UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS

INSTITUTO DE QUÍMICA

Extração e amplificação de RNA do vírus da dengue em

microchips de Poliéster-Toner (PeT)

Thiago Dadalto Gimenez

Orientadora: Profa. Dra. Gabriela Rodrigues Mendes Duarte

Coorientador: Prof. Dr. Alexandre Melo Bailão

Goiânia
2016
 UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
INSTITUTO DE QUÍMICA

Extração e amplificação de RNA do vírus da dengue em

microchips de Poliéster-Toner (PeT)

Thiago Dadalto Gimenez

Dissertação apresentada ao Instituto

de Química da Universidade Federal
de Goiás como exigência para
obtenção do título de Mestre em
Química

Orientadora: Profa. Dra. Gabriela Rodrigues Mendes Duarte

Coorientador: Prof. Dr. Alexandre Melo Bailão

Goiânia
2016
AGRADECIMENTOS

Primeiramente, a meus pais, por tudo o que já fizeram por mim e

continuam a fazer. Por todo apoio que me deram desde que decidi sair do
Paraná e vir para Goiânia. E aos meus irmãos que também me deram forças
para que eu enfrentasse essa jornada.
À minha orientadora, Profa. Dra. Gabriela Rodrigues Mendes Duarte,
pela oportunidade de desenvolver este trabalho, pelo acolhimento em
Goiânia, pelos ensinamentos, pela paciência, e pelo otimismo de que tudo ia
dar certo.
Ao meu coorientador, Prof. Dr. Alexandre Melo Bailão, pela
oportunidade de trabalhar em seu laboratório (Laboratório de Biologia
Molecular – LBM/ICB/UFG) e pelos auxílios prestados durante a realização
desse projeto.
À Profa. Dra. Fabíola Souza Fiaccadori (IPTSP/UFG), pelo
fornecimento das amostras de soro de pacientes infectados com dengue, por
todo o auxílio prestado no desenvolvimento do trabalho, pelas sugestões
dadas no exame de qualificação, e pela participação na banca da defesa da
dissertação.
Ao Prof. Dr. Wendell Karlos Tomazelli Coltro (IQ/UFG), por
disponibilizar a estrutura de seu laboratório e por todas as sugestões dadas
no exame de qualificação.
Aos meus amigos do Paraná, especialmente o Eduardo (Taka), Paulo
e Vítor, pelos momentos de conversa e diversão nas poucas vezes em que
nos encontramos.
Aos meus colegas do grupo de Bio-microfluídica do Instituto de
Química: Habsarai, Pâmela, Thiago, e principalmente Kezia (minha colega
desde o início e precursora no trabalho com a LAMP) e Geovana (que
ajudou muito na RT-LAMP, e que tem um plano).
Aos meus colegas do Laboratório de Biologia Molecular: Leandro,
Laura, Lucas, Sheila, Meire, Karla, Igor, Dani, Gabriel, Janaína, Isabella,
André, Davi, e todas as outras muitas pessoas que trabalham lá. Faço aqui
um agradecimento especial ao Luiz Paulo, pelos incontáveis auxílios
prestados.
Ao pessoal do Laboratório de Virologia, principalmente ao Marielton, à
Anielly e à Thaís, por todo auxílio.
Ao Prof. Dr. Elias Yuki Ionashiro (IQ/UFG), pela participação na banca
da defesa da dissertação.
A todo o pessoal da secretaria da Pós-Graduação do Instituto de
Química pela assistência no decorrer do mestrado.
Ao CNPq pela bolsa de mestrado concedida.
A todas as outras pessoas e instituições que, de alguma maneira,
contribuíram direta ou indiretamente para que este trabalho fosse
desenvolvido.
SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS ............................................................................ i

LISTA DE TABELAS ........................................................................... iii

LISTA DE ABREVIAÇÕES .................................................................. iv

RESUMO .............................................................................................. vi

ABSTRACT .......................................................................................... vii

CAPÍTULO 1: APRESENTAÇÃO DA DISSERTAÇÃO E

INTRODUÇÃO GERAL ........................................................................ 1

1.1 INTRODUÇÃO .............................................................................. 2

1.1.1 Apresentação da dissertação ............................................... 2

1.1.2 Sistemas analíticos miniaturizados ...................................... 3

1.1.2.1 Tecnologias de microfabricação ................................. 5

1.1.2.2 Microdispositivos de poliéster-toner ........................... 7

1.1.3 Dengue ................................................................................. 10

1.1.3.1 Estrutura do DENV ..................................................... 12

1.1.3.2 Diagnóstico laboratorial da infecção pelo DENV ........ 13

1.2 REFERÊNCIAS ............................................................................. 15

CAPÍTULO 2: EXTRAÇÃO DE RNA EM MICROCHIPS DE
POLIÉSTER-TONER ........................................................................... 23

2.1 INTRODUÇÃO .............................................................................. 24

2.1.1 Extração de RNA em microdispositivos ............................... 25

2.1.2 Purificação de ácidos nucleicos utilizando sílica como fase
sólida .............................................................................................. 26

2.2 OBJETIVOS .................................................................................. 29

2.2.1 Objetivo geral ....................................................................... 29

2.2.2 Objetivos específicos ........................................................... 29

2.3 MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................. 29

2.3.1 Material de estudo, reagentes e soluções ........................... 29

2.3.2 Preparo das partículas magnéticas ...................................... 30

2.3.3 Lise e rompimento de envelope e capsídeo ........................ 31

2.3.4 Extração dinâmica em fase sólida de RNA em microtubo ... 31

2.3.5 Avaliação da pureza e qualidade do RNA extraído ............. 32

2.3.6 Fabricação dos microchips de poliéster-toner ..................... 34

2.3.7 Extração dinâmica em fase sólida de RNA em microchips
de poliéster-toner ........................................................................... 35

2.4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ..................................................... 36

2.4.1 Extração dinâmica em fase sólida de RNA em microtubo ... 36

2.4.2 Extração dinâmica em fase sólida de RNA em microchips
de poliéster-toner ........................................................................... 39
2.4.2.1 Otimização dos parâmetros para purificação de RNA
a partir de amostra de soro em microdispositivos de poliéster-
toner ......................................................................................... 42
2.4.2.2 Perfil de eluição de RNA extraído em microchips de
poliéster-toner .......................................................................... 45

2.5 CONCLUSÃO ................................................................................ 47

2.6 REFERÊNCIAS ............................................................................. 48

CAPÍTULO 3: AMPLIFICAÇÃO ISOTÉRMICA MEDIADA POR
LOOP PÓS TRANSCRIÇÃO REVERSA (RT-LAMP) EM
MICROCHIPS DE POLIÉSTER-TONER ............................................. 52

3.1 INTRODUÇÃO .............................................................................. 53

3.1.1 Aplicações da amplificação isotérmica mediada por loop .... 58

3.2 OBJETIVOS .................................................................................. 59

3.3 MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................. 59

3.3.1 Material de estudo, reagentes e soluções ........................... 59

3.3.2 Fabricação dos microchips de poliéster-toner ..................... 60

3.3.3 Amplificação isotérmica mediada por loop pós transcrição
reversa ........................................................................................... 60

3.4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ..................................................... 61

3.5 CONCLUSÃO ................................................................................ 63

3.6 REFERÊNCIAS ............................................................................. 64

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Etapas do processo de fabricação de microdispositivos de

poliéster-toner por impressão direta com camada de toner simples. I)
Folha de poliéster perfurada (topo); II) Folha de poliéster com toner
(base); III) Alinhamento e laminação da base e topo; IV) Criação de
reservatórios para amostras e reagentes. Adaptado de DO LAGO et
al., 2003 ................................................................................................. 7

Figura 2. Distribuição global do risco de infecção por dengue.

Adaptado de WHO, 2012 ...................................................................... 10

Figura 3. Estrutura genômica do vírus dengue. Fonte: Guzman et al.

(2010) .................................................................................................... 13

Figura 4. Representação das etapas de fabricação dos microchips de

poliéster-toner para extração de RNA. (I) filme de poliéster; (II) filme
de poliéster revestido com camadas de toner em ambos os lados; (III)
layout do canal recortado em uma cortadora a laser; (IV) alinhamento
das quatro folhas de poliéster. Adaptado de Duarte et al., 2011 .......... 35

Figura 5. Gel de agarose mostrando em (3) o produto de 482 pb

obtido após amplificação via RT-PCR e semi-nested-PCR a partir de
RNA do DENV-1 extraído a partir de soro por extração dinâmica em
fase sólida em microtubo; (1) marcador de tamanhos de DNA; (2)
controle negativo .................................................................................... 38

Figura 6. Gel de agarose mostrando em (2) o produto de 482 pb

obtido após amplificação via RT-PCR e semi-nested-PCR a partir de
RNA do DENV-1 extraído a partir de amostra pré-purificada em
microchip de poliéster-toner, através da extração dinâmica em fase
sólida; (1) marcador de tamanhos de DNA; (3) controle negativo ......... 39

Figura 7. Géis de agarose mostrando o sucesso das reações de

amplificação por (a) RT-PCR e (b) RT-LAMP utilizando RNA do
DENV-1 extraídos a partir de soro em microchips de poliéster-toner,
através da extração dinâmica em fase sólida. (1) marcador de
tamanhos de DNA; (2) controle negativo; (3) Produto de amplificação
de RNA extraído a partir de amostra de soro em microchip .................. 41

i
Figura 8. Quantidade de RNA purificado em função do tempo de
agitação das partículas magnéticas na etapa de adsorção (n=5) ......... 43

Figura 9. Quantidade de RNA purificado em função do tempo de

agitação das partículas magnéticas na etapa de eluição (n=5) ............ 44

Figura 10. Quantidade de RNA purificado em função do pH da

solução de hidrocloreto de guanidina (n=5) .......................................... 44

Figura 11. Quantidade de RNA purificado em função da quantidade

de partículas magnéticas utilizadas no processo de extração (n=5) ...... 45

Figura 12. Perfil de eluição de RNA extraído a partir de amostra de

soro em microchips de poliéster-toner, com frações eluídas contendo
5 µL de solução (n=3) ............................................................................ 46

Figura 13. Mecanismo da etapa não cíclica da LAMP. a) Regiões do

DNA alvo: F3, F2, F1, B1c, B2c e B3c; e iniciadores: FIP, BIP, F3 e
B3. b) (1) O iniciador FIP se anela à região F2c e ocorre a síntese da
fita complementar; (2) O iniciador F3 se anela à região F3c e a fita é
deslocada. (3) A fita liberada na etapa anterior forma uma estrutura de
loop (laço), gerando a estrutura 4. (4) O iniciador BIP se anela à
região B2c e ocorre a síntese da fita complementar, eliminando o loop
da outra extremidade; o iniciador B3 se anela à região B3c e a fita é
deslocada. A fita liberada na etapa anterior forma duas estruturas de
loop (laço), gerando a estrutura 5. Fonte: Tomita et al. (2008) .............. 55

Figura 14. Mecanismo da etapa cíclica da LAMP. Partindo da

estrutura (5), ocorre anelamento do iniciador FIP à região F2c na
extremidade do loop formado por F1 e F1c. Após uma série de etapas,
obtém-se a estrutura 7, que é complementar à estrutura 5. A estrutura
7 dá origem à estrutura 8, a partir do anelamento do iniciador BIP na
região B2c do loop formado por B1c e B1, na extremidade direita da
fita. A estrutura 5 pode ser novamente produzida após uma série de
etapas. Estruturas mais alongadas, como a 11 e 12, podem também
ser obtidas. Fonte: Tomita et al. (2008) .................................................. 56

Figura 15. (a) Gel de agarose mostrando os produtos de amplificação

de amostra de RNA do DENV-1 obtidos através da amplificação
isotérmica mediada por loop pós transcrição reversa (RT-LAMP) em
microdispositivos de poliéster-toner; (1) produtos de amplificação; (2)
controle negativo; (3) marcador de tamanhos de DNA. (b) Detecção
visual da amplificação do vírus da dengue através da adição de
BoboTM .................................................................................................... 63

ii
LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Sequências dos iniciadores utilizados nos experimentos de

amplificação pós transcrição reversa para a avaliação da qualidade do
RNA ........................................................................................................ 33

Tabela 2. Valores das razões entre as absorbâncias em 260 e 280 nm

de RNA purificado a partir de amostra de soro pelos métodos de
extração dinâmica em fase sólida e extração líquido-líquido em
microtubos de polipropileno ................................................................... 36

Tabela 3. Valores das razões entre as absorbâncias em 260 e 280 nm

de RNA purificado a partir de amostra de soro pelos métodos de
extração líquido-líquido em microtubos de polipropileno e extração
dinâmica em fase sólida em microtubos e em microchips de poliéster-
toner ...................................................................................................... 38

iii
LISTA DE ABREVIAÇÕES

µTAS – Micro total analysis systems (Microssistemas para análises totais)

BSA – Bovine serum albumine (Albumina de soro bovina)

cDNA – DNA complementar

CO2 – Dióxido de carbono

CTD – Camada de toner dupla

CTS – Camada de toner simples

DNA – Ácido desoxirribonucleico

dNTP's – Desoxirribonucleotídeos fosfatados

dSPE – Dynamic solid phase extraction (Extração dinâmica em fase sólida)

DTT – Ditiotreitol

EDTA – ácido etilenodiaminotetracético

ELISA – Enzyme-linked immunosorbent assay

GuHCl – Hidrocloreto de guanidina

IgG – Imunoglobulina G

IgM – Imunoglobulina M

IPTSP – Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública

LAMP – Loop-mediated isothermal amplification (Amplificação isotérmica

mediada por loop)

MES – Ácido 2-(N-morpholino)etanosulfônico

iv
MgCl2 – Cloreto de magnésio

MgSO4 – Sulfato de magnésio

ORF – Open Reading frame (Região de leitura aberta)

pb – Pares de bases

PCR – Polymerase chain reaction (Reação em cadeia da polimerase)

PDMS – Poli(dimetilsiloxano)

PEG – Polietilenoglicol

PeT – Poliéster-toner

PET – Polietilenotereftalato

PMMA – Poli(metilmetacrilato)

PVP – Polivinilpirrolidona

Razão A/V – Razão área/volume

RNA – Ácido ribonucleico

RT-LAMP – Reverse transcription-loop mediated isothermal amplification

(Amplificação isotérmica mediada por loop pós transcrição reversa)

RT-PCR – Reverse transcription-polymerase chain reaction (Reação em

cadeia da polimerase pós transcrição reversa)

SPE – Solid phase extraction (Extração em fase sólida)

TE – Tris-EDTA

TEB – Tris-EDTA-Borato

Tris – Tris(hidroximetil)aminometano

UFG – Universidade Federal de Goiás

UTR – Untranslated region (Região não codificante)

UV – Ultravioleta

v
RESUMO

Os sistemas analíticos miniaturizados vêm sendo utilizados com sucesso em

muitas aplicações analíticas e bioanalíticas. No campo de diagnósticos
clínicos, dispositivos microfluídicos podem tornar as análises mais rápidas,
baratas, sensíveis, além de possibilitar a realização de exames no point-of-
care. Diagnósticos baseados em técnicas de biologia molecular podem ser
divididos em três etapas (extração, amplificação e detecção do ácido
nucleico), sendo que todas essas etapas podem ser adaptadas para
microescala. Este trabalho apresenta o desenvolvimento de métodos de
análises de RNA em microdispositivos descartáveis que podem futuramente
ser associados em microssistemas para análises totais (µTAS). As
metodologias foram desenvolvidas para detecção do vírus dengue, a fim de
possibilitar diagnósticos moleculares baseados em RNA viral em dispositivos
de baixo custo e com as vantagens associadas à microfluídica. Para a
extração do RNA utilizou-se uma metodologia de extração dinâmica em fase
sólida (dSPE), com a utilização de partículas magnéticas de sílica. O
processo de extração ocorre através da realização de três etapas: adsorção
do RNA na superfície das partículas magnéticas de sílica, lavagem das
partículas e eluição do RNA purificado. Os microchips de PeT utilizados na
extração foram fabricados por impressão, corte dos canais e laminação dos
filmes de poliéster. As dimensões dos canais foram 18 mm de comprimento
e 1,2 mm de largura, sendo que o volume dos canais foi de 6,0 µL. RNA de
alta qualidade, amplificável via reação em cadeia da polimerase pós
transcrição reversa (RT-PCR) e amplificação isotérmica mediada por loop
pós transcrição reversa (RT-LAMP), foi obtido através da dSPE. Além da
extração do RNA, a detecção de RNA via RT-LAMP em dispositivos de PeT
também foi demonstrada neste trabalho. Os produtos amplificados foram
separados em gel de agarose ou visualizados a olho nu através da adição
de intercaladores fluorescentes. O sucesso da extração de RNA e da
amplificação via RT-LAMP demonstram o potencial dos microdispositivos de
PeT na realização de diagnósticos moleculares para detecção de patógenos
cujo genoma consiste de RNA.

vi
ABSTRACT

Miniaturized analytical systems have been successfully used in many

analytical and bioanalytical applications. In the field of clinical diagnoses,
microfluidic devices can make analyses become faster, cheaper and more
sensitive, and can also enable the performance of point-of-care tests.
Diagnoses based in molecular biology techniques can be divided in three
main steps (nucleic acid extraction, amplification and detection), and all these
steps can be adapted for microscale. Here, we report the development of
RNA analytical methods in disposable microdevices that may be further used
in a micro total analysis system (µTAS). Analytical methods were developed
for dengue virus detection, to enable RNA based molecular diagnoses in low
cost devices. RNA extraction was carried out through a dynamic solid phase
extraction (dSPE) methodology, by using magnetic silica particles. Extraction
process occurs by performing three steps: RNA adsorption to the magnetic
silica particles surface, washing of the beads and elution of purified RNA.
PeT microchips used for RNA extraction were produced by printing, cutting
and lamination of polyester films. Microchannels were 18 mm length and 1.2
mm width, and the volume of channels were 6.0 µL. High quality RNA,
amplifiable by the reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR)
and reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP),
was obtained by dSPE. In addition to RNA extraction, the RNA detection by
RT-LAMP in PeT devices was also demonstrated in this work. Amplified
products were separated in agarose gel or detected by naked eye
visualization after addition of fluorescent intercalant substances. The success
of RNA extraction and amplification by RT-LAMP demonstrates the potential
of PeT microdevices in performing molecular diagnosis for detection of
pathogens whose genome is consisted by RNA.

vii
 CAPÍTULO 1

APRESENTAÇÃO DA DISSERTAÇÃO E
INTRODUÇÃO GERAL

1
1.1 INTRODUÇÃO

1.1.1 Apresentação da dissertação

No campo de diagnósticos clínicos há cada vez mais a necessidade

de métodos rápidos, portáteis, precisos e acessíveis, capazes de oferecer a
possibilidade de realização de exames no point-of-care. Diagnósticos
rápidos e precisos também podem tornar as prescrições de medicamentos
mais adequadas e os estudos epidemiológicos mais confiáveis, os quais
podem servir de base para a criação de programas de controle e erradicação
de patologias. O uso de dispositivos miniaturizados está incluso na lista de
esforços recentes para se alcançar todos esses objetivos (MAIRHOFER;
ROPPERT; ERTL, 2009).
Existem várias metodologias disponíveis para diagnósticos de
doenças. Detecção de DNA ou RNA de patógenos em amostras biológicas,
usando a reação em cadeia da polimerase (PCR – do inglês polymerase
chain reaction), a amplificação isotérmica mediada por loop (LAMP – do
inglês loop mediated isothermal amplification), a PCR pós transcrição
reversa (RT-PCR) ou a LAMP pós transcrição reversa (RT-LAMP), têm sido
extensivamente utilizadas para esse fim (PARIDA et al., 2005, CHIN;
LINDER; SIA, 2007, WAGGONER et al., 2013, CHANDRASEKAR et al.,
2015). A PCR, técnica mais utilizada para amplificação de ácidos nucleicos,
necessita de ciclos de aquecimento e resfriamento envolvendo três
temperaturas controladas com precisão, o que é feito através do uso de
termocicladores, equipamentos de custo elevado. Além disso, a PCR exige
uma etapa preliminar de preparo de amostra, que envolve a purificação do
ácido nucleico. Após a amplificação, é necessária ainda uma etapa de
separação e detecção dos fragmentos amplificados para confirmar a
presença do alvo. Além da necessidade de realização de múltiplas etapas
analíticas, todos esses passos consomem muito tempo e exigem
frequentemente a utilização de equipamentos caros e pessoal altamente
capacitado. Essa combinação de fatores representa obstáculos para que os
diagnósticos moleculares movam-se das bancadas de laboratório para

2
aplicações no point-of-care ou laboratórios com poucos recursos financeiros
(ASIELLO; BAEUMNER, 2011).
Nesse contexto, a microfluídica é uma tecnologia que tem
demonstrado muitas aplicações para diagnósticos clínicos, incluindo os
diagnósticos moleculares para identificação de patógenos. A microfluídica
pode proporcionar o desenvolvimento de dispositivos portáteis, de baixo
custo, capazes de realizar protocolos completos de biologia molecular
(MAIRHOFER; ROPPERT; ERTL, 2009).
Esta dissertação apresenta o desenvolvimento de metodologias
analíticas associadas ao RNA do vírus dengue em microdispositivos de
poliéster-toner (PeT). Dispositivos descartáveis, de fácil operação, que
proporcionem diagnósticos sensíveis e precisos para doenças com grandes
riscos epidêmicos como a dengue, podem contribuir para o tratamento e
controle dessas doenças, além de auxiliar na vigilância epidemiológica. Um
diagnóstico molecular completo envolve a realização de três etapas básicas:
extração do ácido nucleico, amplificação do ácido nucleico e detecção dos
produtos de amplificação. Neste trabalho, serão apresentados os resultados
referentes à extração do RNA do vírus da dengue (DENV) e à amplificação
pós transcrição reversa via RT-LAMP em dispositivos microfluídicos de PeT.
Nesse sentido, a dissertação está dividida em três capítulos. Este
primeiro capítulo (Capítulo 1) faz uma apresentação do tema da dissertação
e uma introdução geral a respeito do estado da arte da microfluídica e dos
microdispositivos de PeT, além de apresentar informações a respeito da
dengue. O Capítulo 2 apresenta o desenvolvimento de uma metodologia
para extração em fase sólida de RNA do DENV com a utilização de
partículas magnéticas de sílica em microchips de PeT. Finalmente, o
Capítulo 3 apresenta o uso dos microchips de PeT para a amplificação
isotérmica do ácido nucleico por RT-LAMP.

1.1.2 Sistemas analíticos miniaturizados

A microfluídica é a ciência e tecnologia da manipulação de pequenos

volumes de fluidos em canais de tamanhos micrométricos, que tem o

3
potencial para miniaturizar procedimentos complexos de laboratório em um
único microchip (CHIN; LINDER; SIA, 2012). No início da década de 1990,
Manz e colaboradores (MANZ; GRABER; WIDMER, 1990) propuseram o
conceito de microssistemas para análises totais, µTAS (do inglês micro total
analysis systems). Desde então, estes microssistemas, também chamados
lab-on-a-chip (laboratório em um chip) ou sistemas analíticos microfluídicos,
entraram em um processo de rápido desenvolvimento (DITTRICH;
TASHIKAWA; MANZ, 2006). Idealmente, um sistema desse tipo é capaz de
realizar todas as etapas de uma análise química completa (pré-tratamento
de amostra, reações químicas, separações analíticas, detecção, etc.) em um
único dispositivo de maneira integrada e automatizada (RÍOS; ZOUGAGH;
AVILA, 2012). Um dos maiores potenciais dos µTAS é a integração de
múltiplos elementos para a produção de sistemas completos do tipo sample-
in/answer-out. Embora a maioria desses dispositivos ainda não seja
completamente do tipo sample-in/answer-out, muitos µTAS já são bastante
sofisticados, com muitas etapas de manipulação e processamento de
amostra altamente integradas e automatizadas (WU et al., 2011,
CULBERTSON et al., 2013, GAN et al., 2014, SHIH et al., 2015).
As principais vantagens associadas aos sistemas analíticos
miniaturizados incluem o uso de pequenas quantidades de amostras e
reagentes, detecção de espécies químicas com alta resolução e
sensibilidade, diminuição dos custos e tempo das análises, bem como a
possibilidade do desenvolvimento de dispositivos portáteis que ocupem
pouco espaço em um laboratório e possam ser utilizados na realização de
análises químicas nos locais de origem onde se encontram as amostras
(WHITESIDES, 2006).
Os sistemas analíticos miniaturizados possuem uma ampla gama de
aplicações, mas têm encontrado um nicho principal nas áreas de análises
biológicas e biomédicas, especialmente para diagnósticos clínicos, análise
celular e de ácidos nucléicos (CULBERTSON et al., 2013). Nessas áreas, as
aplicações incluem a síntese de fármacos em microrreatores (THIELE et al.,
2011), a purificação de proteínas (MILLET et al., 2015), o cultivo de células
(LEE et al., 2011), a purificação de DNA (DUARTE et al., 2010, GAN et al.,

4
2014), a purificação de RNA (ROOT et al., 2011), a amplificação de DNA via
PCR para caracterização de amostras genéticas para análises forenses e
diagnósticos clínicos (DUARTE et al., 2011, LE ROUX et al., 2014), a RT-
LAMP para detecção de patógenos (WANG et al., 2011), entre outras.

1.1.2.1 Tecnologias de microfabricação

O desenvolvimento da microfluídica se deu inicialmente através do

uso de silício e vidro como substratos para a fabricação dos
microdispositivos, e estes materiais foram utilizados com sucesso em muitas
aplicações até o momento (EFFENHOUSER; MANZ; WIDMER, 1993,
OBEID; CHRISTOPOULOS, 2003, WU et al., 2011, SACKMAN; FULTON;
BEEBE, 2014). Tradicionalmente, esses microchips são fabricados por
fotolitografia, cujo processo compreende as seguintes etapas: (1) limpeza do
substrato e deposição de filme metálico e de fotorresiste (polímero
fotossensível) sobre o substrato; (2) posicionamento de uma máscara,
normalmente feita com filmes metálicos, e incidência de radiação Ultravioleta
(UV) ou raios-X para a criação dos padrões dos microcanais; (3) revelação
da imagem fotogravada; (4) corrosão das camadas metálicas expostas, não
protegidas pelo fotorresiste; (5) corrosão do substrato para a criação dos
microcanais e (6) remoção das camadas de metal e fotorresiste e selagem
do dispositivo (COLTRO et al., 2007).
Os processos fotolitográficos propiciam a criação de estruturas com
alta definição e resolução, mas os custos são extremamente altos, tanto dos
equipamentos quanto dos substratos, o que tornam essas técnicas
inacessíveis a muitos laboratórios (COLTRO et al., 2007). Além disso, o
tempo necessário para a fabricação de um microchip por fotolitografia
também é alto, sendo de aproximadamente 24 horas (DUARTE, 2010).
Dessa forma, a busca por materiais e métodos de fabricação mais baratos e
acessíveis tornou-se um dos principais alvos dos pesquisadores. Nos
últimos anos, materiais poliméricos ganharam atenção significativa no
desenvolvimento da microfluídica (NGE; ROGERS; WOOLLEY, 2013).
Poli(dimetilsiloxano) (PDMS) é atualmente o substrato mais utilizado para a

5
fabricação de microchips devido, principalmente, ao baixo custo e facilidade
na fabricação dos dispositivos (CULBERTSON et al., 2013).
Microchips de PDMS são tradicionalmente fabricados por processos
de litografia suave, técnica baseada na fabricação de um molde. Uma vez
que o molde é feito, o mesmo pode ser utilizado várias vezes para produzir
inúmeros dispositivos através de processos simples de estampagem. Um
aspecto negativo dessa técnica é que a produção dos moldes necessita do
uso de litografia, o que acaba aumentando os custos e limitando as
aplicações (QIN; XIA; WHITESIDES, 2010). Visando contornar este
problema, Tan e colaboradores (TAN et al., 2001) desenvolveram uma
metodologia para produzir os moldes através da deposição de toner em uma
folha de poliéster (transparência para impressão), com auxílio de uma
fotocopiadora. Esse método pode facilitar a produção de moldes, gerando
benefícios como redução do tempo e custo para produção dos mesmos.
Do Lago e colaboradores (DO LAGO et al., 2003) exploraram a ideia
de Tan et al. e fabricaram microchips de poliéster-toner (PeT) usando uma
metodologia de impressão direta. Uma camada de toner, com um layout
previamente desenhado, foi depositada em uma folha de poliéster usando
uma impressora a laser, criando canais microfluídicos nas regiões onde a
impressora não depositava a camada de toner. Uma etapa de laminação,
contra uma folha de poliéster simples ou contra uma imagem especular da
folha de poliéster com toner, promovia a selagem dos canais. Se o
dispositivo impresso é laminado contra um filme de poliéster branco (sem
toner), o microchip produzido contém uma camada de toner simples (CTS).
Se o dispositivo impresso for laminado contra sua imagem especular, o
microchip contém uma camada de toner dupla (CTD). Os canais nesses
microchips possuem 6 µm ou 12 µm de profundidade, respectivamente. A
Figura 1 apresenta as etapas de fabricação de microdispositivos de PeT
propostas por Do Lago et al.. O toner é constituído por uma mistura de um
material polimérico (majoritariamente poliestireno) e óxido de ferro, enquanto
os filmes de poliéster são constituídos principalmente por
polietilenotereftalato (PET) revestidos com sílica (DO LAGO et al., 2003).

6
Figura 1. Etapas do processo de fabricação de microdispositivos de poliéster-toner por
impressão direta com camada de toner simples. I) Folha de poliéster perfurada (topo); II)
Folha de poliéster com toner (base); III) Alinhamento e laminação da base e topo; IV)
Criação de reservatórios para amostras e reagentes. Adaptado de DO LAGO et al., 2003.

1.1.2.2 Microdispositivos de poliéster-toner (PeT)

A metodologia de impressão direta desenvolvida por Do Lago et al.

possibilitou a fabricação de microdispositivos de baixo custo em tempo
reduzido. Os equipamentos e materiais necessários para a fabricação são
acessíveis a maioria dos laboratórios, como computador, software gráfico,
impressora a laser, plastificadora de escritório, toner e filmes de poliéster. Os
autores utilizaram os microchips de PeT para separação eletroforética de
íons inorgânicos usando detecção condutométrica e também para geração
de electrospray, uma das mais importantes fontes de ionização para análises
por espectrometria de massas.
Coltro e colaboradores (COLTRO et al., 2004) utilizaram microchips
de PeT para a separação eletroforética de íons orgânicos e inorgânicos,
utilizando detecção amperométrica. GABRIEL et al. fabricaram dispositivos
eletroforéticos de PeT com toner colorido (ciano, magenta, preto e amarelo),
avaliaram as estruturas dos dispositivos e realizaram separações de íons
inorgânicos (GABRIEL et al., 2013). Os microchips de PeT foram utilizados
para a detecção da proteína C reativa, uma proteína que responde à

7
inflamações e é utilizada para diagnóstico de estado inflamatório, em
trabalhado desenvolvido por KIM et al. (2013). Duarte e colaboradores
(DUARTE et al., 2012) separaram, nos microdispositivos de PeT, fragmentos
de DNA por eletroforese em gel através da utilização de detecção por
fluorescência induzida a laser.
As aplicações dos dispositivos de PeT não estão restritas às
separações eletroforéticas. Oliveira e colaboradores (OLIVEIRA et al., 2013),
por exemplo, fabricaram microplacas com 96 poços utilizando deposição de
toner sobre folhas de poliéster. Esses dispositivos foram utilizados para
ensaios enzimáticos para detecção de anticorpos imunoglobulina G (IgG) e
imunoglobulina M (IgM) para diagnóstico da dengue pelo ensaio conhecido
como ELISA (do inglês enzyme-linked immunosorbent assay). Nesses
dispositivos, as camadas de toner depositadas funcionavam como barreiras
hidrofóbicas para o confinamento das soluções e amostras para a realização
dos ensaios.
Em 2011, Duarte e colaboradores (DUARTE et al., 2011) modificaram
o processo de fabricação proposto por Do Lago et al., de modo a produzir
dispositivos com canais mais profundos utilizando múltiplas camadas de
PeT. Nesse processo de fabricação, filmes de poliéster foram revestidos
com três camadas de toner de ambos os lados com o auxílio de uma
impressora a laser. Microcanais foram criados com a utilização de uma
cortadora a laser de dióxido de carbono, que foi programada para cortar
seletivamente pedaços do poliéster recoberto com toner. Dois filmes de PeT
com canais recortados foram alinhados com duas folhas de poliéster sem
toner, as quais serviram como base e topo do dispositivo. Furos para acesso
de reagentes foram criados na camada superior (topo) e os quatro filmes
foram laminados. Os microchips fabricados através dessa metodologia
possuíam canais com 272 µm de altura. Isso possibilitou a introdução de
partículas magnéticas de sílica nos canais para a purificação de DNA a partir
de amostras de sangue através de uma metodologia de extração dinâmica
em fase sólida (dSPE - do inglês dynamic solid phase extraction).
O uso da cortadora a laser para fabricar microchips de PeT
proporcionou a criação de estruturas mais complexas nas plataformas

8
microfluídicas de PeT. Ouyang et al. criaram válvulas hidrofóbicas em
dispositivos de PeT fabricados através do uso de uma cortadora a laser
(OUYANG et al., 2013). Em outro trabalho mais recente, Ouyang e
colaboradores (OUYANG et al., 2015) amplificaram fragmentos de DNA
humano e da bactéria azospirillum brasilense via PCR em dispositivos de
PeT, utilizando um sistema de ciclagem térmica home-made, fabricado com
lâmpada de tungstênio e um mini ventilador. Recentemente, o grupo do
professor James P. Landers, em colaboração com pesquisadores brasileiros,
descreveu um protocolo para fabricação de microchips de PeT com
estruturas complexas, envolvendo o uso de válvulas e diferentes domínios.
Neste trabalho, demonstraram diversas aplicações para os dispositivos,
como amplificação de DNA, detecção de pequenas moléculas, quantificação
de proteínas e quantificação de células brancas em sangue (THOMPSON et
al., 2015).
Neste contexto, a simplicidade de produção dos dispositivos, o baixo
custo dos materiais e equipamentos necessários para fabricação e a
possibilidade de integrar diferentes domínios nos dispositivos, com a criação
de válvulas e outros elementos, fazem com que os microchips de PeT
apresentem grande potencial para o desenvolvimento de dispositivos
microfluídicos integrados para análises químicas e biológicas.
Os microchips de PeT já demonstraram ser biocompatíveis e capazes
de realizar etapas de análises genéticas envolvendo DNA (DUARTE et al.,
2011, DUARTE et al., 2012, OUYANG et al., 2015). O desafio agora é utilizá-
los para análises envolvendo RNA, uma vez que diversas doenças são
causadas por organismos que têm RNA como material genético. A
necessidade de diagnósticos para RNA no point-of-care tem se intensificado
nos últimos anos após a pandemia de Influenza em 2009, o recente avanço
no número de casos de zika, e os graves casos de dengue recorrentes no
Brasil (IOOS et al., 2014, SCHULER-FACCINI et al., 2016).

9
1.1.3 Dengue

A dengue é uma doença viral transmitida aos humanos através de

picadas de fêmeas de mosquitos da espécie Aedes aegypti infectados pelo
vírus dengue (DENV), que é classificado em quatro sorotipos
imunologicamente distintos, denominados DENV-1, DENV-2, DENV-3 e
DENV-4 (ICTV, 2015). A doença é disseminada ao longo dos trópicos, com
variações de risco influenciadas por índices de precipitação pluviométrica,
temperatura e urbanização rápida não planejada (WHO, 2016). Esses
mosquitos vivem em áreas de clima tropical e subtropical, não sendo
capazes de sobreviver em baixas temperaturas, e por isso são incomuns em
regiões mais frias (WHO, 2009). As regiões do planeta em que há maior
risco de transmissão do vírus dengue estão indicadas na Figura 2.

Figura 2. Distribuição global do risco de infecção pelo vírus dengue. Adaptado de WHO,
2012.

A incidência de dengue cresceu de forma muito acentuada nas

últimas décadas em todo o mundo, e os números reais de casos são
subnotificados e muitos são ainda classificados erroneamente. Um estudo
recente (BHATT et al., 2013) estimou que cerca de trezentos e noventa (390
± 122) milhões de casos de dengue ocorrem anualmente, sendo que
noventa e seis milhões (96 ± 34) apresentam manifestações clínicas com

10
sintomas aparentes, enquanto duzentos e noventa e quatro milhões (294 ±
87) são assintomáticos. Esses valores são mais de três vezes superiores
aos anteriormente estipulados pela Organização Mundial da Saúde (WHO,
2009).
No Brasil, a dengue se tornou motivo de preocupação a partir de
1986, após epidemia provocada pela introdução do sorotipo 1 (DENV-1) no
estado do Rio de Janeiro (SCHATZMAYR; NOGUEIRA; DA ROSA, 1986). O
vírus se espalhou rapidamente para áreas próximas e, na sequência, por
todo o país. Os sorotipos 2 (DENV-2) e 3 (DENV-3) também foram
introduzidos no Brasil no estado do Rio de Janeiro, em 1990 e 2000,
respectivamente (NOGUEIRA et al., 1990, NOGUEIRA et al., 2001).
Finalmente, o sorotipo 4 apareceu no ano de 2008, na região de Manaus, no
estado do Amazonas (FIGUEIREDO et al., 2008).
Segundo levantamento feito pelo Ministério da Saúde, os quatro
sorotipos circulam pelo país e, em 2015, provocaram a ocorrência de
1.280.445 casos de dengue, sendo que 710 pessoas vieram a óbito
(BRASIL, 2016). O estado com maior número de casos foi São Paulo,
seguido por Minas Gerais e Goiás. Comparando o número total de casos
com o tamanho da população de cada estado, Goiás foi o estado que
apresentou maior incidência de dengue (1.879,5 casos por 100.000
habitantes).
Muitas infecções pelo DENV são assintomáticas, enquanto algumas
apresentam um amplo espectro de manifestações clínicas, como náuseas,
vômitos, erupções cutâneas, dores abdominais, sangramento da mucosa,
letargia, entre outros sintomas. Os sintomas normalmente duram de dois a
sete dias e têm início após um período de incubação que dura de quatro a
dez dias após a picada do mosquito infectado. Uma pequena fração dos
pacientes infectados evolui para um quadro severo da doença, caracterizado
por sintomas mais graves, como extravasamento plasmático, hemorragias,
comprometimento de órgãos e angústia respiratória (WHO, 2009). Estima-se
que cerca de quinhentas mil pessoas são hospitalizadas com dengue severa
anualmente, e aproximadamente 2,5% dessas pessoas vêm a óbito (WHO,
2016).

11
 A prevenção ou redução da transmissão do vírus dengue tem como
base principal o combate ao vetor ou a interrupção do contato entre os
mosquitos e seres humanos (GUZMAN et al., 2010). Assim, a principal
estratégia para controle da doença consiste na eliminação do Aedes aegypti
através do uso de substâncias químicas e na eliminação de locais possíveis
de serem utilizados como habitat pelos mosquitos. Todavia, o
desenvolvimento de vacinas eficazes contra os quatro sorotipos do vírus
dengue é uma prioridade a nível mundial, devido à importância global da
doença (HOMBACH, 2007).
O desenvolvimento de vacinas vem sendo um desafio há mais de
trinta anos e, recentemente, alguns estudos em estágios avançados têm
demonstrado resultados promissores (SABCHAREON et al., 2012, DAYAN
et al., 2013, HUANG et al., 2013, VILLAR et al., 2015). A vacina em estágio
mais avançado é a vacina tetravalente (CYD-TDV), que tem tido sucesso em
estudos realizados na ásia e na américa latina (SABCHAREON et al., 2012,
DAYAN et al., 2013, VILLAR et al., 2015). A vacina, que já está na fase 3 de
desenvolvimento, demonstrou ser segura e eficaz na proteção contra os
quatro sorotipos, diminuído as taxas de hospitalização e ocorrência de casos
de dengue severa (VILLAR et al., 2015).

1.1.3.1 Estrutura do DENV

O DENV apresenta-se classificado em quatro sorotipos

imunologicamente distintos, denominados DENV-1, DENV-2, DENV-3 e
DENV-4, os quais pertencem ao gênero Flavivirus e família Flaviridae (ICTV,
2015). Esses sorotipos apresentam-se geneticamente relacionados com
similaridade de aproximadamente 65 % (GUZMAN et al., 2010).
A partícula viral madura do DENV apresenta formato esférico com
diâmetro em torno de 50 nm, envolta por um envelope viral constituído por
uma bicamada lipídica, onde encontram-se ancoradas a proteína do
envelope (E) e a proteína de membrana (M) (LINDENBACH; RICE, 2003,
ZHANG et al., 2003). Na parte interna encontra-se um nucleocapsídeo,
formado pela proteína do capsídeo (C) e pelo RNA genômico de fita simples

12
e polaridade positiva (+ssRNA), de aproximadamente 11 quilobases (kb)
(HENCHAL; PUTNAK, 1990).
O genoma viral apresenta uma região de leitura aberta (ORF – Open
Reading frame), codificante, que está localizada entre as regiões não
codificantes (UTR – Untranslated region) 5’UTR e 3’UTR (Figura 3). A ORF
codifica uma poliproteína de aproximadamente 3400 aminoácidos, a qual
sofre clivagens sucessivas e dá origem a três proteínas estruturais (C, E e
prM – precursora da proteína M) e sete proteínas não estruturais (NS – non
structural – NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B e NS5) (CHAMBERS et
al., 1990, HENCHAL; PUTNAK, 1990). As proteínas não estruturais atuam
em diversas etapas da replicação viral (LINDENBACH; RICE, 2003).

Figura 3. Estrutura genômica do vírus dengue. Fonte: Guzman et al. (2010).

1.1.3.2 Diagnóstico laboratorial da infecção pelo DENV

Como a dengue pode ser clinicamente confundida com outras

doenças virais, como chikungunya e zika, por exemplo, doenças também
transmitidas pelo mosquito Aedes aegypti, faz-se necessária a utilização de
metodologias específicas para diagnóstico preciso da dengue (WHO, 2012).
Os métodos de diagnósticos laboratoriais para a confirmação de infecção
pelo DENV podem envolver o isolamento do vírus, a detecção do RNA viral,
a detecção de antígenos virais ou anticorpos específicos, ou uma
combinação dessas técnicas. A escolha da técnica a ser utilizada depende
do propósito a que a análise se destina (diagnóstico clínico, levantamento
epidemiológico, etc.), das condições laboratoriais, do conhecimento técnico
pessoal e do período da infecção. Na fase aguda da doença, compreendida
pelos cinco primeiros dias após o início dos sintomas, podem ser utilizadas
técnicas que permitem identificar o vírus, o genoma viral ou antígenos virais.

13
Após esse período os métodos sorológicos, capazes de identificar os
anticorpos específicos, são os mais indicados (WHO, 2009).
O isolamento do vírus pode ser realizado a partir da inoculação das
amostras para diagnóstico (soro, sangue ou plasma) em mosquitos, em
culturas de células, ou em camundongos. Para a identificação do sorotipo
são realizados ensaios de imunofluorescência usando anticorpos específicos
(HENCHAL; PUTNAK, 1990). Apesar de propiciarem a diferenciação dos
sorotipos e serem sensíveis e específicos, esses métodos consomem muito
tempo.
A detecção de antígenos, através de ensaios imunoenzimáticos
(ELISA) ou por imunocromatografia, pode ser utilizada para quantificar a
proteína NS1, uma proteína não estrutural altamente conservada (ALCON et
al., 2002). Esses métodos são simples, baratos, já são comercializados na
forma de kits, apresentam bons resultados, mas não diferenciam os
sorotipos (PEELING et al., 2010).
Os métodos sorológicos, por sua vez, baseiam-se no fato de que a
resposta imune adquirida à infecção pelo DENV consiste na produção de
imunoglobulinas (IgM e IgG) que são específicas para a proteína E do vírus.
A resposta da IgM é geralmente maior quando a infecção é primária,
enquanto a resposta da IgG é maior quando a infecção é secundária (WHO,
2009, PEELING et al., 2010). A detecção das imunoglobulinas é realizada
através de ensaios ELISA e por testes rápidos de imunocromatografia por
captura de anticorpos (VAUGHN et al., 1998). Essas técnicas são simples e
baratas, porém não permitem identificação do sorotipo.
Os métodos moleculares permitem a detecção do genoma viral e
baseiam-se na realização de três etapas: extração do ácido nucléico (RNA),
amplificação pós transcrição reversa, e detecção e caracterização do
produto de amplificação. O método mais comum para amplificação do RNA é
a RT-PCR, mas outros métodos, como RT-LAMP, também estão
disponíveis. Várias padronizações de RT-PCR e algumas de RT-LAMP para
amplificação do DENV podem ser encontradas na literatura (MORITA;
TANAKA; IGARASHI, 1991, LANCIOTTI et al., 1992, PARIDA et al., 2005,
BHATNAGAR et al., 2012, WAGGONER et al., 2013), havendo variações

14
com relação aos reagentes utilizados, concentrações dos reagentes,
métodos de detecção e região do genoma a ser amplificado. A metodologia
proposta por Lanciotti et al. (1992), por exemplo, permite a identificação do
sorotipo viral através de reações de amplificação de fragmentos a partir da
região de junção C/prM, ao passo que a metodologia proposta por Parida et
al. (2005) também permite a identificação do sorotipo, mas a amplificação
dos fragmentos acontece na região 3’UTR.

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22
 CAPÍTULO 2

EXTRAÇÃO DE RNA EM MICROCHIPS

DE POLIÉSTER-TONER

23
2.1 INTRODUÇÃO

Uma etapa comum em todas as técnicas de diagnóstico baseadas na

detecção do genoma do vírus dengue é a extração do RNA viral. Devido ao
fato do RNA estar presente em pequenas quantidades no plasma de
pacientes infectados, a qualidade e estabilidade do RNA extraído é crucial
para as reações subsequentes, como RT-PCR e RT-LAMP (DETTOGNI;
LOURO, 2011).
Um dos principais desafios encontrados nos processos de extração
de RNA a partir de uma amostra complexa é o fato do RNA ser uma
molécula instável e ter um tempo de vida muito curto depois de extraído de
células ou tecidos. A instabilidade é devida, principalmente, à existência das
onipresentes enzimas ribonucleases (RNases), presentes no sangue, em
tecidos, bactérias, na pele humana e em partículas de poeira (HAGAN et al.,
2008, TAN; YIAP, 2009). As RNases são enzimas muito ativas, resistentes
ao calor e de difícil inativação porque não precisam de cofatores para o
desempenho de suas atividades (TAN; YIAP, 2009).
Existem dois métodos principais para extração de RNA: extração em
fase líquida e extração em fase sólida. O primeiro método envolve a
utilização de solventes orgânicos, tais como fenol e clorofórmio, e um sal de
guanidina, normalmente tiocianato ou isotiocianato de guanidina. Após a
realização de uma etapa de lise celular (rompimento da membrana celular)
com fenol e sal de guanidina, e posterior adição de clorofórmio, ocorre
separação de fases. O RNA fica dissolvido na fase aquosa (superior) e os
demais componentes, incluído proteínas, DNA e resíduos celulares, ficam
dissolvidos na fase orgânica (inferior) ou na interface entre as duas fases
(TAN; YIAP, 2009). A fase aquosa é separada, o RNA é precipitado através
da adição de isopropanol, lavado com etanol 75% e ressuspendido em água
livre de RNases. O procedimento de extração em fase líquida consome
muito tempo, requer grandes quantidades de amostra e reagentes, utiliza
reagentes tóxicos como clorofórmio e fenol, além de necessitar de múltiplas
etapas de centrifugação, algo muito difícil de ser adaptado para microescala
(KIM et al., 2009).

24
 O segundo método envolve a utilização de uma fase sólida, como
sílica, partículas de vidro, matriz trocadora de íons, entre outras. Sob
condições específicas de pH e concentrações apropriadas de sais, ocorre
interação entre as moléculas de RNA e a matriz sólida (TAN; YIAP, 2009).
Na sequência, a fase sólida é lavada com um solvente (ou mistura de
solventes), normalmente um álcool, e o RNA puro é dessorvido e eluído com
água ou tampão de baixa força iônica. A extração em fase sólida (SPE – do
inglês solid phase extraction) é muito utilizada na confecção de kits
comerciais para a purificação de ácidos nucléicos (QIAGEN, 2015 a,
QIAGEN, 2015 b, LGC BIOTECNOLOGIA, 2016) e permite uma purificação
mais rápida e eficiente que a extração em fase líquida, além de geralmente
necessitar de quantidades menores de amostras e reagentes (TAN; YIAP,
2009).

2.1.1 Extração de RNA em microdispositivos

Algumas metodologias de extração de RNA em fases sólidas têm sido

adaptadas para utilização em dispositivos microfluídicos (HAGAN et al.,
2008, HAGAN et al., 2009, REINHOLT et al., 2013, SHAW et al., 2013,
VAGHI et al., 2016). A SPE realizada em microchips permite uma purificação
de ácidos nucleicos em menor tempo que as extrações em fase líquida e em
tempo comparável às extrações com a utilização de kits comerciais. Além
disso, os métodos de purificação em microdispositivos apresentam como
importante vantagem em relação aos kits o fato do processo ser realizado
em ambiente completamente fechado, o qual oferece menores
possibilidades de perda e contaminação das amostras. Outra vantagem da
extração do ácido nucleico realizada em microchips é a possibilidade de
integração com etapas analíticas subsequentes, como RT-PCR, RT-LAMP e
separação eletroforética, a fim de se obter análises genéticas integradas e
automatizadas, com o desenvolvimento de um verdadeiro lab-on-a-chip
(HAGAN et al., 2008). Outras vantagens, inerentes ao processo de
miniaturização, como utilização de menor volume de amostras e reagentes e

25
diminuição dos custos, também são obtidas através da extração de RNA em
microdispositivos.
Diversos trabalhos podem ser encontrados na literatura em que os
autores propuseram metodologias de extração de RNA de variados tipos de
amostras biológicas, utilizando-se diferentes matrizes como fase sólida e
microchips fabricados com diferentes materiais. Reinholt e colaboradores
(REINHOLT et al., 2013) fabricaram um microdispositivo com o polímero
poli(metilmetacrilato), PMMA, e modificaram a superfície do polímero dentro
dos microcanais para a purificação de RNA do protozoário Cryptosporidium
parvum. O microchip foi fabricado a partir de um processo de estampagem a
quente e a superfície interna dos canais foi modificada com a ação de
radiação ultravioleta, seguida da imobilização de poliamidoamina e
oligonucleotídeo timidino, oligo(dT)25. Shaw et al. fabricaram um microchip
de vidro através de processos fotolitográficos e revestiram a superfície do
canal com sílica ativada termicamente para a extração de RNA de tecidos de
fígado e hepatócitos de ratos (SHAW et al., 2013). Vaghi e colaboradores
(VAGHI et al., 2016) purificaram RNA do vírus da hepatite C a partir de
amostras de plasma de pacientes infectados utilizando dispositivos de
PDMS, cujos canais tiveram a superfície modificada a partir da incorporação
de moléculas funcionais contendo grupos silanóis. Park e colaboradores
(PARK et al., 2012), por sua vez, utilizaram microchips de PDMS para
purificar RNA do vírus influenza H1N1 utilizando como fase sólida uma
matriz de sílica sol-gel.

2.1.2 Purificação de ácidos nucleicos utilizando sílica como

fase sólida

Sílica é a matriz mais comum utilizada para SPE de ácidos nucléicos,

tanto no formato convencional como no formato miniaturizado. Vogelstein e
Gillespie (1979) foram os pioneiros na observação de que ácidos nucléicos
têm afinidade por sílica em um meio contendo sais caotrópicos, como iodeto
de sódio. Entretanto, neste trabalho não foi demonstrada aplicações para

26
purificação de ácidos nucleicos a partir de amostras clínicas. Sais
caotrópicos são sais capazes de modificar as estruturas secundária, terciária
e/ou quaternária de proteínas e ácidos nucleicos, sem alterar a estrutura
primária (BOOM et al., 1993, KUROITA et al., 1999). Sais caotrópicos
desidratam a superfície da sílica e o ácido nucleico, o que promove a
interação entre as moléculas de ácido nucleico e os grupos silanóis
protonados através de ligação de hidrogênio (BREADMORE et al., 2003).
Boom e colaboradores (BOOM et al., 1990) avaliaram a utilização de outros
sais caotrópicos, como tiocianato e hidrocloreto de guanidina, e purificaram
ácidos nucleicos através de SPE usando sílica como fase sólida a partir de
amostras clínicas como urina e soro. Estes sais podem ser utilizados tanto
para purificação de DNA quanto de RNA, uma vez que apresentam potencial
para a realização de lise celular e inativação de enzimas ribonucleases e
desoxirribonucleases. Os métodos de extração envolvem a realização de
três etapas: (1) lise célular (e/ou rompimento de envelope e capsídeo, no
caso de vírus) e adsorção do ácido nucléico na superfície das partículas de
sílica em um meio contendo um sal caotrópico com alta força iônica; (2)
lavagem das partículas para remoção de contaminantes, como proteínas e
resíduos celulares e; (3) dessorção e eluição do ácido nucléico em uma
solução salina de baixa força iônica ou em água (PRICE; LESLIE;
LANDERS, 2009).
Nas extrações realizadas em microdispositivos, as partículas de sílica
são convencionalmente empacotadas dentro dos microcanais. As amostras
e reagentes são levados aos canais através de bombas operando a uma
determinada velocidade, e fluem pelos canais para entrar em contato com a
matriz sólida (REINHOLT; BAEUMNER, 2014). Breadmore e colaboradores
(BREADMORE et al., 2003), por exemplo, extraíram DNA genômico de
sangue humano e de culturas de células da bactéria Salmonella typhimurium
usando microchips de vidro e partículas de sílica empacotadas nos
microcanais como fase sólida. Seguindo a mesma ideia, HAGAN et al.
fabricaram microchips de vidro e utilizaram partículas de sílica e partículas
de sílica revestidas com quitosana, empacotadas nos canais microfluídicos,

27
para purificar RNA a partir de sêmen e células bucais (HAGAN et al., 2008,
HAGAN et al., 2009).
Recentemente, partículas magnéticas de sílica começaram a ser
utilizadas para purificação de ácidos nucléicos em microdispositivos
(DUARTE et al., 2010, DUARTE et al., 2011). O uso de partículas
magnéticas, no lugar de partículas empacotadas nos canais, oferece
algumas vantagens nos processos de extração. Essas vantagens estão
relacionadas ao fato de as partículas magnéticas ficarem livres dentro dos
canais microfluídicos e serem manipuladas através da aplicação de campos
magnéticos externos. O fato delas se movimentarem durante o processo de
extração proporciona maior interação entre a fase sólida e as amostras e,
por não haver necessidade de empacotamento no canal microfluídico,
dispensa o uso de bombas (REINHOLT; BAEUMNER, 2014).
Nesse contexto, Duarte e colaboradores (DUARTE et al., 2011)
demonstraram que microchips de PeT podem ser utilizados para purificação
de DNA genômico a partir de amostras de sangue humano, utilizando
partículas magnéticas de sílica como fase sólida. Nesse método de extração,
um campo magnético proveniente de um agitador magnético promove a
movimentação das partículas magnéticas por todo o microcanal,
aumentando a capacidade de interação entre a fase sólida e a amostra.
Após a adsorção do DNA na superfície das partículas e lavagem para
remoção de impurezas, as partículas são novamente movimentadas para
promover a dessorção e eluição do DNA em tampão tris-EDTA (TE). A esse
processo de purificação de espécies químicas utilizando fase sólida em
constante movimento é dado o nome de extração dinâmica em fase sólida
(dSPE).
Neste trabalho, partículas magnéticas de sílica foram utilizadas, pela
primeira vez, para extrair RNA em dispositivos microfluídicos de PeT.

28
2.2 OBJETIVOS

2.2.1 Objetivo geral

Desenvolver uma metodologia para extração dinâmica de RNA em

fase sólida em microdispositivos descartáveis de PeT, que seja compatível
com etapas analíticas subsequentes de detecção de RNA, como RT-PCR e
RT-LAMP, para possibilitar o seu uso em dispositivos integrados para
diagnósticos moleculares envolvendo RNA.

2.2.2 Objetivos específicos

i. Extrair RNA do vírus da dengue a partir de amostras de soro de

pacientes infectados pelo vírus.
ii. Otimizar os parâmetros operacionais da extração para maximizar a
quantidade de RNA purificado em um menor tempo analítico.
iii. Avaliar a pureza e a qualidade do RNA extraído.
iv. Avaliar o perfil de eluição do RNA no processo de extração.

2.3 MATERIAIS E MÉTODOS

2.3.1 Material de estudo, reagentes e soluções

O material de estudo foi constituído por amostras de soro

provenientes de indivíduos com suspeita de infecção pelo DENV, em
investigação epidemiológica realizada pelo laboratório de Virologia do
Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública (IPTSP) da Universidade
Federal de Goiás (UFG). As amostras foram previamente triadas seguindo
protocolo descrito por Lanciotti et al. (1992), estabelecido para a detecção e
sorotipagem molecular do DENV. Foram selecionadas amostras
identificadas como positivas para o sorotipo 1 (DENV-1) em estudo
desenvolvido por Guimarães (2014).

29
 As partículas magnéticas de sílica (Magnesil®) foram obtidas junto à
Promega (Madison, WI), assim como a GoTaq® Green Master Mix, contendo
a enzima Taq DNA polimerase, cloreto de magnésio (MgCl2),
desoxirribonucleotídeos fosfatados (dNTP’s) e tampão para PCR. O
reagente ditiotreitol (DTT), as enzimas SuperScriptTM III Reverse
Transcriptase e RNase Out, e o padrão de tamanhos de DNA 100 bp DNA
ladder foram obtidos junto à Invitrogen/Life Technologies (Foster City, CA).
Proteinase K (20 mg mL-1) foi adquirida junto à Qiagen (Valência, CA).
Hidrocloreto de Guanidina (GuHCl), ácido 2-(N-morpholino) etanosulfônico
(MES), etanol, betaína e água grau biologia molecular foram obtidos junto à
Sigma-Aldrich (St Louis, MO). RNAse Zap foi adquirido junto à Ambion/Life
Technologies (Foster City, CA). Os reagentes Tris(hidroximetil)aminometano
(Tris) e etilenodiaminotetracético (EDTA) foram obtidos junto à Vetec/Sigma-
Aldrich (St Louis, MO). Triton X-100 foi adquirido junto à Usb Corporation
(Cleveland, OH). Albumina de soro bovina (BSA) foi obtida junto à
Amersham/GE Healthcare e dNTP’s foram adquiridos junto à Ludwig Biotech
(Alvorada, RS). A enzima Bst DNA polimerase e sulfato de magnésio
(MgSO4) foram adquiridos junto à New Engalnd Biolabs (Ipswich, MA). As
soluções de MES 100 mM, etanol 75 % e Tris-EDTA (TE) 0,1X foram
preparadas em água ultrapura. GuHCl 6 mol L-1 pH 6 foi preparado em
tampão TE e o pH foi ajustado através da adição de MES 100 mM. A água
utilizada no preparo das soluções foi água ultrapura de condutividade 0,055
µS cm-1 (Progard®2 Millipore).

2.3.2 Preparo das partículas magnéticas

30 µL da suspensão de partículas de Magnesil ® foram transferidas

para um microtubo e o líquido foi removido com auxílio de uma micropipeta,
mantendo-se as partículas presas no tubo com a utilização de um ímã. 70 µL
de hidrocloreto de guanidina (GuHCl) 6 mol L-1 pH 6,0 foram adicionados ao
microtubo. Com esse procedimento, têm-se as partículas magnéticas de
sílica em um meio caotrópico, prontas para a utilização nos experimentos de
extração de RNA.

30
2.3.3 Lise e rompimento de envelope e capsídeo

A primeira etapa nos experimentos de extração de RNA viral a partir

de amostras complexas é a lise (para liberar o RNA viral presente em
células) e o rompimento do envelope viral e capsídeo para liberar o RNA
presente nas partículas virais. Esses processos fazem com que o RNA fique
disponível em solução para os procedimentos analíticos subsequentes. A
lise (e o rompimento de envelope e capsídeo) foi realizada em microtubos
através da agitação em vórtex e incubação a 56 ºC por 10 minutos de uma
mistura de 3 µL de soro, 2,5 µL de proteinase K (20 mg mL -1) e 8 µL de
GuHCl 6 mol L-1 pH 6,0 com 1 % de triton X-100.

2.3.4 Extração dinâmica em fase sólida de RNA em

microtubo

Experimentos iniciais de dSPE foram realizados em microtubos de

polipropileno a fim de verificar a compatibilidade de todos os reagentes
utilizados na purificação de RNA e a ocorrência da interação entre as
moléculas de RNA e as partículas magnéticas. Nesses experimentos, 10 µL
de partículas magnéticas em GuHCl foram transferidos para um microtubo,
no qual foram adicionados 12 µL de solução de lise (preparada conforme
item anterior), preparada de acordo com o item anterior. O microtubo foi
colocado em um vórtex e as partículas foram agitadas por 5 minutos. Em
seguida, com um ímã prendendo as partículas, o sobrenadante foi removido
com auxílio de uma micropipeta e descartado. As partículas foram lavadas
duas vezes com 30 µL de etanol 75% e o solvente foi removido com uma
micropipeta. O microtubo aberto foi aquecido a 56 ºC por 10 minutos para a
completa eliminação dos resíduos de etanol. Com um ímã segurando as
partículas no tubo, foi feita uma lavagem com 50 µL de água ultrapura. A
água de lavagem foi removida com uma micropipeta e, na sequência, foram
adicionados 12 µL de água ultrapura e as partículas foram agitadas por 5
minutos com auxílio de um vórtex. Com um ímã prendendo as partículas, a
solução contendo RNA purificado foi coletada com uma micropipeta,

31
transferida para outro microtubo e avaliada quanto à pureza e qualidade do
RNA extraído.

2.3.5 Avaliação da pureza e qualidade do RNA extraído

O RNA purificado teve seu grau de pureza avaliado com a utilização

do espectrofotômetro NanoDrop 2000 (Thermo Scientific). O NanoDrop faz
uma varredura de absorbâncias na região do espectro eletromagnético
compreendida entre 200 e 350 nm, mede as absorbâncias de espécies
químicas nos comprimentos de onda específicos de 260 e 280 nm, e calcula
as razões entre as absorbâncias medidas em 260 e 280 nm (A260/280).
Ácidos nucleicos têm absorção máxima de radiação no comprimento de
onda de 260 nm, e a razão A260/280 indica a pureza do ácido nucleico
(GENOME CENTER MASSTRICH).
A qualidade do RNA extraído foi avaliada através de duas
metodologias, a RT-PCR e a RT-LAMP. Nessas reações é feita a síntese de
DNA complementar (cDNA) e amplificação de um fragmento do cDNA
sintetizado via PCR ou LAMP. Nos experimentos de RT-PCR, foi feita uma
semi-nested PCR para identificar o sorotipo 1 do vírus DENV.
Para a RT-PCR utilizou-se um protocolo proposto por Guimarães
(2014), que consiste de uma adaptação do protocolo descrito por Lanciotti et
al. (1992). Os iniciadores (Tabela 1) foram selecionados para amplificar um
fragmento da região de junção C/prM do genoma viral. Para as reações
foram preparadas misturas reacionais de 25 µL com a seguinte composição
de reagentes: 0,16 µM dos iniciadores D1 e D2; 2 mM de ditiotreitol (DTT);
1,6 unidades/µL da enzima SuperScriptTM III Reverse Transcriptase; 0,32
unidades/µL da enzima RNase Out; 2,5 unidades/µL da enzima Taq DNA
polimerase; 1,5 mM de cloreto de magnésio (MgCl2); 200 µM de cada um
dos quatro desoxirribonucleotídeos fosfatados (dNTP’s), e 2 ng µL-1 de RNA
purificado por dSPE. Foram feitos controles negativos, em que RNA foi
substituído por água ultrapura. O protocolo de aquecimento utilizado foi: 55
ºC por 40 minutos (transcrição reversa); 95 ºC por 5 minutos (desnaturação
da enzima transcriptase); 35 ciclos de 94 ºC por 35 segundos

32
(desnaturação), 57 ºC por 45 segundos (anelamento) e 72 ºC por 2 minutos
(extensão); e extensão final de 7 minutos a 72 ºC. As reações foram
realizadas em termociclador Mastercycler Nexus (EppendorfAG, Hamburgo).

Tabela 1. Sequências dos iniciadores utilizados nos experimentos de amplificação pós

transcrição reversa para a avaliação da qualidade do RNA.

Iniciador Sequência (5’ – 3’)

D1 TCAATATGCTGAAACGCGCGAGAAACCG
RT-PCR e
semi-nested D2 TTGCACCAACAGTCAATGTCTTCAGGTTC
PCR
TS1 CGTCTCAGTGATCCGGGGG

F3 GAGGCTGCAAACCATGGAA

B3 CAGCAGGATCTCTGGTCTCT

FIP GCTGCGTTGTGTCTTGGGAGGTTTTCTGTACGCATGGGGTAGC
RT-LAMP
BIP CCCAACACCAGGGGAAGCTGTTTTTTTGTTGTTGTGCGGGGG

FLP CTCCTCTAACCACTAGTC

BLP GGTGGTAAGGACTAGAGG

Para a semi-nested-PCR foram preparadas misturas reacionais de 25

µL contendo 2,5 µL de produto da RT-PCR diluído dez vezes e a seguinte
composição de reagentes: 0,16 µM dos iniciadores D1 e TS1; 2,5
Unidades/µL da enzima Taq DNA polimerase; 1,5 mM de cloreto de
magnésio (MgCl2); e 200 µM dos dNTP’s. O protocolo de aquecimento
utilizado foi: 94 ºC por 1 minuto (desnaturação incial); 30 ciclos de 94 ºC por
35 segundos (desnaturação), 56 ºC por 45 segundos (anelamento) e 72 ºC
por 2 minutos (extensão); e extensão final de 7 minutos a 72 ºC. Os produtos
da semi-nested-PCR foram analisados em gel de agarose a 1,5 % em
tampão Tris-EDTA-Borato (TEB). Para a correta identificação dos
fragmentos amplificados, foi utilizado um padrão de tamanhos de DNA 100
bp DNA ladder.
Para a RT-LAMP utilizou-se uma adaptação do protocolo descrito por
Parida et al. (2005). Os iniciadores (Tabela 1) foram selecionados para
amplificar fragmentos da região 3’UTR do genoma viral. Foram preparadas

33
misturas reacionais de 5 µL com a seguinte composição de reagentes: 0,2
µM dos iniciadores F3 e B3; 1,6 µM dos iniciadores FIP e BIP; 0,8 µM dos
iniciadores FLP e BLP; 2 mM de DTT; 1,6 unidades/µL da enzima
SuperScriptTM III Reverse Transcriptase; 0,32 unidades/µL da enzima RNase
Out; 0,96 unidades/µL da enzima Bst DNA polimerase; 0,24 mg mL-1 de
BSA; 8 mM de sulfato de magnésio (MgSO4); 0,9 µM de betaína; 1,4 mM de
cada um dos quatro dNTP’s, e 1 ng µL-1 de RNA. Foram feitos controles
negativos, em que RNA foi substituído por água ultrapura. Os microtubos
foram então colocados em um termobloco (Major Science, Saratoga, CA) na
temperatura de 65 ºC. O tempo de reação foi de 60 minutos. Após a reação,
a temperatura foi aumentada para 80 ºC e mantida por dois minutos, para a
inativação da enzima Bst polimerase. Os produtos da RT-LAMP foram
analisados em gel de agarose a 2 % em tampão TEB. Para a correta
identificação dos fragmentos amplificados, foi utilizado um padrão de
tamanhos de DNA 100 bp DNA ladder.

2.3.6 Fabricação dos microchips de poliéster-toner

Os dispositivos microfluídicos de PeT utilizados na extração do RNA

viral foram fabricados segundo o processo proposto por Duarte et al. (2011)
(Figura 4). Filmes de poliéster foram revestidos com três camadas de toner
de ambos os lados, com o auxílio de uma impressora a laser. Microcanais
para a extração de RNA foram criados com a utilização de uma cortadora a
laser de CO2, sendo que a geometria dos canais foi desenhada com o
auxílio do software CorelDRAW 11. Dois filmes de poliéster cobertos com
toner e canais recortados foram utilizados como partes intermediárias dos
microchips. Para a base e topo foram utilizadas folhas de poliéster sem
toner, sendo que no topo foram feitos furos para criar os reservatórios de
entrada e saída de reagentes. Os quatro filmes (topo, base e dois
intermediários) foram alinhados e laminados em uma plastificadora operando
a uma temperatura de 160 ºC.

34
Figura 4. Representação das etapas de fabricação dos microchips de poliéster-toner para
extração de RNA. (I) filme de poliéster; (II) filme de poliéster revestido com camadas de
toner em ambos os lados; (III) layout do canal recortado em uma cortadora a laser; (IV)
alinhamento das quatro folhas de poliéster. Adaptado de Duarte et al., 2011.

Cada filme de poliéster tem em média uma espessura de 100 µm e

cada camada de toner 6 µm (DO LAGO et al., 2003). Assim, uma folha de
poliéster com três camadas de toner de ambos os lados apresenta uma
espessura média de 136 µm. Logo, os dispositivos fabricados com duas
folhas intermediárias de poliéster revestidas com toner possuem canais com
272 µm de altura. A geometria dos canais foi desenhada no software
CorelDRAW 11 como sendo um retângulo com largura de 1,2 mm e
comprimento de 18 mm. O volume dos canais foi de 6 µL.

2.3.7 Extração dinâmica em fase sólida de RNA em

microchips de poliéster-toner

Primeiramente, o canal microfluídico foi tratado com RNAse Zap, um

reagente capaz de desnaturar as enzimas RNases. Para isso, o canal e os
reservatórios foram preenchidos com RNAse Zap, e o reagente foi mantido
por um minuto, sendo na sequência removido com auxílio de uma
micropipeta. O microchip foi aquecido a 60 ºC e mantido em aquecimento
até secagem completa. Para a purificação do RNA, 2 µL de partículas
magnéticas em GuHCl 6 mol L-1 pH 6,0 foram colocados no canal

35
microfluídico, o qual foi completado com solução de lise ou amostra de RNA
pré-purificado de concentração igual a 1,6 ng µL -1. O microchip foi colocado
em um agitador magnético operando em velocidade máxima e as partículas
foram colocadas em movimento a partir da ação do campo magnético
proveniente do agitador magnético e do campo proveniente de um ímã
posicionado no topo do microchip. A agitação foi mantida por cinco minutos.
Cessada a agitação, as partículas foram lavadas com cinco frações de 2 µL
de etanol 75 %, agitadas por um minuto e novamente lavadas com cinco
frações de 2 µL de etanol 75 %. Em seguida, foram feitas lavagens com seis
frações de 2 µL de água ultrapura sem agitação das partículas magnéticas,
a fim de remover o etanol e não eluir o RNA. Com o canal completamente
preenchido com água, o microchip foi colocado no agitador magnético e as
partículas foram mantidas em movimento por cinco minutos. Após os cinco
minutos de agitação, a solução aquosa contendo RNA purificado foi eluída
com auxílio de uma micropipeta e transferida para um microtubo. A pureza e
qualidade do RNA extraído foram avaliadas conforme procedimento descrito
na seção 2.3.5.

2.4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

2.4.1 Extração dinâmica em fase sólida de RNA em

microtubo

Os primeiros experimentos de dSPE para purificação de RNA do

DENV a partir de amostra de soro de paciente infectado foram realizados em
microtubos de polipropileno, para uma avaliação prévia da viabilidade da
metodologia proposta.
Nesse sentido, a extração de RNA em microtubos foi realizada
seguindo-se as mesmas etapas utilizadas nos experimentos em microchips:
adsorção do RNA em partículas magnéticas de sílica em meio caotrópico,
lavagem das partículas com álcool para remoção de substâncias
indesejadas e eluição do RNA puro em água. Os objetivos desses

36
experimentos eram verificar a compatibilidade do RNA com relação aos
reagentes utilizados, avaliar a adsorção do RNA na fase sólida nas
condições de concentração e pH da solução de GuHCl, avaliar a dessorção
do RNA em água e a pureza e qualidade do RNA purificado segundo essa
metodologia.
A Tabela 2 apresenta as razões A260/280 para RNA purificado a
partir de amostra de soro utilizando duas metodologias diferentes: a
metodologia de dSPE desenvolvida neste trabalho e uma metodologia de
extração em fase líquida adaptada do método proposto por Chomczynski e
Sacchi (1987), que utiliza tiocianato de guanidina, fenol e clorofórmio para
purificar RNA. RNA puro deve ter valores de A260/280 próximos a 2,0
quando dissolvido em tampão TE (pH 8,0), mas pode apresentar valores
entre 1,5 e 1,8 quando dissolvido em água ultrapura (GENOME CENTER
MASSTRICH, 2014). Além disso, o parâmetro A260/280 depende da
concentração do RNA, de forma que uma determinada amostra de RNA
pode ter um valor alto de A260/280 quando a concentração do ácido
nucleico for alta, mas esse valor pode ser reduzido ao realizar diluições
dessa mesma amostra. Assim, de acordo com os dados que constam na
Tabela 2, é possível obter RNA suficientemente puro para as reações
subsequentes a partir da dSPE, sendo a pureza equivalente à obtida a partir
de metodologias convencionais de extração.

Tabela 2. Valores das razões entre as absorbâncias em 260 e 280 nm de RNA purificado a
partir de amostra de soro de pacientes infectados pelo DENV pelos métodos de extração
dinâmica em fase sólida e extração em fase líquida, ambas em microtubos de polipropileno.

Amostra A 260/280
RNA purificado por extração em fase líquida 1,62 ± 0,15
RNA purificado por dSPE 1,55 ± 0,27

Quanto maior o índice de pureza do RNA maior é a probabilidade do

RNA ser utilizado com sucesso em reações subsequentes, como reações de
amplificação pós transcrição reversa. Entretanto, a qualidade do RNA não é
indicada apenas através desse parâmetro, de forma que RNA com alta

37
pureza pode não ter qualidade suficiente para ser detectável por RT-PCR,
devido à degradação do ácido nucleico. A qualidade do RNA deve, portanto,
ser avaliada a partir de reações como a RT-PCR.
Após a realização das reações de amplificação (RT-PCR e semi-
nested-PCR) de um fragmento específico do sorotipo 1 do DENV, o produto
de amplificação de 482 pares de base (pb) foi separado por eletroforese em
gel de agarose e detectado através de incidência de radiação UV. O
resultado encontra-se na Figura 5. O sucesso da reação de detecção de
RNA mostra que é possível extrair RNA viral de qualidade (amplificável) a
partir de amostras complexas como o soro através da dSPE, utilizando as
partículas magnéticas de sílica. Pode-se afirmar que: (1) as moléculas de
RNA adsorvem na superfície das partículas de sílica em um meio contendo
solução de GuHCl 6 mol L-1 pH 6,0; (2) as lavagens com etanol 75%
eliminam suficientemente as substâncias indesejadas que podem também
interagir com a sílica, como proteínas; e (3) RNA de alta qualidade é eluído
em água ultrapura, livre de enzimas ribonucleases. O RNA purificado por
este método tem pureza e qualidade adequadas para a realização das
etapas subsequentes de um teste molecular para a dengue.

Figura 5. Gel de agarose mostrando em (3) o produto de 482 pb obtido após amplificação
via RT-PCR e semi-nested-PCR a partir de RNA do DENV-1 extraído a partir de soro por
extração dinâmica em fase sólida em microtubo; (1) marcador de tamanhos de DNA; (2)
controle negativo.

38
2.4.2 Extração dinâmica em fase sólida de RNA em
microchips de poliéster-toner

Para avaliar a compatibilidade do poliéster e do toner em relação a

todos os reagentes e em relação à estabilidade das moléculas de RNA,
realizou-se primeiramente experimentos de dSPE a partir de amostra pré-
purificada de RNA, obtida a partir da dSPE em microtubo de polipropileno.
Após a realização do procedimento de extração do RNA no microchip
de PeT, o RNA coletado foi submetido a etapa posterior de transcrição
reversa e amplificação. A Figura 6 apresenta os produtos de amplificação de
482 pb obtidos após as reações de RT-PCR e semi-nested-PCR para RNA
pré-purificado extraído em microchips de PeT. O sucesso da reação de
amplificação do cDNA obtido a partir do RNA manipulado no microchip de
PeT indica que não há incompatibilidade entre os materiais utilizados na
fabricação dos microchips (filme de poliéster e toner) e o RNA viral,
principalmente no que diz respeito à degradação do RNA pela ação de
RNases, uma vez que RNA manipulado em microchip foi amplificado. Além
disso, o resultado mostra que o contato do RNA com o filme de poliéster e o
toner não prejudica as etapas subsequentes do diagnóstico molecular, como
a RT-PCR.

Figura 6. Gel de agarose mostrando em (2) o produto de 482 pb obtido após amplificação
via RT-PCR e semi-nested-PCR a partir de RNA do DENV-1 extraído a partir de amostra
pré-purificada em microchip de poliéster-toner, através da extração dinâmica em fase sólida;
(1) marcador de tamanhos de DNA; (3) controle negativo.

39
 Após a realização dos experimentos de extração de RNA a partir de
amostra de soro em microtubos e a partir de amostra pré-purificada em
microdispositivos de PeT, foram realizados experimentos de extração de
RNA a partir de soro em microchips de PeT.
A Tabela 3 apresenta as razões A260/280 para RNA purificado a
partir de amostra de soro utilizando a metodologia de dSPE desenvolvida
neste trabalho em microtubos e em microchips de PeT, e uma metodologia
de extração em fase líquida adaptada do método proposto por Chomczynski
e Sacchi (1987).

Tabela 3. Valores das razões entre as absorbâncias em 260 e 280 nm de RNA purificado a
partir de amostra de soro pelos métodos de extração em fase líquida em microtubos de
polipropileno e extração dinâmica em fase sólida em microtubos e em microchips de
poliéster-toner.

Amostra A 260/280
RNA purificado por extração em fase líquida 1,62 ± 0,15
RNA purificado por dSPE em microtubo 1,55 ± 0,27
RNA purificado por dSPE em microchip de PeT 1,71 ± 0,29

De acordo com os dados apresentados, é possível obter RNA com

pureza satisfatória a partir da dSPE em microchips de PeT, sendo os valores
das razões A260/280 equivalentes aos obtidos através da metodologia
convencional de extração de RNA.
Na literatura científica encontra-se um grande número de trabalhos
envolvendo metodologias de extração de DNA em dispositivos
microfluídicos. Comparativamente, o número de trabalhos envolvendo
extração de RNA é muito menor, pelo fato do RNA ser muito mais instável,
ser facilmente degradado pelas onipresentes RNases e necessitar de uma
etapa adicional de transcrição reversa para então proceder à realização de
reações de amplificação (RODRIGUEZ et al., 2015). Dessa forma,
encontram-se poucas discussões envolvendo o parâmetro A260/280 para
RNA purificado em microdispositivos, o que dificulta a comparação da

40
metodologia desenvolvida neste trabalho com outras metodologias de
extração de RNA em microchips. Um exemplo encontrado é o trabalho
desenvolvido por Kim e colaboradores (KIM et al., 2012), que purificaram
RNA de E. coli em sangue humano através da SPE com a utilização de sílica
em microchips de PDMS, e obtiveram o valor médio de A260/280 igual a
2,02 ± 0,22. Apesar do valor obtido nos experimentos de dSPE em
microchips de PeT ter sido menor, ainda assim apresentou-se adequado
para que o RNA pudesse ser utilizado em reações subsequentes, como a
RT-PCR e a RT-LAMP.

Conforme discutido anteriormente, o índice de pureza do RNA é um

indicador da probabilidade do ácido nucleico ser utilizado com sucesso em
reações subsequentes. Porém, mesmo que o RNA não possua uma alta
razão A260/280 ele ainda pode ser usado com sucesso em reações
posteriores. Dessa forma, é necessário que se realize a amplificação para
avaliar a qualidade do RNA extraído. Foram testadas duas metodologias de
amplificação, a RT-PCR seguida da semi-nested-PCR e a RT-LAMP. RNA
extraído em microchips de PeT a partir de amostra de soro positiva para o
DENV-1 foi amplificado pelas duas metodologias, como mostra a Figura 7.

Figura 7. Géis de agarose mostrando o sucesso das reações de amplificação por (a) RT-
PCR e (b) RT-LAMP utilizando RNA do DENV-1 extraídos a partir de soro em microchips de
poliéster-toner, através da extração dinâmica em fase sólida. (1) marcador de tamanhos de
DNA; (2) controle negativo; (3) Produto de amplificação de RNA extraído a partir de amostra
de soro em microchip.

41
 A extração de RNA de alta qualidade e integridade, ou seja, RNA que
possa ser detectado, é uma etapa crucial para qualquer teste baseado em
técnicas moleculares. Os resultados apresentados na Figura 7 indicam que a
metodologia de dSPE desenvolvida neste trabalho pode ser utilizada para
purificação de RNA do vírus DENV em microdispositivos de PeT a partir de
amostras complexas, como amostra de soro de pacientes infectados pelo
vírus. Isso significa que esta metodologia de extração de RNA pode ser
integrada com outras etapas analíticas como a RT-PCR ou a RT-LAMP e a
separação eletroforética de DNA, produzindo futuramente um microssistema
completamente integrado para o diagnóstico molecular da dengue.

2.4.2.1 Otimização dos parâmetros para purificação de RNA a partir

de amostra de soro em microdispositivos de poliéster-toner

Quatro parâmetros importantes da metodologia de dSPE em

microdispositivos de PeT foram avaliados com a finalidade de se determinar
as condições que produzem os melhores resultados em relação à
quantidade de RNA puro recuperada. Os parâmetros avaliados foram: (a)
tempo de agitação das partículas magnéticas na etapa de adsorção; (b)
tempo de agitação das partículas magnéticas na etapa de eluição; (c) pH da
solução de GuHCl; (d) quantidade de partículas em GuHCl, preparadas
conforme seção 2.3.2. Em cada experimento, o RNA eluído foi quantificado
com a utilização do espectrofotômetro NanoDrop 2000.

(a) Tempo de agitação das partículas magnéticas na etapa de adsorção

Para avaliar o efeito do tempo de agitação das partículas magnéticas
na etapa de adsorção de RNA, foram realizados experimentos variando-se
esse parâmetro e mantendo-se todos os outros parâmetros constantes.
Nesse sentido, os parâmetros mantidos constantes foram: quantidade de
partículas magnéticas em GuHCl igual a 2 µL; quantidade de solução de lise
igual a 4 µL; pH da solução de GuHCl igual a 6,0; e tempo de agitação das
partículas para eluição igual a 5 minutos. Os resultados estão apresentados
na Figura 8.

42
Figura 8. Quantidade de RNA purificado em função do tempo de agitação das partículas
magnéticas na etapa de adsorção (n=5).

Com base nos dados da Figura 8, observa-se que não há diferença

significativa na quantidade de RNA extraído ao utilizar os tempos de 1, 3 e 5
minutos na agitação das partículas magnéticas para a adsorção do RNA.
Assim, ao utilizar o tempo de 1 minuto para adsorção do RNA nos
experimentos de extração, pode-se diminuir o tempo dos experimentos sem
comprometer a quantidade de RNA obtida. Dessa forma, para avaliar os
demais parâmetros, o tempo de agitação das partículas magnéticas na etapa
de adsorção foi mantido em 1 minuto.

(b) Tempo de agitação das partículas magnéticas na etapa de eluição

Para avaliar o efeito do tempo de agitação das partículas magnéticas
na etapa de eluição de RNA, foram realizados experimentos variando-se
esse parâmetro e mantendo-se constantes os demais parâmetros. Segundo
os dados apresentados na Figura 9, observa-se que há diferença
significativa na quantidade de RNA extraído ao utilizar os tempos de 1, 3 e 5
minutos na agitação das partículas magnéticas para a eluição do RNA. A
agitação das partículas para eluição por um tempo de 3 minutos resultou em
maior quantidade de RNA extraído. Dessa forma, para avaliar os demais
parâmetros, o tempo de agitação das partículas magnéticas na etapa de
eluição foi mantido em 3 minutos.

43
Figura 9. Quantidade de RNA purificado em função do tempo de agitação das partículas
magnéticas na etapa de eluição (n=5).

(c) pH da solução de GuHCl 6 mol L-1

Para avaliar o efeito do pH da solução de GuHCl 6 mol L -1 foram
realizados experimentos variando-se esse parâmetro e mantendo-se
constantes os outros parâmetros. A Figura 10 apresenta os resultados dos
experimentos.

Figura 10. Quantidade de RNA purificado em função do pH da solução de hidrocloreto de

guanidina (n=5).

De acordo com a Figura 10, observa-se que não há diferença

significativa na quantidade de RNA extraído ao utilizar as soluções de GuHCl
com pH 6,0 e 7,6. Pelo fato da média ter sido ligeiramente maior com a

44
utilização da solução de GuHCl pH 6,0, este pH foi mantido para a
realização da última série de experimentos.

(d) Volume de partículas magnéticas em GuHCl

Para avaliar o efeito da quantidade de partículas magnéticas de sílica
em solução de GuHCl 6 mol L-1 foram realizados experimentos variando-se
esse parâmetro e mantendo-se constantes os demais parâmetros. Os
resultados estão apresentados na Figura 11. Para uma quantidade fixa de
solução de lise (4 µL), a utilização de 1 µL de partículas magnéticas em
GuHCl resultou na extração de menor quantidade de RNA em comparação
com a utilização de 1,5 e 2 µL. Não houve diferença significativa entre os
volumes de 1,5 e 2 µL. Dessa forma, para a realização dos experimentos de
dSPE para purificação de RNA a partir de soro, pode-se utilizar a relação de
1,5 µL de partículas magnéticas em GuHCl para 4 µL de solução de lise.

Figura 11. Quantidade de RNA purificado em função da quantidade de partículas

magnéticas utilizadas no processo de extração (n=5).

2.4.2.2 Perfil de eluição de RNA extraído em microchips de poliéster-

toner

Experimentos foram realizados com a finalidade de verificar o perfil de

eluição das extrações de RNA em microchips de PeT a partir de amostra de
soro. Foram recolhidas quatro frações de RNA eluído, cada uma contendo

45
um volume de aproximadamente 5 µL, e as frações foram quantificadas com
a utilização do espectrofotômetro NanoDrop 2000. A Figura 12 apresenta o
perfil de eluição de RNA extraído em microchips de PeT.

Figura 12. Perfil de eluição de RNA extraído a partir de amostra de soro em microchips de
poliéster-toner, com frações eluídas contendo 5 µL de solução (n=3).

O perfil de eluição mostra que a maior parte do RNA (52 ± 6 % do

total) é eluída na primeira fração de 5 µL recolhida após o início da
movimentação das partículas magnéticas de sílica para a dessorção e
eluição do RNA. Isso significa que a primeira fração eluída já apresenta
quantidade de RNA suficiente para as etapas subsequentes, como RT-PCR
e RT-LAMP. A concentração da primeira fração eluída foi de 35 ng µL -1, em
média. Em comparação, Park e colaboradores (PARK et al., 2012) obtiveram
RNA purificado do vírus influenza H1N1 com alta qualidade (amplificável)
utilizando sílica como fase sólida em microchips de PDMS e a concentração
de solução de RNA foi, em média, 16 ng µL -1. Shaw et al. (2013) obtiveram
frações contendo RNA amplificável, também em volumes de 5 µL, com
concentrações variando entre 5 e 13 ng µL -1. Nesse trabalho, também foi
utilizada SPE em microchip, sendo que a fase sólida foi constituída por
sílica, o chip foi fabricado com vidro, e RNA foi extraído a partir de tecidos de
fígado de ratos. Assim, verifica-se que as concentrações de RNA obtidas na
primeira fração contendo RNA purificado a partir da dSPE em microchips de
PeT são suficientemente altas para as etapas posteriores do diagnostico
molecular da dengue.

46
2.5 CONCLUSÃO

A facilidade de fabricação dos microchips de PeT, a simplicidade da

técnica de extração, especialmente em relação à instrumentação necessária,
e o baixo custo (tanto da fabricação do dispositivo quanto da extração)
tornam a técnica de dSPE atraente para a extração de RNA em
microdispositivos.
Dentre as vantagens da metodologia de dSPE descrita neste trabalho
podem-se citar a ausência de contato manual com a amostra após a
introdução da mesma no canal microfluídico, o que leva à menor
possibilidade de perda ou contaminação da amostra, o tempo de extração
que, utilizando-se as condições otimizadas, é inferior a dez minutos
(desconsiderando o tempo necessário para a fabricação do microchip), além
do fato da metodologia não utilizar reagentes tóxicos como ocorre na
extração em fase líquida.
Por meio dos resultados apresentados neste capítulo, verifica-se que
a metodologia de dSPE utilizada é capaz de extrair RNA com pureza e
integridade adequadas, ou seja, RNA purificado por esta metodologia pode
ser utilizado em etapas subsequentes de análises genéticas ou diagnósticos
moleculares, como a RT-PCR e RT-LAMP. Dessa forma, pode-se tornar
possível a integração da etapa de extração de RNA com outras etapas
analíticas como a RT-PCR, a RT-LAMP e a separação eletroforética de
DNA.
O desenvolvimento de uma metodologia de extração de RNA simples,
rápida, de fácil execução, e que possa ser utilizada em uma plataforma
microfluídica integrada com outras etapas analíticas permitirá o
desenvolvimento de metodologias analíticas integradas para diagnósticos de
infecções causadas por vírus, como o DENV.

47
2.6 REFERÊNCIAS

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51
 CAPÍTULO 3

AMPLIFICAÇÃO ISOTÉRMICA
MEDIADA POR LOOP PÓS
TRANSCRIÇÃO REVERSA (RT-LAMP)
EM MICROCHIPS DE POLIÉSTER-
TONER

52
3.1 INTRODUÇÃO

O desenvolvimento de métodos de diagnósticos rápidos, precisos e

sensíveis para identificação de patógenos é fundamental para o tratamento,
controle, e até mesmo erradicação de doenças infecciosas (MORI; NOTOMI,
2009). Dentre as várias metodologias disponíveis para diagnósticos de
doenças, a detecção de sequências conservadas de DNA ou RNA de
patógenos têm sido extensivamente utilizadas para identificar o agente
infeccioso ou determinar o estágio da infecção (CHIN; LINDER; SIA, 2007).
A detecção de sequências específicas de nucleotídeos em uma
molécula de DNA é frequentemente dificultada pela presença de outros
materiais indesejados ou pela quantidade muito pequena de material de
interesse nas amostras biológicas (SAIKI et al., 1987). Visando contornar
esses problemas, Mullis et al. (1985) desenvolveram uma técnica de
amplificação de um fragmento específico de DNA chamada PCR (reação em
cadeia da polimerase), capaz de produzir um aumento na quantidade de
uma sequência específica de DNA por um fator de 10 6.
A amplificação de um fragmento de DNA por PCR envolve a utilização
de dois oligonucleotídeos (iniciadores) e uma enzima DNA polimerase, que
atuam através da realização de ciclos envolvendo três etapas: desnaturação,
anelamento e extensão. Na primeira etapa, a fita dupla do DNA é
desnaturada, em uma temperatura entre 90 e 94 ºC, através da quebra das
ligações de hidrogênio entre os pares de bases adenina (A) e timina (T) e
entre guanina (G) e citosina (C). Na segunda etapa, a temperatura é
reduzida para 50 – 70 ºC, temperatura em que os iniciadores se anelam às
fitas simples do DNA. Os iniciadores são sintetizados para serem
complementares aos segmentos iniciais e finais do fragmento de interesse.
Na terceira etapa a temperatura é aumentada para 70 – 75 ºC, e uma
enzima DNA polimerase (geralmente a Termus aquaticus (Taq) DNA
polimerase) sintetiza a nova fita de DNA a partir da região onde os
iniciadores estão anelados. As reações são realizadas em um equipamento
chamado termociclador, e os ciclos de amplificação são repetidos
normalmente entre 25 e 40 vezes para se obter uma quantidade satisfatória

53
de produtos de amplificação para análises posteriores (AMC TECHNICAL
BRIEFS, 2014). Existem algumas variações da PCR, como a PCR pós
transcrição reversa (RT-PCR). Nesse caso, ocorre a formação de DNA
complementar (cDNA) a partir de RNA por uma enzima transcriptase
reversa, e na sequência ocorre a amplificação via PCR (DE LADEIRA;
ISAAC; FERREIRA, 2011).
Após a amplificação do ácido nucleico é necessário ainda uma etapa
de separação e detecção dos fragmentos amplificados para confirmar a
presença do alvo. Todos esses passos exigem, frequentemente, a utilização
de instrumentos complexos de laboratório e pessoal capacitado, além de
apresentarem um custo elevado. Essa combinação de fatores representa
obstáculos para que os diagnósticos moleculares movam-se das bancadas
de laboratório para aplicações no point-of-care, necessários na maioria dos
monitoramentos de saúde pública.
A PCR é atualmente a técnica mais utilizada para amplificação de
ácidos nucleicos tanto no formato convencional, utilizando microtubos e
termocicladores de bancada, como no formato miniaturizado (OBEID;
CHRISTOPOULOS, 2003, KUMARIA; CHAKRAVARTI, 2005, JHA et al.,
2011, LIN et al., 2013). Todavia, devido ao elevado custo da instrumentação
para PCR, métodos isotérmicos de amplificação têm sido recentemente
desenvolvidos e vêm sendo utilizados para a detecção de doenças
infecciosas. Sem a necessidade de ciclos térmicos, os métodos isotérmicos
podem ser projetados para serem de baixo consumo de energia e, portanto,
podem ser facilmente adaptáveis para o desenvolvimento de sistemas
portáteis. Dentre as técnicas de amplificação isotérmica, a amplificação
isotérmica mediada por loop (LAMP) tem recebido grande destaque. A
técnica foi desenvolvida em 2000 por Notomi e colaboradores, que
propuseram um método de amplificação de DNA capaz de produzir um
aumento na quantidade de uma sequência específica de DNA por um fator
de 109 em menos de uma hora de reação sob condições de temperatura
constante (NOTOMI et al., 2000), o que dispensa o uso de termocicladores e
torna mais fácil a integração com outras etapas analíticas para o
desenvolvimento de dispositivos de diagnóstico mais acessíveis.

54
 A LAMP emprega a enzima Bst DNA polimerase, com atividade de
deslocamento de fita, e dois pares de iniciadores, um par de iniciadores
internos (FIP – Forward inner primer e BIP – Backward inner primer) e um
par de iniciadores externos (F3 e B3), que são desenhados para reconhecer
seis regiões do DNA alvo (NOTOMI et al., 2000). Além dos iniciadores FIP,
BIP, F3 e B3, podem também ser utilizados dois iniciadores adicionais, LF e
LB, que podem se anelar às estruturas de loop formadas, diminuindo o
tempo e aumentando a sensibilidade da reação (NAGAMINE; HASE;
NOTOMI, 2002). A reação acontece em duas etapas, uma etapa inicial não
cíclica e uma etapa final cíclica. A Figura 13 apresenta o mecanismo da
etapa não cíclica.

Figura 13. Mecanismo da etapa não cíclica da LAMP. a) Regiões do DNA alvo: F3, F2, F1,
B1c, B2c e B3c; e iniciadores: FIP, BIP, F3 e B3. b) (1) O iniciador FIP se anela à região
F2c e ocorre a síntese da fita complementar; (2) O iniciador F3 se anela à região F3c e a fita
é deslocada. (3) A fita liberada na etapa anterior forma uma estrutura de loop (laço),
gerando a estrutura 4. (4) O iniciador BIP se anela à região B2c e ocorre a síntese da fita
complementar, eliminando o loop da outra extremidade; o iniciador B3 se anela à região B3c
e a fita é deslocada. A fita liberada na etapa anterior forma duas estruturas de loop (laço),
gerando a estrutura 5. Fonte: Tomita et al. (2008).

Na etapa não cíclica acontece a formação de dois loops nas

extremidades da fita simples de DNA. Essa estrutura formada serve de
ponto de partida para a etapa cíclica, cujo mecanismo está apresentado na

55
Figura 14. Na etapa não cíclica os quatro iniciadores, FIB, BIP, F3 e B3
atuam na formação dos loops. Na etapa cíclica atuam apenas os iniciadores
internos, FIP e BIP, podendo também haver a participação dos iniciadores
LF e LB, que podem diminuir o tempo de reação e aumentar a sensibilidade.
A utilização dos iniciadores LF e LB não está demonstrada na Figura 14.

Figura 14. Mecanismo da etapa cíclica da LAMP. Partindo da estrutura (5), ocorre
anelamento do iniciador FIP à região F2c na extremidade do loop formado por F1 e F1c.
Após uma série de etapas, obtém-se a estrutura 7, que é complementar à estrutura 5. A
estrutura 7 dá origem à estrutura 8, a partir do anelamento do iniciador BIP na região B2c do
loop formado por B1c e B1, na extremidade direita da fita. A estrutura 5 pode ser novamente
produzida após uma série de etapas. Estruturas mais alongadas, como a 11 e 12, podem
também ser obtidas. Fonte: Tomita et al. (2008).

56
 Como pode ser observado na Figura 14, a LAMP produz uma mistura
de fragmentos amplificados com vários tamanhos e estruturas diferentes,
diferentemente da PCR que, usualmente, leva à amplificação de apenas um
fragmento de tamanho específico.
A principal vantagem da LAMP em relação à PCR é o fato da reação
acontecer em temperatura constante, entre 60 e 66 ºC, o que dispensa o uso
de equipamentos caros como termocicladores, ou seja, as reações podem
ser realizadas em termobloco ou banho-maria. A LAMP também é muito
específica, uma vez que são utilizados quatro ou seis iniciadores para
reconhecer seis sequências diferentes do DNA alvo (DRAPALA;
KORDALEWSKA, 2013). A alta sensibilidade também é uma característica
muito importante dessa técnica; a LAMP é capaz de amplificar uma amostra
contendo apenas uma cópia de DNA até a obtenção de uma quantidade de
produto detectável (CONNELLY; ROLLAND; WHITESIDES, 2015). Além
disso, a adição de uma enzima transcriptase reversa à mistura reacional
torna possível a amplificação de DNA a partir de RNA, em uma reação
chamada RT-LAMP (MORI; NOTOMI, 2009).
Além das vantagens citadas anteriormente, a LAMP apresenta mais
uma importante característica: os produtos de amplificação podem ser
detectados visualmente sem a necessidade da realização de uma etapa
adicional de separação eletroforética (DRAPALA; KORDALEWSKA, 2013).
Esse fato faz da LAMP uma técnica muito poderosa para o desenvolvimento
de dispositivos portáteis para análises no point-of-care (DHAMA et al., 2014).
A detecção visual pode ser feita por turbidimetria ou por fluorescência
gerada após a adição de um intercalador (PARIDA et al., 2008). A
turbidimetria se baseia no fato de que durante a amplificação do DNA uma
grande quantidade de íons pirofosfato são formados a partir dos dNTP’s
(TOMITA et al., 2008). Esses íons podem se combinar com íons magnésio
presentes na mistura reacional (provenientes do MgSO4) e formar um sal
insolúvel de coloração branca (MORI et al., 2001). Essa coloração, todavia,
não é muito intensa para a detecção visual precisa (TOMITA et al., 2008).
Dessa forma, os produtos de amplificação podem ser visualizados por
fluorescência com a utilização de uma substância intercalante, como

57
brometo de etídeo e SYBR Green, com posterior submissão dos produtos à
radiação UV (PARIDA et al., 2008).

3.1.1 Aplicações da amplificação isotérmica mediada por

loop

Devido às vantagens da técnica, muitos trabalhos podem ser

encontrados na literatura envolvendo a detecção de patógenos em amostras
biológicas através da LAMP (IHIRA et al., 2007, HILL et al., 2008) ou RT-
LAMP (CHO; PARK, 2005, TEOH et al., 2013, CHANDRASEKAR et al.,
2015). O uso da RT-LAMP em escala convencional tem crescido para o
diagnóstico de doenças virais. Lu e colaboradores (LU et al., 2012), por
exemplo, desenvolveram um método rápido para diagnóstico de dengue e
chikungunya a partir de amostras de soro utilizando RT-LAMP. Parida et al.
(2005), Sahni et al. (2013) e Teoh et al. (2013) também desenvolveram
metodologias para diagnóstico da dengue por RT-LAMP. Hayasaka e
colaboradores desenvolveram um ensaio para detectar o RNA do vírus
causador da encefalite (HAYASAKA; AOKI; MORITA, 2013), enquanto Bao e
colaboradores detectaram o subtipo H7N9 do vírus da gripe aviária (BAO et
al., 2014).
Recentemente, metodologias de amplificação de ácidos nucleicos via
LAMP ou RT-LAMP têm sido adaptadas para utilização em dispositivos
microfluídicos. Wang e colaboradores (WANG et al., 2011), por exemplo,
fabricaram um microdispositivo combinando camadas de vidro e PDMS e
fizeram RT-LAMP para identificação de fragmentos específicos de RNA do
vírus causador da necrose nervosa viral. Connelly e colaboradores
(CONNELLY; ROLLAND; WHITESIDES, 2015) fabricaram um dispositivo a
base de papel e amplificaram fragmentos do DNA da bactéria Escherichia
coli via LAMP. Os produtos de amplificação foram detectados visualmente,
através da adição do corante SYBR Green. Wu et al. (2011) integraram as
etapas de extração de ácido nucleico (λ DNA, a partir de amostra de sangue
humano), amplificação via LAMP e detecção visual observada por

58
fluorescência em um único microchip de vidro, fabricado por fotolitografia. Os
produtos de amplificação foram analisados por detecção visual com a
utilização do corante SYBR Green.

3.2 OBJETIVOS

O objetivo deste capítulo foi desenvolver uma metodologia para

amplificação isotérmica mediada por loop pós transcrição reversa (RT-
LAMP) em única etapa em microdispositivos descartáveis de PeT, para
possibilitar a detecção rápida do vírus dengue.

3.3 MATERIAIS E MÉTODOS

3.3.1 Material de estudo, reagentes e soluções

O material de estudo foi constituído por amostras de soro

provenientes de indivíduos com suspeita de infecção pelo DENV, em
investigação epidemiológica realizada pelo laboratório de Virologia do IPTSP
da UFG. As amostras foram previamente triadas seguindo protocolo descrito
por Lanciotti et al. (1992), estabelecido para a detecção e sorotipagem
molecular do DENV. Foram selecionadas amostras identificadas como
positivas para o sorotipo 1 (DENV-1) em estudo desenvolvido por Guimarães
(2014). RNA viral foi purificado de acordo com procedimento descrito na
seção 2.3.4.
O reagente (DTT), as enzimas SuperScriptTM III Reverse
Transcriptase e RNase Out, e o padrão de tamanhos de DNA 100 bp DNA
ladder foram obtidos junto à Invitrogen/Life Technologies (Foster City, CA).
Betaína e água grau biologia molecular foram adquiridas junto à Sigma-
Aldrich (St. Louis, MO). Albumina de soro bovina (BSA) foi obtida junto à
Amersham/GE Healthcare e dNTP’s foram adquiridos junto à Ludwig Biotech

59
(Alvorada, RS). A enzima Bst DNA polimerase e sulfato de magnésio
(MgSO4) foram adquiridos junto à New Engalnd Biolabs (Ipswich, MA).

3.3.2 Fabricação dos microchips de poliéster-toner

Os dispositivos microfluídicos de PeT utilizados na RT-LAMP foram

fabricados por impressão, corte e laminação, segundo a metodologia
descrita na seção 2.3.6, com pequenas modificações. Foram utilizadas três
camadas intermediárias de poliéster com toner com os canais recortados, de
forma que os microdispositivos apresentaram cinco camadas: três camadas
intermediárias, um topo e uma base. As dimensões dos microcanais também
foram alteradas; a geometria dos canais foi desenhada no software
CorelDRAW 11 como sendo um retângulo com largura de 2 mm e
comprimento de 8 mm. O volume dos canais foi de 5 µL.

3.3.3 Amplificação isotérmica mediada por loop pós

transcrição reversa

RNA purificado a partir de amostra de soro positiva para o sorotipo 1

do vírus dengue foi submetida à RT-LAMP. O protocolo utilizado consistiu de
uma adaptação do protocolo descrito por Parida et al. (2005). Os iniciadores
(Tabela 1, apresentada na seção 2.3.5 do Capítulo 2) foram selecionados
para amplificar fragmentos da região 3’UTR do genoma viral.
Primeiramente, foi feita a passivação da superfície interna do canal
microfluídico com a introdução de solução de BSA 0,6 mg mL -1. Esperou-se
a solução secar para a realização das reações. As misturas reacionais da
RT-LAMP foram preparadas com a seguinte composição de reagentes: 0,2
µM dos iniciadores F3 e B3; 1,6 µM dos iniciadores FIP e BIP; 0,8 µM dos
iniciadores FLP e BLP; 2 mM de DTT; 1,6 unidades/µL da enzima
SuperScriptTM III Reverse Transcriptase; 0,32 unidades/µL da enzima RNase
Out; 0,96 unidades/µL da enzima Bst DNA polimerase; 0,24 mg mL-1 de
BSA; 8 mM de sulfato de magnésio (MgSO4); 0,9 µM de betaína; 1,4 mM de

60
cada um dos quatro dNTP’s, e 1 ng µL-1 de RNA. Foram feitos controles
negativos, em que RNA foi substituído por água ultrapura. 5,0 µL da mistura
reacional foram introduzidos no canal microfluídico e os reservatórios foram
cobertos com óleo mineral, para impedir a evaporação da solução. Os
microdispostivos foram então colocados em um termobloco (Major Science,
Saratoga, CA) na temperatura de 65 ºC. O tempo de reação foi de 60
minutos. Após a reação, a temperatura foi aumentada para 80 ºC e mantida
por dois minutos, para a inativação da enzima Bst polimerase.
Os produtos da RT-LAMP foram analisados em gel de agarose a 2 %
em tampão TEB. Para a correta identificação dos fragmentos amplificados,
foi utilizado um padrão de tamanhos de DNA 100 bp DNA ladder. Os
produtos também foram visualizados a olhu nu, através da retirada da
solução do microchip e transferência para um microtubo, seguida da adição
do intercalador fluorescente BoboTM.

3.4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

Devido à grande área superficial apresentada pelos microcanais, os

reagentes utilizados nas reações de amplificação podem interagir com as
superfícies dos canais microfluídicos, reduzindo a eficiência dessas reações
ou até mesmo inibindo-as (LEE; HSING, 2006). Para minimizar esses
problemas torna-se necessário realizar uma etapa preliminar de passivação
da superfície interna dos microcanais, para então introduzir a mistura
reacional. As principais substâncias utilizadas na passivação são
polietilenoglicol (PEG), polivinilpirrolidona (PVP) e albumina de soro bovina
(BSA). Esses reagentes ligam-se preferencialmente à superfície do material
que constitui o dispositivo e criam barreiras para a interação dos demais
reagentes com essa superfície. Dessa forma, os reagentes ficam livres para
promoverem as reações de amplificação (BESECKER; CORNELL;
HAMPIKIAN, 2013). Neste trabalho, a passivação dos microcanais para RT-
LAMP foi feita com BSA 0,6 mg mL-1.

61
 Outro aspecto importante no que diz respeito à realização de reações
de amplificação em microdispostivos é a razão área/volume (A/V) dos
canais. Tradicionalmente, as reações de amplificação são realizadas em
microtubos de polipropileno que apresentam uma razão área/volume de
apenas 1,6 mm2 µL-1 para 25 µL de solução (OUYANG et al., 2015). Nos
microdispositivos a razão A/V tende a ser bem superior. A grande razão A/V
dos canais microfluídicos tende a diminuir a eficiência da reação porque,
mesmo passivada, a superfície ainda pode interagir, em menor proporção,
com os reagentes da mistura reacional.
Experimentos iniciais de RT-LAMP foram feitos em microchips com
duas camadas intermediárias de PeT, obtendo-se microcanais com razão
A/V igual a 8,0 mm2 µL-1 (Resultados não mostrados). Devido ao insucesso
das reações, foi adicionada uma terceira camada intermediária de poliéster
com toner, aumentando o volume dos microcanais e diminuindo a razão A/V
para 6,4 mm2 µL-1. Com isso, as reações de amplificação passaram a ser
bem sucedidas, como mostra a Figura 15.
Após o estudo desses fatores realizou-se a RT-LAMP de um
fragmento específico do sorotipo 1 do DENV e os produtos de amplificação
foram separados por eletroforese em gel de agarose (Figura 15 a) ou
detectados visualmente através da adição do intercalador Bobo TM após o
final da reação (Figura 15 b). O microtubo da direita contém os produtos de
amplificação (apresenta fluorescência sob ação da luz UV) e o microtubo da
esquerda é o controle negativo, sem a presença de RNA.
O sucesso da reação de amplificação de RNA apresentado na Figura
15 mostra que os dispositivos de poliéster-toner são compatíveis com os
reagentes utilizados na reação e podem ser utilizados para a realização de
RT-LAMP a partir de amostras de RNA. Esses primeiros resultados são
ilustrativos para demonstrar o potencial dos microchips de PeT para serem
usados em reações de amplificação de RNA através de uma metodologia
simples e rápida como a RT-LAMP. Em próximas etapas serão
desenvolvidas metodologias para amplificação de RNA diretamente da
amostra de soro intacta, além de diferenciação dos diferentes sorotipos do
vírus dengue.

62
Figura 15. (a) Gel de agarose mostrando os produtos de amplificação de amostra de RNA
do DENV-1 obtidos através da amplificação isotérmica mediada por loop pós transcrição
reversa (RT-LAMP) em microdispositivos de poliéster-toner; (1) produtos de amplificação;
(2) controle negativo; (3) marcador de tamanhos de DNA. (b) Detecção visual da
TM
amplificação do vírus da dengue através da adição de Bobo .

3.5 CONCLUSÃO

Os resultados apresentados neste capítulo demonstram o potencial

dos dispositivos de PeT na execução de processos relacionados à
amplificação de RNA. Esses dispositivos demonstraram serem compatíveis
com todos os reagentes usados na RT-LAMP e capazes de detectar
fragmentos de RNA por meio dessa poderosa técnica de amplificação de
ácidos nucleicos, que é mais rápida, barata, sensível e exige menos
instrumentação sofisticada que a principal técnica de amplificação de ácidos
nucleicos existente, a PCR. Além disso, a RT-LAMP não necessita de uma
etapa posterior de separação eletroforética para detecção dos produtos de
amplificação, uma vez que estes podem ser visualizados a olho nu, através
da adição de intercaladores.
Embora o objetivo final seja o desenvolvimento de microchips de PeT
completamente integrados contendo todas as partes necessárias para os
testes moleculares, neste trabalho foi demonstrado, pela primeira vez, o
sucesso do uso dos dispositivos de PeT descartáveis e de baixo custo para
análises envolvendo RNA, representando avanços em direção a produção

63
de dispositivos de PeT para análises totais. Dispositivos com capacidade
sample-in-answer-out terão grande potencial para serem extensivamente
utilizados em diagnósticos de infecções causadas por vírus que possuem
RNA genômico, como a dengue.

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CURRICULUM VITAE

1. Informações pessoais

Nome completo: Thiago Dadalto Gimenez

Endereço eletrônico: thiagodgimenez@gmail.com
Naturalidade: Paranavaí – PR
Data de nascimento: 07/05/1988
Filiação: Marcio Fernando Gimenez e Maria Regina Dadalto Gimenez

2. Formação acadêmica

Bacharel em Química
Universidade Estadual de Maringá (UEM)
Maringá – Paraná (PR)
2009 – 2013

3. Atividades

3.1. Trabalhos apresentados em eventos científicos

1) GIMENEZ, T. D.; DUARTE, G. R. M.; BAILÃO, A. M.; FIACCADORI,

F. S.; ROSA, H. C. Desenvolvimento de metodologia de extração
dinâmica em fase sólida (dSPE) para purificação de RNA em
mcirochips de poliéster-toner (PeT). 55° Congresso Brasileiro de
Química, 2015, Goiânia – GO, Brasil.

2) GIMENEZ, T. D.; DUARTE, G. R. M.; BAILÃO, A. M.; ROSA, H. C.

Extração de RNA em dispositivos microfluídicos de poliéster-toner. 1°
Workshop da Pós-Graduação em Química, 2015, Goiânia – GO,
Brasil.

3) GIMENEZ, T. D.; DUARTE, G. R. M.; BAILÃO, A. M.; FIACCADORI,

F. S.; ROSA, H. C. Development of a dynamic solid-phase extraction
method for RNA from dengue virus in polyester-toner based

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microchip. 21st Latin-American Symposium on Biotechnology,
Biomedical, Biopharmaceutical, and Industrial Applications of Capillary
Electrophoresis and Microchip Technologies, 2015, Cartagena –
Colômbia.

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