Determinación de fluorescencia de la

cochinilla en mermelada de fresa en

presencia de carmoisina como un inhibidor
mediante descomposición PARAFAC de
cuatro vías
Los enlaces de los autores abren el panel de
superposiciónL. Rubio aS. Sanllorente aL.A. SarabiabMC Ortiza
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Reflejos
•
Determinación de cochinilla en mermelada de fresa por EEM y modelo
PARAFAC de cuatro vías.
•
La carmoisina actuó como un desactivador en la señal de fluorescencia de
la cochinilla.
•
El PARAFAC de cuatro vías evita decisiones falsas en la determinación de
la cochinilla.
•
La cochinilla se identificó y cuantificó inequívocamente en presencia de
carmoisina.
•
Se detectó cochinilla en la mermelada de fresa por encima de su nivel
máximo de residuos.

Resumen
La determinación de la cochinilla (E-120) en mermelada de fresa se llevó a cabo
en presencia de carmoisina (E-122) usando las matrices de descomposición
 PARAFAC de cuatro vías y fluorescencia de emisión de excitación. En las
condiciones medidas, no hubo señal de fluorescencia para la carmoisina debido a
un fuerte efecto de enfriamiento y este colorante también condujo a una
disminución de la señal de fluorescencia de la cochinilla. La Unión Europea ha
fijado un nivel máximo de residuos, LMR, para la cochinilla en mermelada (100
mg kg -1 ). Por lo tanto, la adición de otro colorante alimentario (carmoisina) en la
mermelada podría conducir a decisiones falsas de cumplimiento. La
descomposición de PARAFAC de cuatro vías evitó decisiones falsas de
cumplimiento causadas por el efecto de enfriamiento.
La cochinilla se identificó inequívocamente. La capacidad de detección (CCβ)
fue de 0,72 mg L −1 para las probabilidades de falso positivo y falso negativo
fijado en 0,05. Se detectó cochinilla en la mermelada (104,63 mg kg -1 ) por
encima del LMR. Esta cantidad se comparó con la obtenida usando un método
HPLC / DAD.
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Abreviaturas
CCβ
Capacidad de detección
CORCONDIA
diagnóstico de consistencia central
CCα
límite de decisión
PAPÁ
detección de matriz de diodos
EFSA
Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria
EEM
matrices de fluorescencia de emisión de excitación
HPLC
cromatografía líquida de alto rendimiento
EN S
Sistema de numeración internacional
LMR
niveles máximos de residuos
PARAFAC
Análisis factorial paralelo
RASFF
Sistema de alerta rápida para alimentos y piensos
TOFMS
tiempo de vuelo espectrometría de masas
Palabras clave
Cochinilla
Carmoisina
Fluorescencia de emisión de excitación
Descomposición de cuatro vías PARAFAC
Efecto de enfriamiento
Mermelada de fresa
Compuestos químicos estudiados en este artículo.
Cochinilla (PubChem CID: 14950)
Carmoisina (PubChem CID: 19118)

1 . Introducción
La determinación de analitos en matrices complejas se puede llevar a cabo
mediante análisis multidireccional. Los datos de tres vías se obtienen uniendo
datos de segundo orden (una matriz de datos) para varias muestras, mientras que
los datos de cuatro vías se obtienen cuando se agregan datos de tercer orden en la
cuarta dirección para un conjunto de muestras. Los datos de tercer orden se están
estudiando cada vez más ( Escandar, Goicoechea, Muñoz de la Peña y Olivieri,
2014 ) y pueden proporcionar información analítica más rica. Se obtienen
ejemplos de datos de cuatro vías: i) con instrumentos con guiones como
la cromatografía bidimensional con detección de matriz de diodos (DAD) o
con espectrometría de masas de tiempo de vuelo (TOFMS) ( Parastar et al., 2011)
y ii) con un solo instrumento que registra matrices de fluorescencia de emisión de
excitación (EEM) en función del tiempo de reacción ( Carabajal, Arancibia y
Escandar, 2017 ), pH ( Pagani e Ibañez, 2017 ), proporción de solvente ( Zhang
et al. ., 2016 ), volumen de extintor ( Rodríguez, Ortiz y Sarabia, 2009a ) o nivel
de dilución ( Rubio, Sarabia y Ortiz, 2015 ). Los datos de cuatro vías también se
pueden obtener mediante el monitoreo de EEM en diferentes puntos de tiempo
de elución en un procedimiento de cromatografía líquida de alta resolución
(HPLC) ( Montemurro et al., 2016 ).
El análisis de factores paralelos (PARAFAC) es uno de los algoritmos
disponibles para procesar estos datos de múltiples vías ( Carabajal et al.,
2017 , Pagani e Ibañez, 2017 , Rodríguez et al., 2009a , Rubio et al.,
2015 , Zhang et al. ., 2016 ). La ventaja de segundo orden en la química analítica
permite la identificación y cuantificación de los analitos de interés incluso en
presencia de interferencias no calibradas. Esto es posible cuando la matriz de
datos experimentales es compatible con el modelo PARAFAC.
Sin embargo, la pérdida de trilinealidad puede deberse a los efectos del filtro
interno causados por altas concentraciones, dispersión y enfriamiento ( Andersen
y Bro, 2003 ). El apagado de fluorescencia representa cualquier proceso que
disminuye la intensidad de fluorescencia de una muestra. Una amplia variedad de
moléculas o iones pueden actuar como desactivadores ( Lakowicz,
2006 ). La descomposición de PARAFAC de cuatro vías fue útil en la
determinación de fluorescencia de la tetraciclina bajo el fuerte efecto de
enfriamiento producido por el té ( Rodríguez et al., 2009a ) y en el estudio de la
robustez del procedimiento para determinar la tetraciclina en la leche en
presencia de clorotetraciclina como apagador (Rodríguez, Ortiz y Sarabia,
2009b ).
Los métodos de detección se utilizan ampliamente para evaluar la calidad de los
alimentos. La aplicación de la espectroscopía de fluorescencia junto con técnicas
multidireccionales tiene un enorme potencial para la evaluación de la calidad de
los alimentos ( Karoui y Blecker, 2011 ) y la seguridad alimentaria debido al bajo
costo y la alta sensibilidad de esa espectroscopía. Sin embargo, podría haber un
efecto de enfriamiento en las condiciones medidas de los analitos de interés que
podría disminuir su señal de fluorescencia y conducir a decisiones falsas de
conformidad en su determinación. La descomposición PARAFAC de cuatro vías
se puede utilizar para resolver este problema.
Los colorantes alimentarios se utilizan para: i) restaurar el aspecto original de los
alimentos cuyo color se ha visto afectado por el procesamiento, almacenamiento,
envasado y distribución; ii) hacer que la comida sea visualmente más atractiva; y
/ o iii) dar color a los alimentos que de otro modo serían incoloros ( Reglamento
(CE) No 1333/2008 ). Estos aditivos alimentarios mejoran la demanda mundial
de alimentos por parte de los consumidores, al tiempo que ocultan sus
características desagradables ( Martins, Lobo Roriz, Morales, Barros y Ferreira,
2016 ). Los alimentos y las bebidas han sido coloreados desde la antigüedad. La
evolución del uso de colorantes alimentarios se puede ver en ( Coultate y
Blackburn, 2018 ).
El colorante alimentario E-120 corresponde a cochinilla, ácido carmínico y
carminas; mientras que la azorubina (que también se llama carmoisina) se
identifica como E-122. El Panel de la Autoridad Europea de Seguridad
Alimentaria (EFSA) ( EFSA, 2015a ) propuso recientemente la modificación de
las especificaciones para E-120 a "extracto de cochinilla, ácido carmínico y
carminas" que reflejaría con mayor precisión el material utilizado como colorante
alimentario.
Los colorantes o componentes sintéticos obtenidos de fuentes naturales pueden
usarse como colorantes alimentarios. Las plantas, algas , hongos, bacterias y
animales, como los insectos, son fuentes tradicionales de aditivos naturales de
colorantes alimentarios ( Solymosi, Latruffe, Morant-Manceau y Schoefs,
2015 ). El ácido carmínico es un colorante alimenticio natural extraído de los
cuerpos secos de los insectos cochinilla femeninos ( Dactylopius coccus Costa)
que se cosechan de los cactus Opuntia ( Coultate y Blackburn, 2018 ) en varias
partes del mundo. Se han informado reacciones alérgicas inducidas por
la ingestión de alimentos procesados que contienen extracto de cochinilla o
carmín ( EFSA, 2015a , Takeo et al., 2018) Estas reacciones alérgicas inducidas
por extracto de cochinilla, que incluyen asma, urticaria, disnea y anafilaxia,
pueden deberse a las impurezas proteicas de la fuente del insecto que quedan
después de la extracción del extracto de cochinilla ( Yamakawa, Oosuna,
Yamakawa, Aihara e Ikezawa, 2009 ) El Panel de EFSA ( EFSA, 2015a )
consideró que debería requerirse una indicación adicional sobre las proporciones
o porcentajes del contenido de proteína , peso molecular de las proteínas
alergénicas clave, cenizas totales, solventes residuales o materia insoluble en el
producto comercial de E-120 .
Por otro lado, también se ha evaluado ampliamente la seguridad de los colorantes
alimentarios sintéticos. Se han desarrollado varios métodos analíticos para el
análisis de colorantes azoicos comúnmente utilizados en las industrias
alimentarias de diferentes partes del mundo ( Yamjala, Subramania Nainar y Rao
Ramisetti, 2016 ). La carmoisina es un colorante azo sintético autorizado como
aditivo alimentario en la Unión Europea. El Reglamento (CE) no
1333/2008 ( Reglamento (CE) no 1333/2008 ) establece que el etiquetado de los
alimentos que contienen carmoisina debe incluir la siguiente información de
advertencia en el envase: "puede tener un efecto adverso sobre la actividad y la
atención en los niños". McCann y col. (2007)informó que la ingesta de mezclas
de cuatro colorantes sintéticos (que contienen carmoisina) junto con benzoato de
sodio como conservante aumentó la hiperactividad en niños de 3 años y de 8 a 9
años. Sin embargo, el Panel de EFSA concluyó que no es posible relacionar los
hallazgos de ese estudio con ninguno de los compuestos individuales ya que los
peligros de los aditivos alimentarios individuales no pueden evaluarse utilizando
mezclas ( EFSA, 2008 ). El Panel de la EFSA también informó una evaluación de
exposición refinada para la carmoisina como aditivo alimentario ( EFSA,
2015b ).
En la Unión Europea, los niveles máximos de residuos (LMR) para algunos
colorantes alimentarios se han establecido según la categoría de alimentos en el
Reglamento (UE) no 1129/2011 de la Comisión para garantizar buenas prácticas
de fabricación y seguridad sanitaria de los consumidores. Se han transmitido
varias notificaciones al Sistema de Alerta Rápida para Alimentos y Piensos
(RASFF) de la Comisión Europea ( Portal RASFF, 2018 ) por diferentes países
de la UE debido a un uso no autorizado o un contenido demasiado alto de E-120
y E-122. Del 13/06/2003 al 20/06/2018, se transmitieron 11 notificaciones para
E-120 y 63 para E-122.
Se puede ver una amplia revisión sobre la metodología utilizada para la
determinación de cochinilla / ácido carmínico / carmín en los alimentos desde
1986 hasta 2011 ( Scotter, 2011 ). En 2015, una reevaluación de cochinilla, ácido
carmínico, carminas (E-120) como aditivos alimentarios, realizada por el
Panel EFSA ( EFSA, 2015a ), informó varios métodos para la determinación de
estos colorantes. Las técnicas más utilizadas son las técnicas
espectrofotométricas ( Samari, Hemmateenejad y Shamsipur, 2010 ) o HPLC
con UV-Viso detectores de fluorescencia. Los procedimientos electroquímicos se
han usado menos debido a la falta de selectividad causada por la alta dependencia
de factores externos como el pH, la temperatura o la presencia de interferencias
orgánicas. El análisis de espectrometría de masas de alta resolución y
cromatografía líquida de ultra alto rendimiento se ha utilizado recientemente para
esa tarea, ya que es una técnica sensible y precisa ( Gosetti et al., 2015 ). Yamjala
y col. (2016) informaron varios métodos para determinar los colorantes azoicos
empleados en la industria alimentaria, como el ácido carmínico y el carmín en el
vino y los refrescos. Ordoudi, Staikidou, Kyriakoudi y Tsimidou (2018) detalla
varios procedimientos basados en técnicas espectroscópicas y cromatográficas y
las recuperaciones encontradas con ellos para un nivel de concentración
específico.
Aunque estos métodos están bien probados y son ampliamente aceptados, existen
algunos problemas (equipos relativamente caros, requisitos de experiencia
técnica avanzada, preparaciones de muestras extensas y que requieren mucho
tiempo) que les impiden desarrollar y ampliar su aplicación. Por lo tanto, se
necesita el desarrollo de un método rápido, rentable y sensible para la
determinación cuantitativa de la cochinilla. Un candidato adecuado sería la
fluorescencia EEM, que es una técnica altamente sensible, junto con PARAFAC
para evitar los pasos de extracción.
En este trabajo, la determinación de la cochinilla en la mermelada de fresa se
realizó en presencia de carmoisina, que actuó como un desactivador ,
utilizando espectroscopía de fluorescencia molecular (con datos de excitación-
emisión) y descomposición de PARAFAC de cuatro vías. Hoy en día, el LMR
para la cochinilla se ha fijado en 100 mg kg -1 en mermelada de frutas, jaleas
y mermeladas ( Reglamento de la Comisión (UE) no 1129/2011 ). Hasta donde
los autores saben, esta es la primera vez que el análisis de muestras que contenían
estos dos colorantes alimentarios se realizó con PARAFAC, lo que evita el uso
de procedimientos de limpieza que requieren mucho tiempo. La cantidad de
cochinilla encontrada en la mermelada también se estimó con un método HPLC /
DAD.

2 . material y métodos
2.1 . Productos quimicos

El polvo de cochinilla se obtuvo de Panreac (Barcelona, España). Chromotrope

FB (carmoisina, CAS no. 3567-69-9) (contenido de colorante 50%) se adquirió
de Sigma-Aldrich (Steinheim, Alemania). El decaborato de tetraborato
de sodio (CAS no. 1303-96-4) y el metanol (CAS no. 67-56-7) (grado de
gradiente para cromatografía líquida LiChrosolv®) se obtuvieron de Merck
(Darmstadt, Alemania). El ácido clorhídrico (37%, CAS no. 7647-01-0) fue
suministrado por VWR International (Radnor, Pennsylvania, EE. UU.).
Se utilizó el sistema de purificación de agua Milli-Q® Direct 8 de Millipore
(Bedford, MA, EE. UU.) Para obtener agua desionizada.

2.2 . Soluciones estándar

Una solución madre de cochinilla a 1000 mg L -1 y de carmoisina a 500 mg L -1 se

preparó individualmente en una solución tampón de borato de sodio , ácido
clorhídrico (tampón de borato) a pH 8 ( Perrin y Dempsey, 1974 ). Las
soluciones intermedias se prepararon a partir de las soluciones madre
por dilución en el tampón de borato. Todas las soluciones fueron almacenadas a
baja temperatura (4 ° C) y protegidas de la luz.
Las muestras para el método de adición estándar se prepararon agregando 1 ml
de la muestra de prueba o el extracto final (según el estudio de caso) y el
volumen apropiado de las soluciones de cochinilla y / o carmoisina en matraces
volumétricos de 5 ml y completando al marcar con solución tampón.
2.3 . Procedimiento de preparación de la muestra

Se compró un frasco de mermelada de fresa , cuya etiqueta especificaba que la

cochinilla estaba contenida como colorante alimentario , en un supermercado
local (Burgos, España). Se colocaron 2 g de esta mermelada en un tubo
de polipropileno de 50 ml y se extrajo con 10 ml de la solución tampón. La
mezcla se agitó durante 2 minutos usando un mezclador vorticial . El extracto se
filtró a través de un papel de filtro Whatman ™ cualitativo y el filtrado se recogió
en un matraz volumétrico de 10 ml y se completó hasta la marca. Para realizar el
método de adición estándar, este procedimiento se repitió y los extractos
resultantes se combinaron para eliminar la variabilidad.
Para el estudio de recuperación, cada 2 g de muestra se fortificó antes de la
extracción para contener 187.5 mg kg -1 de cochinilla.

2.4 . Instrumental

Se usó un medidor de pH micropH 2002 Crison (Barcelona, España) para medir

el valor de pH de la solución tampón. También se utilizó un agitador vórtex serie
LBX Instruments V05 (Barcelona, España), con control de velocidad. El papel de
filtro Whatman ™ cualitativo (110 mm de diámetro) se obtuvo de GE Healthcare
(Little Chalfont, Reino Unido). Los filtros de jeringa de polipropileno (13 mm de
diámetro, 0,22 μm de tamaño de poro) utilizados para filtrar las muestras antes
del análisis HPLC / DAD se adquirieron de Membrane Solutions (Kent, WA, EE.
UU.).
Las mediciones de fluorescencia se realizaron a temperatura ambiente en un
espectrómetro de luminiscencia PerkinElmer LS 50B (Waltham, MA, EE.
UU.). Se utilizó un soporte de celda estándar y una celda SUPRASIL® de cuarzo
de 10 mm con un volumen de celda de 3.5 mL por PerkinElmer (Waltham, MA,
EUA).
Se utilizó un sistema HPLC Agilent 1260 Infinity (Agilent Technologies, Santa
Clara, CA, EE. UU.) Que consistía en una bomba cuaternaria (G1311C), un
inyector automático estándar (G1329B), un compartimento de columna
termostatizado (G1316A) y un detector de matriz de diodos (G7117C) También
usado. La columna cromatográfica era un Kinetex EVO C18 (150 mm × 4,6 mm,
diámetro de partícula de 5,0 μm) (Phenomenex, Torrance, CA, EE. UU.).

2.5 . Mediciones de fluorescencia

Las matrices de excitación-emisión correspondientes se registraron en los

siguientes rangos: excitación entre 445 nm y 510 nm (cada 5 nm), mientras que
las longitudes de onda de emisión variaron de 515 nm a 620 nm (cada 1 nm). Los
anchos de rendija del monocromador de excitación y emisión se ajustaron a 10
nm y la velocidad de exploración fue de 1500 nm min -1 .

2.6 . Condiciones de HPLC / DAD

La fase móvil consistió en 60% de metanol y 40% de agua. El volumen de

inyección se ajustó a un volumen de 10 μl. El caudal se ajustó a 1 ml min- 1 y la
temperatura del compartimento de la columna fue de 20 ° C. El tiempo total
de elución fue de 4 minutos, excepto para los extractos en los que se consideró
que 10 minutos mantenían la limpieza del sistema. Los cromatogramas se
fragmentaron alrededor del tiempo de retención de la cochinilla considerando
solo 100 veces de elución ( Sección 4.2.3 ). El detector de matriz de diodos se
programó para medir la absorbancia en un rango entre 350 nm y 600 nm (cada 2
nm) para cada tiempo de elución.

2.7 . Software

El software FL WinLab (PerkinElmer) se usó para registrar las señales

fluorescentes, mientras que el software OpenLab CDS se usó en el HPLC /
DAD. Los datos se importaron a MATLAB (2017) utilizando el software INCA
( Andersson, 2018 ) que elimina las señales de Rayleigh en la matriz en las
longitudes de onda que corresponden a este efecto. Las descomposiciones
de PARAFAC se realizaron con PLS_Toolbox ( Wise et al., 2017 ) para su uso
con MATLAB . Los modelos de regresión fueron ajustados y validados
con STATGRAPHICS Centurion XVI (2010) . El límite de decisión (CCα) y la
capacidad de detección (CCβ) se calcularon utilizando el programa DETARCHI
( Sarabia y Ortiz, 1994 ).
3 . Teoría
3.1 . Descomposición de cuatro vías PARAFAC

El efecto de enfriamiento en la espectroscopía de fluorescencia puede describirse

mediante enfoques multidireccionales ( Leurgans y Ross, 1992 ). Cuando se
considera el nivel de desactivador, se puede construir una matriz X de cuatro
vías con dimensión ( I  ×  J  ×  K  ×  L ) con la intensidad de fluorescencia de la
muestra i -th en la longitud de onda de emisión j -th, longitud de onda de
excitación k - th y l -th nivel de extintor. En este caso, el modelo PARAFAC
cuadrilátero obtenido a través de la descomposición de X es el
siguiente:(1)x(i,j,k,l)=∑f=1Faifbjfckfdlf+εijkl,i=1,...,I,j=1,...,J,k=1,...,K,l=1,...,Ldonde F
es el número de factores; a if , b jf , c kf y d lf son los elementos de las matrices de
carga A ( I  ×  F ), B ( J  × F), C ( K  × F) y D ( L  × F), respectivamente; y e ijkl es
el residuo que el modelo no explica. En este trabajo, los vectores a f = ( a if ), b f =
(b jf ), c f = ( c kf ) y d f = ( d lf ) son los perfiles de muestra, emisión, excitación y
desactivación del f -ésimo fluoróforo, respectivamente.
Si no se tiene en cuenta el nivel de desactivador, se utiliza el modelo trilineal
PARAFAC para una matriz de datos de tres vías con dimensión
( I  ×  J  ×  K ):(2)xijk=∑f=1Faifbjfckf+eijk,i=1,2,…,I;j=1,2,…,J;k=1,2,…,K
Los elementos de los vectores de carga para cada factor en la ecuación. (2) tienen
el mismo significado que en la ecuación. (1) .
Una muestra debe ser considerada como un valor atípico en un perfil de la
descomposición PARAFAC cuando la Q y T de Hotelling 2 estadísticas superan
su valor umbral en un determinado nivel de confianza. En ese caso, el modelo
PARAFAC debe estimarse nuevamente sin esa muestra.
Los datos son cuadrilíneos o trilineales cuando la matriz de datos experimentales
es compatible con la estructura de las ecuaciones. (1) y (2) , respectivamente. En
este caso, las estimaciones de perfil son únicas. El grado de trilinealidad de la
matriz de datos experimentales se puede medir a través del diagnóstico de
consistencia del núcleo (CORCONDIA) ( Bro & Kiers, 2003 ), que debería estar
cerca del 100%. La propiedad de unicidad permite la identificación inequívoca de
analitos por medio de los espectros de excitación y emisión ( Bro, 1997 ). Varios
 reglamentos europeos ( Decisión de la Comisión (CE) no 2002/657 / CE)
permiten la identificación inequívoca de los analitos con un método validado
cuando se proporcionan dos modos independientes para la identificación (por
ejemplo, los perfiles de excitación y emisión obtenidos a través de las matrices de
fluorescencia de emisión-excitación).

4 . Resultados y discusión
4.1 . Espectros de referencia

En las condiciones medidas de este trabajo, no hubo señal de fluorescencia para

la carmoisina debido a un fuerte efecto de enfriamiento como se puede ver en los
paisajes EEM de la figura 1 . Una muestra que contiene 5 mg L −1 de carmoisina
en solución tampón ( Fig. 1 (b)) disminuyó la intensidad de fluorescencia de la
solución tampón ( Fig. 1 (a)), mientras que la solución madre de carmoisina a
500 mg L −1 en solución tampón ( Fig. 1 (c)) no mostró fluorescencia.

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Fig. 1 . Paisajes EEM registrados para: (a) la solución tampón, (b) 5 mg L −1 de
carmoisina en solución tampón y (c) la solución madre de carmoisina (500 mg L −1 )
en solución tampón.
Por otro lado, la Fig. 2 muestra los paisajes EEM de algunas muestras que
contenían una cantidad fija de cochinilla y concentraciones crecientes de
carmoisina. En este caso, la presencia de carmoisina causó la disminución de la
señal de fluorescencia de la cochinilla sin una modificación en la forma de la
 señal. Por lo tanto, se podría concluir que la carmoisina actuó como un inhibidor
fuerte.

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Fig.2 . EEM paisajes de algunas muestras que contenían 20 mg L- 1 de cochinilla en
solución tampón (a) y: (b) 0,5 mg L- 1 de carmoisina; (c) 1 mg L -1 de carmoisina; y
(d) 1.5 mg L -1 de carmoisina.
Los espectros de referencia experimentales para la cochinilla se obtuvieron del
EEM registrado de una muestra de referencia en solución tampón. El espectro de
emisión de referencia para este analito ( Fig. 3 (a)) se tomó a la longitud de onda
de excitación que proporcionó la intensidad de fluorescencia máxima en la región
registrada (475 nm), mientras que el espectro de excitación de referencia ( Fig.
3 (b)) fue obtenido a la longitud de onda de emisión de 558 nm. Estos espectros
de emisión y excitación se utilizaron como referencia para la identificación
inequívoca de la cochinilla en las siguientes etapas de este trabajo. Esta
identificación se realizó a través de la correlación entre los espectros de
referencia y las cargas espectrales estimadas a partir del modelo PARAFAC
correspondiente. Los espectros deLa figura 3 se ha normalizado para compararlos
con las cargas espectrales PARAFAC en cada caso.
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Fig.3 . Espectros de referencia de emisión (a) y excitación (b) normalizados
obtenidos para cochinilla con la muestra de referencia (100 mg L -1 de cochinilla en
solución tampón).

4.2 . Determinación de cochinilla en presencia de carmoisina

Se prepararon cinco estándares para cochinilla (rango de concentración: 0–20 mg
L −1 ) a cuatro niveles diferentes de carmoisina (inhibidor, rango de
concentración: 0–1.5 mg L −1 ) en solución tampón. Los EEM de todas estas 20
muestras se organizaron en una matriz de tres vías X 1 (20 × 106 × 14). La
primera dimensión de esta matriz corresponde al número de muestras, mientras
que la segunda y la tercera corresponden al número de longitudes de onda de
emisión y excitación registradas,
respectivamente. La descomposición de PARAFAC de tres vías de esta matriz
(sin restricciones impuestas, varianza explicada de 99.78%) indicó la existencia
de un factor único correspondiente a la cochinilla. Las cargas de los tres perfiles
de este modelo PARAFAC se incluyen enFig.4 . Cada cinco cargas de la Fig.
4 (a) correspondían a los cinco niveles crecientes de cochinilla para un nivel de
concentración fijo de carmoisina. Como se puede ver en esta figura, las cargas
relacionadas con una misma cantidad de cochinilla disminuyeron cuando la
cantidad de carmoisina contenida en la muestra fue mayor, por lo que los valores
de la pendiente para diferentes niveles de extintor serían diferentes. Este hecho
podría conducir a decisiones falsas en la determinación de la cochinilla de
acuerdo con el LMR establecido en el [ Reglamento (UE) n. ° 1129/2011 de la
Comisión ], por lo que es importante resolver este problema para garantizar la
inocuidad de los alimentos. Por lo tanto, el uso de este modelo PARAFAC de tres
vías no fue adecuado.
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Fig.4 . Cargas del modelo PARAFAC de tres vías con un factor (cochinilla)
obtenido con la matriz de datos X 1 (20 × 106 × 14) para: (a) perfil de muestra, (b)
perfil de emisión y (c) perfil de excitación.
Se propuso la descomposición PARAFAC de cuatro vías para manejar el efecto
de enfriamiento. Entonces, los mismos EEM contenidos antes en la matriz de tres
vías ahora se organizaron en una matriz de cuatro vías X 2 de dimensión 5 × 106
× 14 × 4. En este caso, la primera dimensión corresponde a los niveles de
cochinilla, la segunda y los terceros son los mismos que en la matriz anterior y la
cuarta dimensión corresponde a los niveles de extintor. El modelo PARAFAC,
que se estimó sin restricciones, se necesita sólo un factor (varianza explicada del
99,77%) y no hay datos atípicos se encontraron una vez Q y T de Hotelling 2Se
aplicaron estadísticas. El índice CORCONDIA no se puede calcular en la
descomposición PARAFAC con un solo factor. Los perfiles de muestra, emisión,
excitación y desactivación de este modelo de un factor se muestran en la Fig.
5 (figuras a la izquierda). La cochinilla se identificó inequívocamente ya que los
coeficientes de correlación entre sus espectros de emisión y excitación de
referencia ( Fig. 3 (a) y (b) respectivamente) y los perfiles de emisión y
excitación PARAFAC ( Fig. 5 (b) y (c), respectivamente) fueron 0,97 y 0,95,
respectivamente.
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Fig.5 . Cargas del modelo PARAFAC de cuatro vías con un factor (cochinilla)
obtenido con la matriz de datos X 2 (5 × 106 × 14 × 4, figuras a la izquierda) y con
la matriz de datos X 3 para la determinación de la muestra de prueba ( 6 × 106 × 14
× 5, figuras a la derecha) para: (a) y (e) perfil de muestra, (b) y (f) perfil de emisión,
(c) y (g) perfil de excitación, y (d) y (h) perfil de desactivador.
El perfil de desactivación ( Fig. 5 (d)) fue coherente ya que las cargas de
cochinilla disminuyeron con el aumento de las concentraciones de
carmoisina. Por otro lado, solo se obtuvo un perfil de muestra para cochinilla
para todos los niveles de desactivador debido al uso de un modelo PARAFAC de
cuatro vías (ver Fig. 5 (a)). Por lo tanto, las decisiones falsas de cumplimiento en
la determinación de la cochinilla se evitaron utilizando este modelo.
Se ajustó un modelo de regresión cuadrática "carga de
muestra versus concentración verdadera" y se validó para cochinilla. La segunda
columna de la Tabla 1 recoge los parámetros de esta regresión y de la línea de
precisión correspondiente, es decir, la regresión "concentración
predicha versus concentración verdadera". La media del valor absoluto de los
errores relativos en la calibración fue 1.17% (n = 4). Como se puede ver en esta
tabla, los valores p de la hipótesis prueban la pendiente (b 1 ) y la intersección
(b 0) de la línea de precisión fueron superiores a 0,05, por lo que la intersección y
la pendiente no fueron significativamente diferentes de 0 y 1,
respectivamente. Por lo tanto, el método no tenía un sesgo constante o
proporcional a un nivel de confianza del 95%.
Tabla 1 . Parámetros de los modelos de calibración (“carga de
muestra versus concentración verdadera” (segunda columna) o “carga de
muestra versus concentración agregada” en el resto de los casos) y línea de
precisión para la cochinilla obtenida en las diferentes etapas de este trabajo.

Determinación Determinación en Determinación en Determinación en

utilizando una muestra de mermelada de fresa mermelada de fresa
estándares prueba ( Sección (extracto sin (extracto
( Sección 4.2 ) 4.2.1 ) púas, Sección 4.2.2 ) enriquecido,
( Sección 4.2.2 )
Modelo de y  = 141,94 + y  = 1814.86 + y  = 1180.5 + 419.33 y  = 3042.18 + 370.29
calibración 271,34 × –2,12 x 2 192.46 × –1.82 x 2 × –3.98 x 2 × –3.57 x 2
 Determinación Determinación en Determinación en Determinación en
utilizando una muestra de mermelada de fresa mermelada de fresa
estándares prueba ( Sección (extracto sin (extracto
( Sección 4.2 ) 4.2.1 ) púas, Sección 4.2.2 ) enriquecido,
( Sección 4.2.2 )
Desviación 36,86 21,80 57,53 59,21
estándar
residual, s yx
R 2 (%) 99,98 99,99 99,98 99,97
er¯calibración (%) a 1,17% (n = 4) 0,90% (n = 5) 1,24% (n = 5) 1,21% (n = 5)
Línea de y  = 0.00 + 1.00 x y  = −2.86 · 10 −3  + y  = 4.29 · 10 −3  + y  = −7.14 · 10 −3  +
precisión 1.00 x 1.00 x 1.00 x
valor p b 1 0,98 0,97 0,92 0,96
valor p b 0 1.00 0,98 0,97 0,97
Desviación 0.13 0,14 0,15 0,21
estándar
residual, s yx
CCα ( x 0  = 0) 0,38 0,37 0,41 0,56
(mg L −1 )
CCβ ( x 0  = 0,72 0,70 0,77 1.06
0) b (mg L −1 )

una
er¯ es la media del valor absoluto del error relativo.

si
α = β = 0.05.

Los valores del límite de decisión (CCα) y la capacidad de detección (CCβ) para
la cochinilla fueron 0.38 y 0.72 mg L −1 con las probabilidades de falso positivo
(α) y falso negativo (β) fijadas en 0.05.

4.2.1 . Determinación en una muestra de prueba.

La determinación de la cochinilla en una muestra de prueba se realizó utilizando

el mismo método de adición estándar en 5 niveles diferentes del inhibidor para
que se pueda realizar un análisis de cuatro vías. Los rangos de concentración
fueron 0–25 mg L −1 para cochinilla (6 estándares) y 0–4 mg L −1 para
carmoisina. La muestra de prueba se preparó en el laboratorio a una
concentración conocida de cochinilla y carmoisina en solución tampón, siendo
7.5 mg L -1 y 0.5 mg L -1 la concentración final, respectivamente. Las 30 muestras
utilizadas en el método de adición estándar se prepararon como se explica en
la Sección 2.2 .
Se construyó la matriz de cuatro vías X 3 (6 × 106 × 14 × 5), que contenía los
EEM de estas muestras. Se midieron dos blancos de tampón al principio y al final
de la experimentación para verificar la limpieza de la celda, pero estas muestras
no se incluyeron en la matriz.
Se realizó una descomposición PARAFAC de cuatro vías de la matriz X 3 y los
cuatro perfiles del modelo de un factor obtenido (sin restricciones impuestas y
una varianza explicada del 99,7%) se muestran en la Fig. 5 (figuras a la
derecha). No se detectaron valores atípicos en este modelo. Las cargas fueron
coherentes con el conocimiento experimental como se puede ver en la figura
5 . Los coeficientes de correlación fueron 0,99 para los perfiles de emisión y
excitación ( Fig. 5 (f) y (g), respectivamente) cuando se compararon con los
espectros de referencia de la cochinilla ( Fig. 3 ), por lo que este analito se
identificó inequívocamente.
La Tabla 1 (tercera columna) recoge los parámetros del modelo de calibración
"carga de muestra versus concentración agregada" y de la línea de precisión para
la cochinilla realizada con los datos obtenidos de este método de adición
estándar. En el caso del modelo de calibración, el modelo de regresión cuadrática
correspondiente fue significativo. No hubo sesgo proporcional ni constante de
acuerdo con los valores p de las pruebas de hipótesis para la pendiente y la
intersección (ver Tabla 1 , tercera columna). Como se puede ver en esta tabla, los
valores CCα y CCβ fueron casi los mismos que los obtenidos en la Sección
4.2 anterior .
La concentración de cochinilla en la muestra de prueba se obtuvo en y  = 0
debido al uso del método de adición estándar. El error relativo en esta
determinación fue −16%.

4.2.2 . Determinación en mermelada de fresa

La concentración prevista de cochinilla en la mermelada de fresa se calculó

siguiendo la misma estrategia previa que en la determinación de la muestra de
prueba. Por lo tanto, el mismo método de adición estándar que en la Sección
4.2.1 se realizó en 5 niveles diferentes del desactivador. Además, la mermelada
de fresa fue enriquecida solo con cochinilla al comienzo del procedimiento para
evaluar la recuperación del método. Entonces, el método de adición estándar
también se repitió usando el extracto enriquecido. Por lo tanto, las dos matrices
de cuatro vías construidas fueron X 4 , que contenía los datos del método de
adición estándar realizado con el extracto sin púas, y X 5, que contenía los datos
del extracto enriquecido. La dimensión de ambas matrices fue de 6 × 106 × 14 ×
5. Los extractos correspondientes se obtuvieron siguiendo el procedimiento
de preparación de muestras detallado en la Sección 2.3 , mientras que las
muestras para el método de adición estándar se prepararon como se explica en
la Sección 2.2 . También se midieron algunos espacios en blanco del tampón
durante el análisis como en la Sección 4.2.1 , pero no se incluyeron en esas
matrices. La varianza explicada de los modelos PARAFAC de un factor
obtenidos con X 4 fue 99.28% y 99.44% con X 5(sin restricciones impuestas en
ningún caso). No se detectaron datos atípicos con un nivel de confianza del 95%
y las cargas de los cuatro perfiles fueron coherentes con el conocimiento
experimental en ambos casos. Sin embargo, los modelos no eran coherentes
cuando se consideraba un factor adicional, por lo que no había otro fluoróforo
relacionado con la matriz. Los coeficientes de correlación para los perfiles de
emisión y excitación, con respecto a los espectros de referencia de la cochinilla
( Fig. 3 ), fueron 0.98 y 0.93 para los datos obtenidos del extracto no enriquecido,
y 0.99 y 0.95 para los datos obtenidos del extracto enriquecido, respectivamente.
Los parámetros de los modelos de calibración "carga de
muestra versus concentración agregada" y de la línea de precisión para la
cochinilla obtenida en ambos casos se recogen en las dos últimas columnas de
la Tabla 1 . Como se puede ver en esta tabla, la ausencia de sesgo del
procedimiento analítico se verificó a un nivel de confianza del 95%.
El porcentaje de recuperación fue del 65,47%, mientras que la cantidad de
cochinilla encontrada en la mermelada de fresa fue de 104,63 mg kg -1, que estaba
por encima de su LMR ( Reglamento (UE) no 1129/2011 de la Comisión ). El
intervalo de confianza para esa cantidad de cochinilla encontrada fue (92.25,
116.75) mg kg -1 a un nivel de confianza del 95%.
4.2.3 . Comparación de la determinación de cochinilla en la mermelada con un método de
referencia

La cantidad de cochinilla en la mermelada de fresa también se estimó con un

método HPLC / DAD para comparar los resultados con los obtenidos en
la Sección 4.2.2 . Por lo tanto, se prepararon diez patrones de cochinilla en
solución tampón dentro del rango de concentración de 10–100 mg
L −1 . Además, también se inyectó el mismo extracto no enriquecido y el extracto
enriquecido medido en la Sección 4.2.2 anterior . Sin embargo, no se realizó un
método de adición estándar, y esos extractos no se diluyeron en este caso. Todos
los estándares y los extractos se filtraron a través de un polipropileno.Filtro de
jeringa (13 mm de diámetro, 0,22 µm de tamaño de poro) antes de la inyección
en el sistema cromatográfico. También se midió un blanco de tampón al principio
y al final de la secuencia analítica.
Los cromatogramas obtenidos a partir de estas 14 muestras se fragmentaron
alrededor del tiempo de retención de la cochinilla. Las figs. S1 (a) y (b) en el
Material suplementario muestran los cromatogramas obtenidos en cada longitud
de onda para un estándar que contiene 50 mg L -1 de cochinilla y para el extracto
enriquecido, respectivamente. La primera derivada de cada espectro en
cada tiempo de elución se llevó a cabo utilizando un método Savitzky-Golay con
una ventana de 15 puntos y un polinomio de segundo orden para cada
muestra. Los espectros derivados en cada tiempo de elución de un estándar que
contiene 50 mg L -1 de cochinilla y del extracto enriquecido se pueden ver en
las Figs. S1 (c) y (d) del material complementario, respectivamente. Se construyó
una matriz de tres vías de dimensión 100 × 126 × 14 con las matrices obtenidas
con el procedimiento de preprocesamiento. La primera dimensión corresponde al
número de tiempos de elución considerados (ver Fig. S1 (a) del material
complementario ), la segunda dimensión es el número de longitudes de onda y la
tercera corresponde al número de muestras. La descomposición PARAFAC2
( Bro, Andersson y Kiers, 1999 ) fue necesaria debido a los cambios en el tiempo
de retención en las muestras. Se estimó un modelo PARAFAC2 de dos factores
(CORCONDIA del 100%, varianza explicada del 97,49%, no se encontraron
valores atípicos) después de que se hubiera establecido una restricción de no
negatividad solo en el perfil de la muestra. Los perfiles cromatográficos,
espectrales y de muestra de este modelo se muestran enFig. S2 en el material
suplementario . Como se puede ver en esta figura, la descomposición
PARAFAC2 proporciona un perfil cromatográfico de cada factor para cada
muestra y un perfil espectral único para cada factor que es común a todas las
muestras. Cuando se comparan la Fig. S1 y la Fig. S2 (a) y (b) del Material
Suplementario , está claro que uno de los factores correspondía a la cochinilla,
mientras que el otro estaba relacionado con la matriz junto con la deriva de la
línea de base. Una muestra de referencia que contiene 50 mg L −1de cochinilla se
utilizó para calcular el intervalo de tolerancia permitido para el tiempo de
retención de este analito. El tiempo de retención de la cochinilla obtenida a través
del perfil cromatográfico estuvo dentro de ese intervalo de tolerancia. Además, el
coeficiente de correlación entre el espectro derivado de referencia y el espectro
derivado obtenido a través de las cargas espectrales PARAFAC2 fue de 0,99. Por
lo tanto, la cochinilla se identificó inequívocamente a través de su tiempo de
retención y su espectro.
La línea de calibración “Carga de muestra PARAFAC2 versus concentración
verdadera” para cochinilla fue y  = −2.29 . 10 −1  + 2.64 . 10 −1  × (R 2  = 99.89%,
s yx  = 0.31). Los valores de CCα y CCβ con las probabilidades de falso positivo
(α) y falso negativo (β) fijadas en 0.05 fueron 2.51 y 4.89 mg L −1 ,
respectivamente. En este caso, la cantidad de cochinilla encontrada en la
mermelada de fresa fue de 98.43 mg kg -1 .

5 . Conclusiones
No hubo señal de fluorescencia para la carmoisina debido a un fuerte efecto de
enfriamiento en las condiciones medidas y este colorante alimentario también
causó la disminución de la señal de fluorescencia de la cochinilla, lo que podría
conducir a decisiones falsas de cumplimiento en la determinación de la
cochinilla. Sin embargo, la descomposición de PARAFAC en cuatro
direcciones garantizó la seguridad alimentaria, ya que superó ese problema.
La cochinilla se identificó y cuantificó de manera inequívoca incluso en
presencia de carmoisina como un inhibidor utilizando la estrategia propuesta
basada en la descomposición PARAFAC de cuatro vías y las matrices de
excitación-emisión junto con el uso del método de adición estándar. Además, se
detectó cochinilla en la mermelada de fresa por encima de su LMR (fijado en 100
mg kg -1 ). Los resultados se han comparado con los obtenidos con un método
HPLC / DAD.