INFORME DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA GENERAL

COLORACION DE ZIEHL-NEELSEN

FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD

MICROBIOLOGÍA
VALLEDUPAR/CESAR
2019
 INTRODUCCIÓN

A medida que la población mundial ha ido creciendo, lo mismo sucede con la ciencia
desde tiempos de antaño. Ahora bien, dentro la microbiología existe diferentes
factores para reconocimiento de bacterias, una de ellas es la tinción y existen
diferentes tipos de tinción que a su vez nos muestran características importantes de
microorganismos, ya sea si son bacilos, cocos etc.
Existe una gran variedad de tinciones y cada una cuenta con características
importantes y específicas, con una serie de pasos que se deben cumplir para que
dicha tinción salga bien. Una de las tinciones más importantes y reconocibles en la
tinción de Gram pues gracias a esta podemos encontrar dos grandes ramas como
son las Gram negativas y las Gram positivas gracias a esta información cualquier
microbiólogo puede partir de cierto camino a escoger, por otra parte, encontramos
un tipo de tinción que sirve para reconocer e identificar bacterias ácido-alcohol
resistente. Y su autor principal es Ziehl-Neelsen. La tinción que descubrió es una
técnica de tinción sencilla y rápida, en base a lo anterior se dará conocer a través
de unas muestras de esputo, el reconocimiento de bacterias ácido-alcohol
resistente.
Las tinciones en microbiología son las primeras herramientas que se utilizan en el
laboratorio para el diagnóstico de las enfermedades infecciosas. Desde hace más
de un siglo han ayudado a resolver problemas de etiología microbiana. Hay una
gran variedad de tinciones, que se han ido desarrollando para la detección de los
diferentes agentes infecciosos –en los que se incluyen bacterias, parásitos y
hongos–. La tinción de Gram se considera básica en la valoración inicial de
muestras para análisis bacteriológico, mientras que la tinción de Wright se ocupa
para el diagnóstico de enfermedades muy particulares en el rubro de la
parasitología. Hay técnicas tintoriales específicas de gran utilidad, como la tinción
de Ziehl-Neelsen, que se utiliza para el diagnóstico de enfermedades crónicas como
la tuberculosis o la actinomicosis, o la tinción de azul de lactofenol, que preserva e
identifica a los componentes estructurales de los hongos. Las diferentes tinciones
en el laboratorio microbiológico tienen una utilidad fundamental para el diagnóstico
y tratamiento oportuno de múltiples patologías de etiología infecciosa.
 OBJETIVOS
General

 Conocer las diferencias entre bacterias ácido-alcohol resistentes (BAAR) de

las que no lo son. Usando, para ello, la tinción diferencial de Ziehl-Neelsen.
Especifico

 Realizar la tinción de Ziehl-Neelsen a partir de la muestra de esputo.

 Aprender los colorantes utilizados para dicha tinción.
 Conocer la función de cada colorante en la tinción de Zielh Neelsen.
 Visualizar y reconocer lo que hay en la muestra a partir de la tinción de Ziehl-
Neelsen.
 MARCO TEÓRICO

La tinción de Ziehl-Neelsen es una técnica de tinción diferencial rápida y

económica, usada para la identificación de bacterias ácido-alcohol resistentes
(BAAR) , como M. tuberculosis o el Phylum Apicomplexa (coccidios intestinales)
entre otros. Fue descrita por primera vez por dos médicos alemanes: Franz Ziehl,
un bacteriólogo, y Friedrich Neelsen, un patólogo.

La tinción de Ziehl-Neelsen es una técnica de tinción diferencial que se basa en que

las paredes celulares de ciertas bacterias contienen ácidos grasos (ácidos
micólicos) de cadena larga (50 a 90 átomos de carbono) que les confieren la
propiedad de resistir la decoloración con alcohol-acido, después de la tinción con
colorantes básicos. Las micobacterias absorben los colorantes solo muy lentamente
debido a la elevada proporción de ceras y lípidos en la pared celular. Para acelerar
la absorción del colorante fucsina y así la formación del complejo micolatofusina en
la pared celular, se calienta la solución de fucsina fenicada aplicada sobre el
preparado normalmente hasta la formación de vapores. Una vez que las
micobacterias han absorbido el colorante, difícilmente lo ceden a pesar del
tratamiento con solución decolorante alcohol-ácido clorhídrico. Por esto se
denominan bacilos alcohol acido resistente o BARR y aparecen en el preparado
microscópico teñidas de rojo, mientras que todos los microorganismos no
resistentes a los ácidos se tiñen de acuerdo con la contra tinción.

Esta tinción tiene interés desde el punto de vista del diagnóstico clínico puesto que
algunos microorganismos patógenos ácido-alcohol resistentes, tales como
Mycobacterimum tuberculosis son patógenos muy importantes para los humanos.
MICOBACTERIAS.

Las micobacterias son bacilos aerobios no formadores de esporas, existen más de

50 especies de Mycobacterium, las cuales incluyen muchas que son saprófitas.
Entre las especies consideradas patógenas tenemos al M. tuberculosis cuyo único
reservorio es el humano, es el agente causal de la tuberculosis pulmonar y
diseminada. El M. leprae en el causante de la lepra y al igual que en el M.
tuberculosis su reservorio es el humano.

Mycobacterium bovis también está considerado dentro de este grupo, origina una
enfermedad similar a tuberculosis.
Otras especies potencialmente patógenas en humanos tales como: el M. avium-
intracellulare y las atípicas con frecuencia infectan a pacientes con SIDA, son
patógenos oportunistas en otras personas inmunodeficientes, y en ocasiones
producen enfermedad en pacientes con sistema inmunitario normal.

Las micobacterias no constituyen el único grupo que tienen propiedades

alcohol-acido resistentes. Las especies de Nocardia y Rhodococcus poseen una
alcohol-acido resistencia parcial, así como Legionella micdadei causante de
neumonía. Los quistes de los géneros Cryptosporidium e Isospora tienen resistencia
definida a las tinciones con ácido alcohol.
Pared Celular de las bacterias Acido- Alcohol Resistentes (BAAR).

Químicamente, la pared celular de los BAAR consiste en un esqueleto formado por

dos tipos de polímeros, unidos covalentemente entre sí:

 Un peptidoglucano especial (la diferencia más importante es que en vez de

N-acetil murámico existe N-glucolil-murámico);
 Un arabinogalactano de gran peso molecular.
Ambos polímeros se encuentran enlazados a través de fosfodiéster entre una
unidad de murámico y una de las arabinosas. Pero a su vez, este esqueleto se une
covalentemente a los ácidos micólicos.

Los ácidos micólicos son ß-hidroxiácidos grasos ramificados en a, cuya longitud de

cadena es grande (desde C78 a C91 en Mycobacterium). Están unidos al esqueleto
de la P.C. de forma uniforme, a través de enlaces con los -OH en 5 de las unidades
de arabinosa.
Por lo tanto, el esqueleto de la P.C. de estas bacterias consiste en:
peptidoglucano---arabinogalactano---ácidos micólicos.
Pero aparte de este esqueleto complejo, la P.C. de las bacterias ácido-alcohol
resistentes exhibe una variedad de lípidos:
1) Glucolípidos:

a) Micolatos de trehalosa: Constituyen el llamado factor de crecimiento en

cuerdas, debido a que son responsables de la agregación de los individuos
bacterianos en forma de “cuerdas”.

b) Sulfolípidos de trehalosa: están localizados en la periferia de la P.C., y parecen

ser importantes factores de virulencia. En Mycobacterium tuberculosis estos
sulfolípidos de trehalosa funcionan como evasinas, es decir, facilitan el que la
bacteria escape a la acción de los macrófagos inhibiendo la fusión del fagosoma
con el lisosoma, lo cual puede explicar el hecho de que estos microorganismos
tengan éxito como parásitos intracelulares.

c) Micósidos: Localizados en la periferia, consisten en la unión por enlace éster

entre ácidos micólicos y azúcares (incluyendo ácidos urónicos, desoxiosas,
aminozúcares, etc.).

2) Ceras: Unión de ácidos micólicos con tioceroles (alcoholes ramificados de alto

peso molecular).

El alto contenido en lípidos confiere una serie de propiedades a estas bacterias

(aparte de la ácido-alcohol resistencia ya citada): aspecto y consistencia cérea de
sus colonias; crecen formando grumos en medios líquidos; gran impermeabilidad
de la P.C., que a su vez condiciona una gran resistencia a la desecación y gran
resistencia a sustancias antibacterianas (detergentes, oxidantes, ácidos, bases,
etc).
MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS.

Las estadísticas muestran que un tercio de la población mundial está infectada

por el bacilo causante de la tuberculosis. Según la Organización Mundial de la
Salud, “Una persona con tuberculosis activa, no tratada, infecta un promedio de 10
a 15 personas al año y cada segundo se produce en el mundo una nueva infección
por el bacilo de la tuberculosis. Del 5 % al 10% de las personas infectadas por el
bacilo de la tuberculosis, enferman o son contagiosas en algún momento de sus
vidas. La tuberculosis es la principal causa de muerte en las personas infectadas
por el VIH.

La transmisión de los bacilos de la tuberculosis se produce casi exclusivamente

por medio de núcleos suspendidos en pequeñas gotas que son expulsadas con la
expectoración de las personas afectadas por tuberculosis pulmonar. Estas
pequeñas gotas pueden permanecer infectantes en el aire durante bastante tiempo
y pueden ser inhaladas por otras personas. La infección de los contactos es más
probable cuando conviven o permanecen durante un tiempo prolongado cerca del
enfermo que está expectorando bacilos y en un ambiente poco ventilado. No todas
las personas infectadas enferman, sólo una de cada diez aproximadamente, que
son las más susceptibles. La tuberculosis puede manifestarse en cualquier órgano,
porque M. tuberculosis se disemina por todo el organismo; sin embargo, la
enfermedad pulmonar es la más frecuente (80-85% de todos los casos
diagnosticados) debido a que el bacilo necesita abundante oxígeno para
multiplicarse. En los pulmones de los enfermos se pueden formar cavidades en las
que se alojan grandes poblaciones de bacilos que pueden ser detectados en
muestras de esputos. Los síntomas más característicos de la tuberculosis
pulmonar son la tos y la expectoración persistentes por más de 2 semanas. A las
personas con estos síntomas se Los llama Sintomáticos Respiratorios (SR). Otras
manifestaciones pueden ser pérdida de peso, febrícula, sudores nocturnos,
cansancio físico y dolores de tórax.

El diagnóstico de certeza de tuberculosis puede hacerse en forma confiable en el

laboratorio demostrando la presencia de bacilos en una muestra de La lesión o el
cultivo.
LA MUESTRA.

La muestra más examinada es el esputo debido a que, como se ha dicho, la

tuberculosis pulmonar es la más frecuente. Sin embargo, dado que la enfermedad
puede manifestarse en cualquier órgano, con menor frecuencia puede requerirse la
investigación de muestras muy variadas: orina, líquido cefalorraquídeo, líquido
pleural, líquido ascítico, sangre, pus de cavidades abiertas, biopsias. Estas
muestras de lesiones extrapulmonares deben procesarse también por cultivo.
EL ESPUTO.
El envase.
Debe tener las siguientes características:
• Boca ancha: de no menos de 50 mm de diámetro
• Capacidad entre 30 y 50 ml: para facilitar que el paciente pueda
Depositar la expectoración con facilidad dentro, sin ensuciar sus
Manos o las paredes del frasco y para que en el laboratorio se pueda
Seleccionar y tomar la partícula más adecuada, con comodidad, para
Realizar el extendido.
• Cierre hermético: con tapa a rosca, para evitar derrames durante
El transporte y la producción de aerosoles cuando se abre en el laboratorio.
• Material plástico transparente, resistente a roturas, para poder
Observar la calidad de la muestra cuando la entrega, evitar
Roturas y derrames de material infeccioso y para que pueda ser desechado.
Obtención espontánea del esputo.
Para la recolección de las muestras:
• Elegir un lugar bien ventilado y que ofrezca privacidad.
Puede ser una habitación bien ventilada y con acceso de luz natural (sol) o algún
lugar abierto no concurrido.

• Entregar el envase de recolección ya rotulado con su nombre o número de

identificación y el servicio que solicita. Estos datos deben ser escritos en la pared
del frasco y no en la tapa para evitar errores, con rótulos que no se despeguen o
con lápiz indeleble.

• Obtener una buena muestra de esputo instruyendo al paciente con lenguaje simple
y comprensible para que:
- inspire profundamente llenando sus pulmones de aire tanto como sea posible
- retenga el aire un momento (10 a 15 segundos)

- expulse luego la expectoración con un esfuerzo de tos, tratando de arrastrar las

secreciones del pulmón

- recoja el esputo producido dentro del envase tratando de que entre en su totalidad,
sin manchar sus manos o las paredes externas del frasco
- repita esta operación otras dos veces colocando todas las secreciones en el mismo
frasco

- limpie el exterior del envase con un pañuelo de papel y se lave las manos con agua
y jabón
Calidad de la muestra

La muestra de esputo mucopurulenta, proveniente de árbol bronquial, es la que

asegura mayor probabilidad de que se puedan observar bacilos

Una buena muestra tiene aproximadamente 3 a 5ml, es generalmente espesa y

mucoide. Puede ser fluida con partículas de material purulento. El color es variable
(blanco, amarillento y hasta verdoso). A veces son sanguinolentas.
Las secreciones nasales, faríngeas o la saliva no son buenas muestras para
investigar tuberculosis, aunque es conveniente examinarlas, de todas formas,
porque siempre existe la posibilidad de que contengan parte de la expectoración o
bacilos expulsados por la tos que hayan quedado en la boca, nariz o faringe.
 MATERIALES

 Microscopio
 Papel absorbente
 Fósforos
 Alcohol y algodón
 Porta objetos y cubreobjetos
 Asa redonda
 Mechero
 Staphylococcus aureus
 Klebsiella pneumoniae
 PROCEDIMIENTOS Y RESULTADOS

Nota: Antes de cada laboratorio que requiera el uso del microscopio se debe limpiar
cuidadosamente antes, durante y después de la practica con alcohol y algodón.
Procedimiento 1
Preparación de frotis bacteriano (muestra de esputo).
Esta preparación se hace en un portaobjetos limpio y seco, siguiendo las
precauciones de esterilidad, flameándolo para eliminar grasa y suciedad alguna. Se
toma la muestra de esputo, con una aza bacteriológica se lleva al portaobjeto
haciendo un extendido más o menos de 2 centímetro por uno de ancho. Dejando
que el frotis se seque a temperatura ambiente.
Luego se calienta la muestra, para fijarla al portaobjeto, para seguir con la tinción,
primero se cubre con la solución de carbol fucsina, colorante básico primario.
Calentar la muerta, esto se hace durante 5 minutos, después de esto se lava la
muestra, para llevarla al segundo paso de la coloración, cubriéndola la muestra con
el alcohol acido durante 2 minuto o hasta que el frotis este decolorado. Se lava la
muestra para luego cubrirla con el segundo colorante el azul de metileno durante 2
minutos. Se procede a lavarla nuevamente dejándola secar para luego examinarla
al microscopio usando el objetivo de 100x y el aceite me inmersión.
Resultado
Muestra #1
Observamos pequeños bacilos alargados, sin
movilidad, disperso en toda la muestra, pero en muy
poca cantidad estos eran de color rojo, se hizo un
buen enfoque para lograr verlos bien por lo que
muchos se encontraban en medio del esputo que
había sido coloreado de azul. Estos bacilos son lo de
la tuberculosis; llamado Mycobacterium tuberculosis.

Teóricamente los microorganismos que se tiñan de

un color rojizo se consideran ácido alcohol resistente
positivo (BAAR+).
Muestra #2
Se observa un cuerpo fructífero con conidias, fiálides
alargadas, de color azul totalmente por la tinción,
también se pudo ver que había dos clases diferentes
de hifas unas delgadas y otras gruesas lo que nos
puede indicar que se encuentran dos clases de
hongos diferentes, pero no se logró ver su cuerpo
fructífero.

El primer hongo observado se supone que es el

aspergillus ssp. La mayoría de los casos están
producidos por Aspergillus fumigatus, A. flavus y A.
niger. Si los microorganismos se tiñen de azul, se
consideran ácido alcohol resistente negativos (BAAR-).

Procedimiento 2
Procedimiento de gran variable: KOH 3%
Pará el procedimiento se utilizó dos cultivos puros de K. Pneumoniae y S. Aureus.

En un portaobjeto se agregó una gota de KOH al 3%. Se encendió el mechero, se

esteriliza el asa redonda en la parte adelante del mechero se abre un poco la caja
de Petri se agarra una pequeña muestra de los cultivos (para cada cultivo se realizó
un montaje diferente). Colocándola en la gota de KOH al 3%, y se realizó
movimientos circulares para luego dejarla actuar por un minuto.

Interpretación: Si al separar el asa de la mezcla se forma una hebra viscosa, la

prueba es positiva e indica que se trata de bacterias Gram negativas. Si al separar
el asa no se forma hebra, la prueba es negativa, e indica que las bacterias son Gram
positivas.
 CULTIVOS MACROSCÓPICOS PRUEBA KOH 3%

Es hialino, se observa una Observamos que no se

colonia que crece lisa, genera ninguna mucosidad
suave, de color y aspecto ya indicando que es una
cremoso. bacteria Gram positiva.

Staphylococcus aureus

Es hialino, se observa una Observamos que se genera

colonia rugosa, un poco mucosidad o un hilo
elevada. De color y aspecto confirmándonos que es una
cremoso. bacteria Gram negativa.

Klebsiella pneumoniae

Resultado
 CONCLUSIÓN

Del desarrollo de la practica la coloración de Ziehl-Neelsen, se pudo concluir que:

 En el procedimiento del KOH al 3% se pudo determinar si un cultivo puro
es Gram positivo o Gram negativo antes de hacerle la tinción y observarlo al
microscopio, para evitar las Gram variables.
 Observamos los diferentes microorganismos como bacterias y hongos que
se puede encontrar en nuestro organismo por medio de la muestra de esputo.
 Se pudo determinar mediante la tinción de Ziehl-Neelsen que bacterias son
alcoholes resistentes y cuales no mediante la coloración que estas toman.
 Cabe resaltar que es sumamente importante hacer una buena toma y
extendido de la muestra para identificar bien los microorganismos.
 Por último, recordar que las tinciones utilizadas en el laboratorio de
microbiología permiten el diagnóstico oportuno y sugerente de los agentes
infecciosos, por lo que juegan un papel importante en la decisión del
tratamiento inicial de las enfermedades infecciosas. Se debe practicar la
tinción adecuada de acuerdo con el agente infeccioso en sospecha y el tipo
de muestra clínica.
 BIBLIOGRAFIA

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