de la célula.
Es decir en este caso, podremos
diferenciar ya que los glóbulos blancos al
poseer núcleo, la tinta se fijara en esta
zona permitiendo diferenciarlos, de los
rojos que se caracterizan por tener una
cierta hendidura y ser como alargaditos.
 Agregar sobre la muestra, la tinta  Luego enjuagar con abundante agua.
Wright, hasta cubrir por completo, la
muestra.

 Dejar secar y observar.

 Dejar actuar durante
aproximadamente 10min

3
 Estas de alta velocidad con las de baja
velocidad son empleadas básicamente en
 CENTRIFUGACION. fraccionamiento subceluar. (2)
o ULTRACENTRIFUGAS.

 Concepto centrifuga. Lo máximo de estas centrifugas es que puede

separar incluso hasta proteínas muy
Es una maquina empleada, para obtener la pequeñas. Existen dos tipos de centrifugas en
separación de una muestra y sus las que encontramos, la analítica y la
componentes, por medio de la rotación, preparativa. En ocasiones son confundidas
esto se debe a la fuerza centrífuga, que en pero en realidad, se obtienen resultados
mejores términos se conoce como el diferentes con cada una. (2)
aceleramiento de la decantación, o
sedimentación, según la densidad d cada Como podemos ver existen, diferentes tipos
uno de ellos; generalmente uno sólido y de centrifugas, pero en este caso, la centrifuga
uno líquido.(2) empleada es una de baja velocidad usada para
serologías, debido que el procedimiento a
Los experimentos de laboratorio realizar es muy simple, pero enriquecedor e
requieren el empleo, de centrifugas que interesante. Por medio de la centrifugación
funcionen a velocidades exactas sin nos dispondremos a ver cómo se pueden
fluctuaciones de temperatura, debido a visualizar los componentes de la muestra de
esto las centrifugas son clasificadas por su sangre, obtenida para este experimento, con
velocidad. (2) el acompañamiento del profesor del castillo,
o CENTRIFUGAS DE BAJA y mis compañeros.
VELOCIDAD.
Estas centrifugas por lo general centrifugan,
hasta 6ltr, de sangre periférica a la vez, estas
máquinas son muy rutinariamente empleadas
en procesos de laboratorios simples como la
separación de células y a velocidades
mayores, la separación de organelos con la
ayuda de gradientes de densidad. (2)
o CENTRIFUGAS DE ALTA
VELOCIDAD.
Estas centrifugas, podemos encontrar de dos
tipos unas que manejan la temperatura fría,
guardándola y otra que son al vacío, estas que
son con vacío son mucho más costosas que
las otras.

4
Procedimiento centrifugación: imprescindible calcular de nuevo esta
relación para cada centrífuga. (3)
A continuación, vamos a conocer el modo
de empleo de la centrifuga y el objetivo que  Luego de estar equilibrada y conocer
debemos tener en cuenta, el objetivo que la graduación de la maquina en el
deseamos lograr que es la separación de la tiempo que deseemos, programarla
muestra de sangre periférica. para obtener el resultado que
necesitamos o que buscamos.
Para este procedimiento debemos tener en  A continuación muestro la evidencia
cuenta algunos aspectos, fundamental para el del proceso del experimento llevado
correcto uso de esta máquina: cabo en la práctica.
 primero que todo, esta máquina la
fuerza de gravedad que ejerce el  Acomodar, de tal manera que quede
horizontal. balanceado.
 Posee unos almacenamientos
llamados bogues en donde se procede
a colocar el tubo con la muestra de
sangre.
 Siempre tiene que quedar de manera
balanceada, en caso de que no quede
balanceada la maquina comenzara a
saltar, provocando que se rompan los
tubos de muestra esto podría dañar la
máquina, por eso en este caso
debemos proceder a pagarla muy
rápidamente.
 COMO PUEDO YO CALCULAR O
CONVERTIR, REVOLUCIONES A
GRAVEDADES?

Esta es la fórmula de conversión de la

velocidad de centrifugación de r.p.m.
(revoluciones por minuto) a g (es la fuerza
centrífuga relativa, expresada en g).

Para el cálculo debemos conocer el radio del

Observación; aquí la centrifuga
rotor en centímetros, por lo que es fue programada a 4.000

5
revoluciones por minuto (rpm) Debido a procedemos a emplear un gradiente
densidad, con el que facilitaremos el objetivo
durante 5min. deseado, aquí podremos demostrar como el
¿Cómo lo sabemos? gradiente, es el elemento indicado para este
tipo de procedimientos debido a que facilita
Muy simple en la imagen podemos ver que la sedimentación de los componentes, según
aparece el número (40), pero en realidad este su densidad.
se multiplica por 100, a lo que equivale
realmente la conversión.  GRADIENTE DE
 Nuevamente, centrifugar durante DENSIDAD.
15min.
FICOLL-PAQUE.
Este método se basa en la aplicación de
centrifugación de gradiente de densidad
Ficoll-Paque en tubos cónicos de 15/50 mL o
tubos de muestras de sangre,
respectivamente. (5)

Observación: en el anterior intento, se

programó a 5min por revolución, pero
no se logró el objetivo que es separar la
muestra de sangre periférica.

6
¿Qué es un gradiente de
densidad? o GRADIENTE CONTINUO:

Líquido de densidad concreta que se Se genera con un formador, de gradientes o,

utiliza en la separación de diferentes
tipos de células por centrifugación. Las
células van progresando por el
gradiente hasta que alcanzan el nivel en
que su gravedad específica, es la
misma que la del medio.
De este modo, los diferentes tipos
celulares presentes en la muestra dan
lugar a diferentes bandas en función de
su densidad. (4)
en algunos casos, se generan ellos solos, al
centrifugarlos a velocidades elevadas.
Como podemos darnos cuenta, ya tenemos
una idea especifica del concepto de gradiente
de densidad, en concreto podríamos decir que
es un líquido empleado para separación de
células, lo que hace es facilitar este proceso
de sedimentación, tenemos tres tipos de
gradientes, en este laboratorio el esperado es
el gradiente de densidad discontinuo.
Procedimiento a realizar con el
ficoll-hypaque:

 Procedemos a tomar una

Tipos de gradientes de densidad:
cantidad de ficoll-hypaque.
o GRADIENTE DISCONTINUO:
Se genera superponiendo capas de densidad
decreciente.

7
 Alistar el tubo de muestra, para  Posteriormente colocar, la
poner en el ficoll hypaque. muestra de sangre periférica.

 Proceder a introducirlo dentro

del tubo.

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  Luego se procede a colocar este tubo Estos resultados han sido obtenidos por
tal cual, en la centrifuga, medio del procedimiento de tinción, es un
equilibrándola con otro tubo que método empleado de hace más de 100 años
contiene la muestra de suero, con la por medio del cual se busca, poder diferenciar
misma cantidad para lograr un en este caso los tipos de células en la sangre
equilibrio. las más visibles que son los glóbulos rojos y
los glóbulos blancos.
A continuación podremos evidenciar, el
procedimiento llevado a cabo en la práctica
de los estudiantes en la universidad
cooperativa, pudiendo cumplir esta
competencia.

Glóbulos rojos, mayor cantidad.

Glóbulos blancos, menor cantidad, se puede ver

como resaltan al ser más grandes y más grandes.

 Se programa la centrifuga a
4000(rpm) durante 15mi.

3. RESULTADOS.

 Proceso de tinción.

Palabra clave: tinta Wright, glóbulos Es muy fácil notar la diferencia entre estos dos tipos de
células. A simple vista podemos visualizarlos y diferenciarlos.
rojos, glóbulos blancos.

9
 Glóbulos blancos,
Glóbulos
podemos ver su
rojos.
El lente empleado en estas imágenes que
forma larga y su
estamos plasmando es de 10.10 que hendidura.
equivale, a 100 veces aumentado.

10
 PLASMA

WBCs y plaquetas.

RBSc

Aumento de 100, que equivale a 1000

mil veces más de aumento.

Observación: cómo podemos ver a simple

 Resultado proceso de
centrifugación de muestra de
sangre periférica.
Palabras claves: centrifuga de
velocidad, tubo, sangre periférica.
vista se ven los glóbulos blancos sobre los
rojos aparentemente. A continuación
intentaremos, coger los glóbulos blancos.
baja

PLASMA

RBSc

Al intentar coger el anillo de glóbulos

blancos, no se pudo solo coger esta parte

11
debido a que se vinieron también los glóbulos En este segundo resultado, podemos observar
rojos, con esta proceso podemos concluir que cómo, la sangre se ha podio separar mucho
la sangre no pudo ser separada, con una sola más, se ve muy simplemente, como cada tipo
centrifugación. de células están de forma de gradientes
continuo, ósea que van en segmentos
descendentes.
 Resultados de la Ahora vamos a abstraer los glóbulos blancos
centrifugación, con el para proceder a hacer una nueva
gradiente de densidad, ficoll- centrifugación, para completar la separación
hypaque. y poder obtener el mejor resultado, separando
por completo los glóbulos rojos de los
blancos.

Ficoll-hypaque.

Glóbulos blancos.
 Para el siguiente procedimiento,
entonces vamos a extraer los glóbulos
blancos y en nuevo tubo se mezclaran
con un poco de suero, para de nuevo
centrifugarla y completar el proceso
Glóbulos rojos.
de separación, y poder analizar más
detenidamente los glóbulos blancos.

12
 MEZCLA
. TOTAL, SEPARACION DE LAS CELULAS
DE LA SANGRE; LOS GLOBULOS
 RESULTADO FINAL. BLANCOS.

 En este resultado final podemos

observar que después de un
largo proceso, con diferentes
métodos, pudimos lograr, el
objetivo que teníamos en mente.
 Ahora vamos a proceder a
extraer la muestra final para
expandirla en las laminillas y
observar por medio del
microscopio.

13
 OBSERVACIÓN:

Se pueden observar los glóbulos

blancos, las formas grandes, son
burbujas, pero las pequeñas son las
células de glóbulos blancos.

Glóbulos blancos.

Células de glóbulos blancos, pero en

esta imagen se observan la gran
mayoría destruidas.

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4. DISCUSIÓN.
Para evaluar el laboratorio, terminado este
proceso, tan largo a mi parecer, cada método
que pudimos emplear, fue de gran ayuda,
cada etapa culminada arrojo diferentes
resultados, permitiéndonos diferentes
conocimientos, como poder observar que
sucedía con cada método.
La tinción para empezar es método que nos
ayuda en primer lugar poder distinguir las
células de la sangre, en este caso las más
notorias como lo son los glóbulos rojos, de los
blancos; gracias a este método que pudimos
observar, pudimos concluir que en la sangre
los glóbulos rojos son mayoría, los glóbulos
blancos son minoría.
El proceso de centrifugación, es un método
que se emplea por medio de la centrifuga, en
donde por medio de fuerza de gravedad en
este caso horizontal, permite la separación de
un elemento. En la primera centrifugación
ejercida, pudimos observar que no fue
suficiente, aunque la sangre aparentemente
estaba separada, al momento de tomarla fue
imposible, por eso se prosiguió a continuar
con una nueva centrifugación tomando de
esta muestra anterior sangre nuevamente, que
posteriormente, fue centrifugada añadiendo el
gradiente de densidad, gracias a este pudimos
tener un mejor resultado, pudimos ver como
obtuvimos el resultado de una separación de
gradiente de forma continua, esto significa
que el resultado estaba en el tubo de forma
descendente.
Luego posteriormente al tomar nuevamente
una muestra de este resultado y mezclarlo con
suero, procedimos a centrifugar de nuevo,
dándonos por resultado final, la total
separación e donde pudimos obtener la
15
evidencia de que si es posible la separación
de las células, en este caso en la sangre.
Todo esto fue facilitado gracias al elemento
clave empleado llamado, ficoll-hypaque, que
en comparación a la primera centrifugación,
sin el uso de este, no fue posible la separación
completa de las células de la sangre, a
diferencia que con su empleo permitió la
completa separación, de las células
permitiéndonos llegar al resultado final
deseado, para poder observar, ser testigos, y
constatar la veracidad de estos métodos.
5. CONCLUSIÓN.
Para métodos de centrifugación,
recomendamos el uso de ficoll-hypaque, para
obtener mejores y más acertados resultados
de lo que buscamos. Hoy pudimos comprobar
que con este método obtener resultados de
alta calidad.
Sin el gradiente de sedimentación, hubiese
sido imposible obtener la completa
separación de células y componentes de la
sangre y gracias a todo este proceso pudimos
aprender estos métodos científicos empleados
para la separación de componentes, desde su
realización, y poder saber que es más
eficiente.
6. BIBLIOGRAFIA.
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2. https://www.eppendorf.com/product-
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R_Centrifuge-5910-R_Faster-Isolation-
PBMC-Ficoll-Paque-Plus-Eppendorf-
Multipurpose-Benchtop-Centrifuges-
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3. http://www.noticiascientificas.info/201
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Multipurpose-Benchtop-Centrifuges-
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