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Chapitre

Dénombrement d’une flore


d’un produit microbien
1. Dénombrement après filtration sur membrane 56
COURS

2. Dénombrement en milieu liquide 58 Les objectifs du


3. Dénombrement en milieu solide (masse, surface) 60 programme
4. Dénombrement par observation directe 65 Pour approfondir les méthodes
de dénombrement vues en classe
N°1 Diagnostic d’une infection urinaire 68 de première, l’étude visera les
ACTIVITÉS

caractéristiques essentielles
 énombrement des E. coli dans une préparation
N°2 D des différentes méthodes de
à base de viande 71 dénombrement et les paramètres
N°3 Dénombrement des entérocoques dans une eau 73 qui les différencient.
TECHNIQUE

N°1 La filtration d’un liquide 76


FICHE
Chapitre 3 Dénombrement d'une flore d'un produit microbien

Le terme «  dénombrement d’une flore » signifie que l’aide d’������������������������������������������������


un milieu adapté �������������������������������
à ses �������������������������
exigences nutritives (mi-
l’analyse microbiologique doit permettre de quanti- lieu pouvant en plus être sélectif et discriminatif ). La
fier dans l’échantillon une flore particulière. Le résultat culture peut se faire sur différents types de milieux :
d’une telle analyse quantitative est rendu sous forme -- sur milieu solide (milieu gélosé) :
d’une concentration en micro-organismes (appartenant ·· dénombrement dans la masse (avec ou sans double
à une flore particulière) par unité de masse ou de volume couche),
d’échantillon. ·· dénombrement en surface (boîte de Petri classique ou
Les échantillons peuvent correspondre : boîte contact). Cette technique a été automatisée par
-- à des bioproduits, à de l’eau, pour un dénombrement la société Intersciences qui a développé un ensemen-
de : ceur en surface Spiral® (cf. p. 64),
·· flore test d’hygiène générale (Flore Mésophile Aéro- ·· dénombrement après culture sur un filtre ayant
bie Totale), permis une concentration des micro-organismes
·· flore témoin de contamination fécale (coliformes (échantillons peu concentrés en micro-organismes)
totaux, coliformes thermotolérants, E. coli, Entéro- puis déposé sur un milieu gélosé.
coques, spores de bactéries anaérobies sulfito-réduc- Il existe des supports alternatifs aux supports tradi-
trices,…), tionnels comme le PetrifilmTM ou les lames gélosées ;
·· flore pathogène (Staphylococcus aureus, Pseudomonas -- en milieu liquide (notamment méthode du Nombre le
aeruginosa, Candida albicans, Legionella pneumophilia, Plus Probable-NPP). La méthode traditionnelle avec
Listeria monocytogenes…) ; culture en tubes à essais peut être miniaturisée (culture
-- à des prélèvements issus de l’environnement (air, sol) en microplaques, cf. p. 63).
pour un dénombrement des micro-organismes sapro-
phytes (bactéries, levures, moisissures) ; D’autres méthodes directes ne nécessitent pas de mise
-- à des ferments contenant des micro-organismes utiles, en culture :
permettant la transformation d’une matière première -- estimation de la biomasse ou du nombre de cellules par
en produit alimentaire fini : unité de volume par mesure du trouble d’une culture
·· Saccharomyces cerevisiae (levure de bière) et fabrication (ou d’une suspension) en milieu liquide (opacimétrie,
de la bière à partir d’un moût obtenu principalement turbidimétrie) (cf. p. 57) ;
à partir d’orge germé, -- cytométrie :
·· Streptococcus salivarus subsp. thermophilus, Lactobacillus ·· manuelle  : dénombrement en hématimètre, associé
delbrueckii subsp. bulgaricus et fabrication du yaourt à ou non à une estimation de la viabilité des micro-
partir du lait. organismes,
Il existe de nombreuses méthodes de dénombrement. ·· automatisée : cytométrie de flux (cf. p. 67).

Les méthodes directes Les méthodes indirectes


Certaines nécessitent une culture réalisée dans des Elles associent le résultat de la mesure d’une acti-
conditions d’incubation adaptées aux exigences de la vité biochimique à un nombre de micro-organismes  :
flore dénombrée (temps, température, atmosphère) et à dénombrement par ATP-métrie (cf. p. 57).

1. DÉNOMBREMENT APRÈS FILTRATION SUR MEMBRANE

Dans certains produits liquides (eau, solutés pharmaceu- 1.1.1. Une membrane filtrante
tiques buvables ou injectables...), les micro-organismes La membrane filtrante (document    1   ) a des pores d’un
sont à une concentration très faible (voire nulle si le pro- diamètre de 0,45�  µm���������������������������������
�����������������������������������
dont la disposition selon un ré-
duit est stérile). Leur dénombrement (rendu en UFC seau en trois dimensions permet de retenir à sa surface
par unité de volume) impose donc de «  concentrer les les bactéries. En effet le diamètre des pores du filtre est
micro-organismes » pour pouvoir compter des colonies. inférieur à celui des bactéries classiquement rencontrées.
Cette « concentration » se fait grâce à la filtration d’un Il existe aussi des membranes de porosité de 0,22 µm
grand volume de produit sur une membrane retenant les pour retenir les bactéries les plus petites, des bacilles
micro-organismes. très fins qui pourraient se faufiler dans le maillage de la
membrane de 0,45 µm (cas de Pseudomonas aeruginosa)
1.1. Matériel nécessaire ou encore des spores.
Les différentes étapes d’un dénombrement par une tech-
nique de filtration nécessitent l’utilisation d’un matériel
spécifique.

56
 1  Membrane filtrante et aspect microscopique du réseau tridimensionnel d’une membrane de cellulose

Mesure du trouble et estimation de la biomasse ou du


nombre de cellules par unité de volume
Le trouble d’une suspension microbienne (bactéries, levures) est proportionnel à la biomasse présente
dans la suspension. Cette technique ne distingue pas la biomasse morte de la vivante, mais son intérêt
principal est sa rapidité et sa facilité d’application. La mesure peut se faire à l’aide d’un spectrophoto-
mètre en assimilant l’absorbance mesurée entre 600 et 650 nm à celle du trouble.
Ce principe est également celui de la méthode des étalons de MacFarland (solutions troubles obtenues
traditionnellement par précipitation de sulfate de baryum).
On peut comparer visuellement le trouble d’une suspension microbienne à celui d’un étalon artificiel
pour en estimer sa concentration. En effet, le trouble développé par chaque étalon est assimilable à une
concentration bactérienne selon le tableau de correspondance suivant :

Étalon McFarland Numéro 0,5 1 2 3 4


Chlorure de Baryum à 1 % (mL) 0,05 0,1 0,2 0,3 0,4
Acide sulfurique à 1 % (mL) 9,95 9,9 9,8 9,7 9,6
Concentration cellulaire approximative 1,5 3,0 6,0 9,0 12,0
(x108 UFC.ml-1)
Absorbance à 600 nm 0,132 0,257 0,451 0,582 0,669

L’ATPmétrie
L’ATPmétrie est une technique de dosage instantané de l’ATP (Adénosine triphosphate), molécule de
stockage d’énergie présente dans les organismes vivants.
La technique, basée sur le principe de bioluminescence, est une réaction enzymatique traduisant une
quantité d’ATP dans un échantillon en une quantité de lumière émise et mesurée par un luminomètre
(valeur obtenue en Unité Relative de Lumière (URL) :
luciférase Mg2+
ATP + luciférine + O2 AMP + PPi + oxyluciférine + lumière
On distingue trois sources d’ATP au niveau des prélèvements à analyser :
-- ATP d’origine microbienne, provenant des bactéries, des levures ou des moisissures ;
-- ATP dit « somatique », provenant de cellules d’êtres vivants (lait, sang, muscle, végétaux,…) ;
-- ATP extracellulaire, provenant de débris de micro-organismes ou de cellules somatiques. Cet ATP
est rapidement dégradé dans le milieu extérieur.

Le problème des opérations de nettoyage et de désinfection dans les bio-industries est celui de l’hy-
giène. Le nettoyage et la désinfection sont donc des étapes primordiales de la fabrication. Appliqué
ainsi au nettoyage-désinfection, le dosage de l’ATP sur les surfaces ou les eaux de rinçage permet la
détection de résidus organiques vivants (résidus alimentaires) et de développement microbien :
-- si de l’ATP est détecté sur une surface ou dans un liquide, c’est qu’il y a présence de cellules
vivantes ;
-- dans le cas d’ATP microbien, la présence de micro-organismes représente un risque direct
puisqu’il peut y avoir contamination des produits ;
-- en revanche, si l’ATP est d’origine somatique, c’est qu’il reste des débris organiques sur la
surface ; ceux-ci peuvent servir de support de croissance pour des micro-organismes, ce qui
constitue un risque indirect pour les produits.

57
Chapitre 3 Dénombrement d'une flore d'un produit microbien

1.1.2. Un système de filtration taille des colonies observées après 24 à 48 heures d’incu-
L’unité ou rampe de filtration (document  2  ) comporte bation reste inférieure à celle de colonies qui se dévelop-
un socle grillagé stérilisable sur lequel on dépose dans peraient directement sur le milieu gélosé.
un premier temps la membrane filtrante, puis dans un
second temps un godet (entonnoir) stérilisable dans le- 1.2. Exploitation des résultats
quel on verse le volume de produit à analyser. Le tout
est relié à une pompe à vide qui permet de faire passer Le nombre de colonies suspectes sur la membrane (colo-
rapidement le volume de produit à analyser à travers la nies présentant les caractères biochimiques caractéris-
membrane. Le liquide filtré, débarrassé des bactéries, est tiques de la flore recherchée en fonction du milieu uti-
collecté dans un récipient « poubelle » pour être éliminé. lisé) permet de calculer la concentration bactérienne N
en nombre d’Unité Formant Colonies (UFC) par mL
1.1.3. Des milieux de culture selon la formule :
La membrane est ensuite déposée sur une gélose nutri-
tive adaptée au type de flore recherchée et l’ensemble est N UFC/mL = n
v
mis à incuber (document  3  ). Les milieux utilisés sont
le plus souvent sélectifs  : ils permettent le développe- n nombre d’UFC sur la membrane
ment de la flore recherchée en inhibant (au mieux) les V volume de produit filtré (en mL)
autres flores (dites flores contaminantes). Ils sont aussi
Dans l’analyse microbiologique des eaux, les normes im-
souvent discriminatifs (différentiels) : ils permettent de
posent de filtrer 100 mL d’eau à analyser et le résultat est
mettre en évidence un (des) caractère(s) biochimique(s)
rendu en UFC pour 100 mL. Il n’y a donc pas de calcul
caractéristique(s) de la flore recherchée.
à faire : le résultat correspond directement au nombre de
Les nutriments diffusent au travers de la membrane et
colonies sur la membrane.
les colonies se développent directement à sa surface. La

2. DÉNOMBREMENT EN MILIEU LIQUIDE

2.1. Principe 2.2. Mode opératoire


Si les conditions optimales de croissance sont réunies, La méthode décrite ci-dessous (NF  ISO  7218, mai
un seul micro-organisme présent dans l’inoculum intro- 1996) est techniquement lourde, mais utilisée lorsque
duit dans un milieu liquide se développe en y créant un les bactéries cultivent difficilement en milieu gélosé ou
trouble (et une modification visible du milieu si celui- lorsque le nombre de bactéries présentes dans l’échan-
ci est discriminatif ). La lecture des tubes contenant le tillon est relativement faible (document  4  ) :
milieu liquide et ensemencés avec l’inoculum est donc - volume de l’inoculum : le plus souvent V inoculum = 1 mL
de type binaire : (parfois 10 mL) ;
-- résultat négatif si absence de trouble et de modi- - choix du milieu à ensemencer :
fication du milieu  : il y avait moins de un  micro- . milieu de croissance sans indicateur  : la présence de
organisme présent dans l’inoculum introduit dans le micro-organismes se traduit par un trouble,
milieu liquide ; . milieu sélectif et discriminatif du micro-organisme à
-- résultat positif si présence de trouble (et de modifica- quantifier : sa présence se manifeste par un trouble et
tion du milieu si celui-ci est discriminant) : il y avait le virage d’un indicateur de pH par exemple ;
au moins un micro-organisme présent dans l’inoculum - choix des dilutions à tester : dépend de la population
introduit dans le milieu liquide. estimée, le but étant d’obtenir, pour une analyse statis-
Le résultat sera positif, que l’inoculum introduit dans tique optimale des résultats :
le tube de milieu liquide contienne 1, 10, 100, 1 000… . une dilution contenant moins d’un micro-organisme
micro-organismes. dans l’inoculum utilisé,
La méthode repose sur la répartition aléatoire des micro- . une dilution contenant plus d’un  micro-organisme
organismes dans le prélèvement (méthode statistique dans l’inoculum utilisé ;
reposant sur l’utilisation de la loi de Poisson). On ense- - choix du nombre d’essais par dilution (dépend de la
mence donc une série de tubes avec un volume donné du précision souhaitée pour les résultats en fonction de
produit à analyser ou ses dilutions, à raison de 1, 2, 3, 5 leur analyse statistique) :
voire même 10 tubes par dilution testée. . en général trois tubes sont ensemencés par dilution,
Connaissant le nombre de résultats positifs obtenus dans . un ou deux  tubes sont ensemencés si une précision
la série de tubes, on peut déterminer la concentration en moins importante est suffisante,
micro-organismes présents dans une unité de volume ou . cinq ou même dix����������������������������������
 ���������������������������������
tubes sont ensemencés si une pré-
de masse du produit analysé. cision plus importante est demandée.

58
 2  Unité et rampe de filtration pour analyse microbiologique

Couvercle de l’entonnoir

Entonnoir de 250 ml

Joint torique en sillicone


(à l’intérieur)
Membrane filtrante
Grille support du filtre
godets

Branchement du tuyau

valve
Flacon récepteur «poubelle»

rampe de filtration
poubelle pompe à vide

 3  Exemples de milieux utilisés dans les techniques de filtration sur membrane

Gélose lactosée au TTC et Tergitol 7


Ce milieu est utilisé pour le dénombrement des coliformes qui sont des bacilles Gram négatif de la
famille des Entérobactéries, capables de dégrader le lactose. Ils sont recherchés comme témoin
de contamination fécale récente.
Le Tergitol 7 inhibe la croissance des micro-organismes à Gram positif, limite l’envahissement
par les Proteus et favorise la récupération des coliformes. Ceux-ci présentent des colonies de
coloration jaune ou orangée, à l’intérieur d’un halo jaune visible sous la membrane. Ce halo est
provoqué par l’acidification liée à la dégradation du lactose en présence de l’indicateur coloré de
pH, le bleu de bromothymol (teinte jaune à pH acide).
Les autres micro-organismes présentent des colonies dont la coloration rouge à marron est due à
la réduction du TTC en formazan insoluble.
Sont considérées comme caractéristiques toutes les colonies « lactose-positif », quelle que soit
leur taille, si le milieu sous la membrane présente une coloration jaune.

Gélose de Slanetz et Bartley


Ce milieu est utilisé pour le dénombrement des entérocoques. Les entérocoques sont des coques
Gram positif recherchés comme témoin de contamination fécale plutôt ancienne.
L’azide de sodium permet d’inhiber la croissance de la majorité des micro-organismes utilisant
une chaine respiratoire aérobie.
Le TTC est un indicateur de la croissance bactérienne. Il est réduit en formazan insoluble à l’inté-
rieur de la cellule. Cette réaction se manifeste par l’apparition de colonies de couleur rouge à
marron. Les entérocoques ont un fort potentiel réducteur et leurs colonies présentent donc cette
coloration.

 4  Organigramme d’un dénombrement en milieu liquide

59
Chapitre 3 Dénombrement d'une flore d'un produit microbien

2.3. Exploitation des résultats Exemple  : cinq  dilutions ont été ensemencées à raison
de trois  essais par dilution  ; trois  combinaisons (de
2.3.1. Dénombrement à un seul essai trois��������������������������������������������������
  chiffres)
�������������������������������������������������
sont possibles avec les résultats obte-
Ce dénombrement s’effectue sans recourir aux tables nus (tableau    5   ). Parmi les trois combinaisons de trois
de Mac Grady. On ensemence 1 tube par dilution avec chiffres possibles (332 ; 321 ; 210), laquelle choisir ? Le
1 mL d’inoculum. nombre le plus élevé et inférieur à 330 est sélectionné ;
Exemple de résultats : dans cet exemple, il s’agit de 321. Si les dilutions sont
Dilution 100 10-1 10-2 10-3 10-4 insuffisantes, on peut être amené à utiliser des nombres
caractéristiques comme 333, 332 ou 331.
Résultats + + + - -
-- il y a au moins un  micro-organisme dans l’inoculum Lecture du NPP (Nombre le Plus Probable)
(1 mL) de la plus grande dilution (10-2) présentant en- dans la table statistique de Mac Grady
core un trouble : la concentration est donc d’au moins On reporte le nombre caractéristique de la série dans une
102 micro-organismes par mL de produit ou de « sus- table statistique de Mac Grady.
pension mère » non dilués ; On y lit le Nombre le Plus Probable (NPP) de micro-
-- il y a moins de un micro-organisme dans l’inoculum organismes présents dans l’inoculum de la dilution cor-
(1  mL) de la première dilution (10-3) ne présentant respondant au chiffre des centaines du nombre caracté-
plus de trouble : la concentration est donc strictement ristique.
inférieure à 103 micro-organismes par mL de produit Exemple : 321 correspond au NPP de 15. Cela signifie
ou de « suspension mère » non dilués. qu’il y a statistiquement quinze������������������������
  �����������������������
bactéries dans l’inocu-
On peut exprimer le résultat selon l’intervalle : lum de la dilution 10-(n+1). D’après les limites de confiance
102 ≤ Nmicro-organismes/mL < 103 données par certaines tables, cette valeur numérique de
La concentration du produit analysé est comprise entre 15 est en fait considérée comme comprise entre 3 et 38
102 et 103 micro-organismes dans 1 mL. avec une probabilité de 95�������������������������������
 %, entre
���������������������������
2 et 52 avec une pro-
babilité de 99 %.
2.3.2. Dénombrement à essais multiples
Ce dénombrement s’effectue en utilisant les tables de Expression du résultat
Mac Grady (document  6  ).
Mise en place du nombre caractéristique
Le nombre caractéristique de la série réalisée est une nombre de micro-organismes par mL de produit
combinaison de trois chiffres : N
NPP x k analysé ou de « suspension mère »
-- chaque chiffre correspond au nombre de tubes « posi-
NPP nombre lu dans la table
tifs » pour une dilution donnée ;
-- les trois chiffres correspondent à trois dilutions suc- facteur de la dilution correspondant au chiffre des cen-
k
cessives ; taines du nombre caractéristique (combinaison retenue)
-- le chiffre des centaines correspond à la plus faible dilu- V volume de l’inoculum (1 mL en général)
tion (donc à la plus forte concentration en micro-orga-
Si le produit analysé est solide, on prépare une ���������
« �������
suspen-
nismes), celui des dizaines à la dilution intermédiaire
sion  mère » de produit en introduisant « �������������
���������������
x������������
 » ���������
g de pro-
et celui des unités à la plus grande dilution.
duit dans « 9 x » mL de diluant. Cela correspond à une
Parmi les différentes combinaisons, on choisit celle cor-
dilution au 1/10e du produit. Le nombre de micro-orga-
respondant au nombre le plus grand et, si possible, infé-
nismes par g de produit analysé est donc N x 10.
rieur à 330 (correspond à une meilleure répartition des
micro-organismes dans les dilutions).

3. DÉNOMBREMENT EN MILIEU SOLIDE (MASSE, SURFACE)


Le principe de ces méthodes s’appuie sur le fait qu’un groupés peut conduire à une unique colonie.
micro-organisme présent dans un produit ou dans une Ces techniques ayant déjà été décrites dans l’ouvrage de
suspension de ce produit, mis en culture dans des condi- Première1, voici les principales informations à retenir
tions optimales, en milieu solide convenable, s’y déve- (document  7  ).
loppe en formant une colonie. • Dilution préalable : le plus souvent, le nombre d’UFC
Il s’agit de faire correspondre un micro-organisme à une par unité de masse ou de volume du bioproduit à ana-
UFC (Unité Formant Colonie) puisque, dans certains lyser est important  ; une étape préalable de dilution
cas, le développement de plusieurs micro-organismes (série de dilutions de raison 1/10e) est nécessaire.

1. Biotechnologies 1re STL, SCEREN, 2012

60
 5  Mise en place du nombre caractéristique

Résultats (trois essais par dilution)

10-n 10-(n+1) 10-(n+2) 10-(n+3) 10-(n+4)


Dilutions et aspect des tubes
après incubation (lecture d’un
trouble associé à la production
de gaz collecté dans une
cloche).

Résultats + + + + + + + + - + - - - - -
Nombre de tubes + 3 3 2 1 0
Combinaison possible 3 3 2
Combinaison possible 3 2 1
Combinaison possible 2 1 0

 6  Tables de Mac Grady

Deux tubes par dilution Trois tubes par dilution


Nombre NPP Nombre NPP Nombre NPP Nombre NPP
caractéristique caractéristique caractéristique caractéristique
000 0,0 000 0,0 201 1,4 302 6,5
001 0,5 001 0,3 202 2,0 310 4,5
010 0,5 010 0,3 210 1,5 311 7,5
011 0,9 011 0,6 211 2,0 312 11,5
020 0,9 020 0,6 212 3,0 313 16,0
100 0,6 100 0,4 220 2,0 320 9,5
101 1,2 101 0,7 221 3,0 321 15,0
110 1,3 102 1,1 222 3,5 322 20,0
111 2,0 110 0,7 223 4,0 323 30,0
120 2,0 111 1,1 230 3,0 330 25,0
121 3,0 120 1,1 231 3,5 331 45,0
200 2,5 121 1,5 232 4,0 332 110,0
201 5,0 130 1,6 300 2,5 333 140,0
210 6,0 200 0,9 301 4,0
211 13,0
212 20,0
220 25,0
221 70,0
222 110,0

61
Chapitre 3 Dénombrement d'une flore d'un produit microbien

• Inoculation du milieu gélosé :


-- dans la masse  : V inoculum = 1  mL. Cet inoculum est
introduit dans une boîte de Petri vide et stérile, re-
couvert du milieu gélosé en surfusion que l’on laisse
durcir après parfaite homogénéisation. On peut en-
suite recouvrir le milieu d’une couche de milieu sté-
rile (double couche) pour limiter l’envahissement des
colonies en surface et avoir des colonies présentant
toutes le même aspect ;
-- en surface : Vinoculum = 0,1 mL, à étaler à la surface d’un
milieu gélosé préalablement coulé en boite de Petri.
• I�����������������������������������������������������
ncubation à la température adaptée à la flore recher-
chée pendant 18 à 72 heures.
• Dénombrement des colonies :
-- en surface : elles ont un aspect macroscopique clas-
sique et caractéristique ;
-- en profondeur : elles ont un aspect lenticulaire.
• Exploitation des résultats
Elle peut être effectuée selon la norme ISO 7218
(manipulation réalisée en ensemençant deux boites
par dilution) : voir Biotechnologies 1re STL, pp. 69-70.
Elle peut être effectuée selon la norme ISO 7218
modifiée en octobre 2007, qui officialise l’utilisation
d’une seule boite par dilution :
- choix des essais  : choisir deux dilutions successives
dont :
. l’une au moins présente un minimum de dix colonies,
. le « nombre maximal de colonies en totalité est de
trois cents par boite  ». En présence d’un agent de
différenciation, le «  nombre maximal de colonies
caractéristiques ou présumées est de cent cinquante
par boite »,
. pour les levures et les moisissures, on retient pour le
calcul les dilutions présentant entre dix et cent cin-
quante colonies par boite ;
- calcul de la concentration bactérienne N en UFC par
mL ou par g de produit :

Arrondir le résultat calculé à deux chiffres significatifs


et l’exprimer en nombre compris entre 1,0 et 9,9.10n
UFC par mL ou par g.

62
Dénombrement en microméthode des entérocoques
Pour l’analyse des eaux, il existe des microplaques de 96 puits permettant de dénombrer les Enterococcus selon le principe du NPP
(d’autres microplaques permettent de dénombrer E. coli). La microplaque MUD/SF permet de réaliser le dénombrement des entéro-
coques dans les eaux, suivant la méthode NF EN ISO 7899-1-
Les entérocoques (E. faecium, E. faecalis, E. durans, E. hirae), représentant 70 à 100 % des « streptocoques fécaux », sont de bons
indicateurs de contamination fécale ancienne.
Le principe de ce dénombrement repose sur la mise en évidence des entérocoques par la détection d’une de leur enzyme spécifique, la
β-glucosidase, dont le substrat (4-méthylumbelliféryl-β-D-glucopyranoside ou MUD) est déshydraté dans les cupules de la microplaque.
En présence de l’enzyme le substrat libère un composé fluorescent révélé dans l’UV. Le milieu de culture est déshydraté et fixé au fond
des puits de la microplaque.
La réhydratation du milieu se réalise lorsque l’eau à analyser est introduite dans les puits. Les entérocoques (éventuellement présents
dans l’inoculum) hydrolysent le MUD en 4-méthylumbelliférone et en glucose. La production de 4-méthylumbelliférone, composé à fluores-
cence bleue, est observée à l’aide d’une lampe UV proche du visible, à 366 nm.
De plus, la composition du milieu, à teneur élevée en peptone et en galactose, permet une excellente récupération des entérocoques.
Le milieu contient aussi de l’acide nalidixique et de l’acétate de thallium qui assurent l’inhibition de la presque totalité de la microflore
contaminante. L’incubation à 44 °C permet aussi d’inhiber la croissance de la majorité des micro-organismes de la microflore secon-
daire. Ainsi, toutes ces conditions sélectives de culture ne permettent que la croissance des entérocoques.
Une analyse statistique fondée sur la loi de Poisson permet, une fois la lecture faite, de dénombrer les entérocoques présents dans
l’échantillon en fonction du nombre de puits fluorescents obtenus par dilution testée.

Exemple de résultats pour une eau de surface.

On ensemence 24 puits (3 colonnes de 8 puits)


avec 200 µL de chaque dilution :
-- dilution au 1/2 de l’eau à analyser ; on
obtient 10 puits positifs sur les 24 ense-
mencés ;
-- dilution au 1/20e, on obtient 3 puits
positifs sur 2 ;
-- dilution au 1/200e, on obtient 1 puits
positif sur 24 ;
-- dilution au 1/2 000e, on obtient 0 puits
positif sur 24.
Le nombre caractéristique de la série est de
3/24, 1/24 et 0/24 soit 3/1/0 (si possible ce
nombre doit se terminer par 0).
On reporte ce nombre caractéristique dans une
table statistique et on obtient le NPP puis on
calcule la concentration en entérocoques de
l’eau analysée.

Dilution Dilution Dilution Dilution


1/2 1/20e 1/200e 1/2000e

         7      Dénombrement en milieu solide (masse, surface) (ISO 7218 modifiée)

1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL

Échantillon à
analyser

Dilutions de
raison 1/10 1/10 1/100 1/1000 1/10 000 1/100 000
réalisées dans
des tubes
contenant 9 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL
de diluant stérile

Culture

Dilutions non exploitables : nombre de colonies supérieur à 300 Dilutions exploitables :


deux dilutions successives
dont une contient entre 10
et 300 UFC.

63
Chapitre 3 Dénombrement d'une flore d'un produit microbien

Dénombrement grâce à un ensemenceur Spiral ®


La méthode d’ensemencement Spiral ® permet l’ensemencement automatique et
standardisé à partir d’un échantillon contenant de 30 à 10.106 UFC/mL, sur une
seule boîte de Petri et sans dilution préalable, selon la norme AFNOR V08-100.
Un volume fixe de l’échantillon (50, 100 ou 200 µL) est ensemencé en suivant la
forme d’une spirale d’Archimède décroissante (du centre vers la périphérie). Le
volume est donc calibré et connu en tout point de la boîte.

Après incubation, la lecture s’effectue en


rapportant le nombre de colonies au volume
déposé sur un secteur donné. Seuls servent au
dénombrement les secteurs où les colonies sont
correctement espacées.
Le comptage est réalisé manuellement à l’aide
de la grille qui divise la boîte en secteurs cor-
respondant à un volume précis d’échantillon
Aspect de la spirale mise en évidence La densité des colonies est décrois- déposé.
par un colorant bleu sante du centre vers la périphérie

Paires de secteurs µL déposés


opposés (volume cumulé)
1 1,00
Exemple : ensemence- 2 2,58
ment en mode spiral de
50 µL d’échantillon sur 3 5,07
une boite de Petri de
90 mm de diamètre 4 9,00

5 15,21

6 25,00

Boîte entière 50,00

Dans un quadrant choisi (A ou B) on dénombre les colonies de la périphérie vers le centre et sur un nombre de secteurs suffisants pour
compter au moins 20 colonies. On répète ce comptage sur le même nombre de secteurs dans le quadrant opposé.
On calcule ensuite la concentration en micro-organismes de l’échantillon :
-- en additionnant les deux comptages ;
-- en ramenant ce nombre d’UFC au volume déposé dans les secteurs dénombrés ;
-- en prenant en considération une dilution préalable du produit analysé.
--

1 1
2 2
3 3
4 4
5 5
6 6

B A B A
6
5
6

4
5

3
4

2
3

1
2
1

A B A B
1
1

2
2

3
3

4
4

5
5

6
6

6 6
5 5
4 4
3 3
2 2
1 1

21 colonies comptées sur les secteurs 1 à 4 du 15 colonies sur le nombre de secteurs équiva-
quadrant B en haut à gauche. lent dans le quadrant B en bas à droite.
Dans notre exemple, le volume correspondant aux secteurs 1 à 4 des deux quadrants B opposés est de 9 µL (mode spiral exponentiel
de 50 µL) et le produit à analyser a été préalablement dilué au 1/10e avant ensemencement.
nombre total de colonies x k = (21+15) x 10
C= = 4,00.104 UFC.mL-1
Vsecteur 900.10-3

64
4. DÉNOMBREMENT PAR
OBSERVATION DIRECTE
 8  Un hématimètre de Malassez
La numération cellulaire peut être réalisée par comptage
au microscope, à l’aide d’une lame de comptage spéciale
ou cellule de numération ou hématimètre. Cette tech-
nique ayant déjà été décrite dans l’ouvrage de Première2,
voici les principales informations à retenir.
• Lorsque la suspension cellulaire est trop concentrée,
il est nécessaire de réaliser une dilution préalable de
façon à permettre le comptage des cellules au micros-
cope.
• Le comptage se fait grâce à un hématimètre, épaisse
lame en verre dont le plateau central comporte un qua-
drillage spécifique gravé (document  8  ).
• Le volume de comptage est déterminé par :
-- la surface du quadrillage gravé sur la lame ;
-- la profondeur de la chambre : hauteur entre le plan-
cher de la plate-forme centrale et la face inférieure de
la lamelle optiquement plane.  9  Quadrillage d'un hématimètre de Malassez
• Remplissage de l’hématimètre :
-- faire adhérer parfaitement la lamelle optiquement
plane aux plateaux latéraux ;
-- remplir complètement la chambre de comptage avec
la suspension cellulaire préalablement homogénéisée.
Le remplissage doit être fait en une seule fois, sans
bulles d’air et sans faire déborder le liquide dans les
rigoles. L’hématimètre doit toujours rester « à plat »
pour éviter une mauvaise répartition des cellules sur
le quadrillage ;
-- laisser sédimenter les cellules sur le quadrillage
quelques minutes.
• Numération au microscope (objectif X 40 en général) :
-- vérifier l’homogénéité de la répartition des cellules à
compter (si la répartition est mauvaise, recommencer) ;
-- compter les cellules contenues sur une surface donnée
donc un volume donné ; le nombre de cellules comp-
tées doit être compris entre 200 et 500 cellules pour
être statistiquement correct.
• Prévoir une décontamination et un rinçage de l’héma-
timètre après comptage.
• Calcul de la concentration cellulaire :
n×k
N=
V
n nombre de cellules comptées
V volume de comptage (L ou mL)
k facteur de dilution
N nombre de cellules par litre (ou
mL)

L’hématimètre de Malassez possède un quadrillage


spécifique de 2,5 mm de longueur, 2 mm de largeur et
une hauteur sous lamelle de 0,2 mm (document  9  ). Le
volume correspondant au quadrillage total est égal à 1
mm3. Ce quadrillage comporte 100 rectangles ; chaque
rectangle correspond à un volume de 0,01 mm3.

2. Biotechnologies 1re STL, SCEREN, 2012

65
Chapitre 3 Dénombrement d'une flore d'un produit microbien

Comptage cellulaire et viabilité cellulaire des micro-organismes



eucayotes (levures)
L’industrie agro-alimentaire utilise de nombreuses levures sélectionnées, conditionnées sous forme de levain (ou de ferment). Ces levures,
ajoutées à une matière première, assurent des étapes de la transformation de cette matière première en produit fini.
L’inoculation de la matière première doit se faire avec un nombre connu de micro-organismes (on veut y obtenir une concentration
initiale optimale) et ceux-ci doivent être vivants, pour être capables d’exprimer leurs activités enzymatiques et de se multiplier pendant le
processus de transformation.
La viabilité cellulaire des levures peut être analysée lors du comptage en hématimètre grâce à l’utilisation de colorants qui, en fonction
de leurs caractéristiques, pénètrent soit dans les cellules vivantes soit dans les cellules mortes. La proportion relative des cellules colorées
ou non est un reflet exact du nombre de cellules vivantes ou mortes et donc de la viabilité de l’ensemble de la population cellulaire.
On peut alors calculer le % de viabilité d’une suspension cellulaire :

Il existe deux types de colorants utilisables lors d’une recherche de viabilité réalisée en hématimètre.
• Les colorants vitaux ou d’inclusion, qui colorent les cellules vivantes. Un colorant vital est une substance qui met en évidence une
structure cellulaire sans provoquer la mort immédiate de la cellule. Pour cela, il faut que le colorant soit utilisé à concentration
relativement faible et qu’un élément cellulaire soit capable de l’accumuler. Le rouge neutre, par exemple, est un colorant cationique
qui diffuse rapidement à travers la membrane plasmique et se concentre dans les vacuoles (cellules végétales) et les lysosomes. Sa
concentration intracellulaire peut être 100 à 1 000 fois plus importante que la concentration extracellulaire. Les cellules vivantes
sont donc rouges et les cellules mortes sont incolores.
• Les colorants supravitaux ou d’exclusion, qui colorent les cellules mortes. Il existe deux explications concernant la coloration diffé-
rentielle des cellules mortes et vivantes à l’aide de ce type de colorant :
–– ces colorants ne se fixent que sur les cellules mortes car la membrane plasmique des cellules vivantes leur est imperméable.
Toute perturbation de l’intégrité membranaire provoquera une modification de la pénétration de ces colorants. Les cellules
vivantes n’incorporent pas ces colorants au contraire des cellules mortes (non viables) qui les incorporent et qui apparaissent
alors colorées ;
–– ces colorants ont tendance à entrer dans les cellules qu’ils rencontrent. Une fois dans la cellule, le colorant entraîne un méca-
nisme d’exclusion qui va éjecter cette molécule dans le milieu extérieur. Ce mécanisme nécessitant de l’énergie, seules les cel-
lules possédant une source d’ATP peuvent le mettre en place. Ainsi, une cellule vivante expulsera la molécule et restera blanche
au microscope, au contraire une cellule morte n’aura pas les moyens de la rejeter et deviendra colorée.

Exemples de colorants d’exclusion : le bleu trypan (cancérigène), l’érythrosine B, le bleu de Funk, des colorants fluorescents comme
l’iodure de propidium ou le bromure d’éthidium. Avec le bleu trypan ou le bleu de Funk, les cellules vivantes sont incolores et les cellules
mortes sont donc bleues.

Observation de Saccharomyces cerevisiae coloré au bleu de


Funk (cellules vivantes blanches, cellules mortes bleues)

66
Le cytomètre de flux Bactiflow ALS ®
But recherché : passage d’une méthode traditionnelle lente à une méthode alternative rapide (24 h) pour réduire le temps de stockage
du produit fini en industrie agro-alimentaire (mise plus rapide sur le marché de produit à DLC courte, augmentation de la production en
flux tendu).

La technique est basée sur :


–– le marquage fluorescent des organismes viables présents
Flux liquidien contenant les bactéries vivantes
dans le produit ;
(fluorescentes) ou mortes (non fluorescentes)
–– la cytométrie en flux, adaptée à la microbiologie indus-
trielle. L’échantillon à analyser est envoyé dans une veine
liquide. Un rayon laser permet d’activer la fluorescence des
bactéries vivantes. Un système optique permet de détecter
et de mesurer l’émission de fluorescence.

Un signal fluorescent détecté est dû à la présence d’une


bactérie vivante. La comptabilisation des signaux détectés pour
un volume d’échantillon donné permet de connaître le nombre
de bactéries vivantes par unité de masse ou de volume de Rayon laser activant la
fluorescence Système optique
l’échantillon à analyser.
détectant
La méthode alternative doit donner des résultats équivalents à
l’émission de
la méthode de référence.
fluorescence
Dans le cadre d’un test qualitatif, la validation de la méthode
alternative consiste à réaliser le test de présence/absence com-
parativement avec la méthode traditionnelle, avec des charges
en micro-organismes de plus en plus faibles et en dessous de
1 UFC.g-1 et une pré-incubation en bouillon de 24 heures.
L’ensemble des résultats obtenus permet de valider (pour
chaque souche testée) que la limite de détection de la méthode
alternative est inférieure à1 UFC/g, ce qui permet de la valider
pour un test qualitatif en présence /absence dans 1 g et garan-
tir l’absence des germes spécifiés.

67
Chapitre 3 Dénombrement d'une flore d'un produit microbien

ACTIVITÉ 1
DIAGNOSTIC D’UNE INFECTION URINAIRE

PRÉSENTATION 1.2. Les colonies observées sont-elles lactose + ou - ?


Le diagnostic et le traitement des infections des voies 1.3.  La bactérie responsable de l’infection urinaire
urinaires reposent sur le dénombrement des bactéries est-elle probablement Gram + ou Gram - ?
(bactériurie), leur identification et la détermination 1.4. À l’aide de l’annexe    1   , proposer, en les justifiant,
de leur sensibilité à différents antibiotiques (antibio- les tests nécessaires pour réaliser une orientation
gramme). de famille ou de genre ?
Au cours des dernières années de nombreuses techniques 2. Le technicien a ensemencé une galerie API 20E à
simplifiées ont été développées pour le comptage l’aide des colonies obtenues après repiquage. Le docu-
des bactéries urinaires, comme les cultures sur lames ment    4    montre le résultat obtenu après culture et
gélosées de type «  Uricult  ». L’ensemencement se fait révélation des tests dans les différentes cupules. On a
immédiatement après la miction (au maximum après identifié ainsi E. coli comme bactérie responsable de
20 min pour éviter tout développement des bactéries) en cette infection urinaire.
plongeant directement la lame gélosée dans l’urine. La À l’aide de l’annexe    2   , répondre aux questions
lame gélosée introduite dans un flacon est mise à incuber suivantes :
18 à 24 h à 37 °C. 2.1. Pourquoi certaines cupules ont-elles leur titre
En général les lames ont deux faces gélosées différentes souligné ? Encadré ?
(document    1   ) : 2.2. Q uel réactif a été ajouté à la cupule IND  ? Ce
-- une face avec le milieu CLED (Cystine, Lactose, Elec- réactif révèle la présence d’indole, produit par
trolyte Déficient, cette dernière caractéristique évite l’action d’une tryptophanase sur le tryptophane.
l’envahissement par certaines bactéries très mobiles En déduire :
comme Proteus), milieu non sélectif permettant de -- la composition minimale du milieu présent dans
mettre en évidence le caractère lactose + grâce à la pré- la cupule ;
sence de lactose et de BBT (jaune à pH < 6 ; vert entre pH -- le nom de l’enzyme présente chez la bactérie en
6 et 7,6 ; bleu au-delà) ; cas de réaction positive.
-- une face avec un milieu sélectif pour les bactéries Gram -, 2.3. Le perchlorure de fer ajouté à la cupule TDA met
le milieu de Mac Conkey qui permet lui aussi de mettre en évidence la présence d’acide indolpyruvique
en évidence le caractère lactose + grâce à la présence de produit par l’action d’une tryptophane désaminase
lactose et de rouge neutre (rouge à pH < 6,8 ; orange entre sur le tryptophane. Écrire la réaction catalysée par
pH 6,8 et 8 ; jaune-orangé au-delà). la TDA.
2.4. Donner le résultat + ou - pour les cupules suivantes
Après incubation, on estime le nombre des bactéries MAN et SAC. Le mannitol et le saccharose sont
(en UFC.mL-1) en comparant la croissance sur la lame des glucides dont l’utilisation est visualisée grâce
gélosée à la tabelle du fournisseur (document    2   ). à la présence de BBT dans le milieu déshydraté.
Critères diagnostiques dans l’urine : 2.5. Faire un logigramme permettant d’expliquer les
-- UFC ≥ 105/mL  :������������������������������������
bactériurie significative. Une ana- différents résultats possibles du test de la réduction
lyse bactériologique (culture, identification et antibio- des nitrates en nitrites, puis éventuellement des
gramme) est indiquée ; nitrites en azote.
-- UFC compris entre 104 et 105/mL : valeur limite. S’il 2.6. L’identification proposée est-elle en adéquation
s’agit d’une culture pure (un seul type de colonie), une avec l’aspect des colonies obtenues sur les deux
analyse bactériologique (culture, identification et anti- faces de la lame immergée ?
biogramme) est également indiquée. S’il s’agit d’une 3. Le traitement de cette infection urinaire nécessite
culture mixte (plusieurs colonies d’aspect différent), une antibiothérapie. Le technicien entreprend donc
répéter l’analyse ; la réalisation d’un antibiogramme dont le résultat est
-- UFC < 104/mL : bactériurie non significative. fourni par le document    5   . Répondre aux questions
suivantes à l’aide des fiches techniques de la partie 2
QUESTIONS de cet ouvrage (Réalisation d’un antibiogramme et
1. Le document    3    présente le résultat obtenu avec la Lecture d’un antibiogramme :
lame immergée d’un patient : 3.1. Faire un organigramme des différentes étapes de
1.1. Conclure sur la bactériurie d’après la densité des la réalisation d’un antibiogramme.
colonies obtenues sur la face CLED. 3.2. Donner le nom du milieu utilisé.

68
3.3. Indiquer, en le justifiant, le nom donné à la
concentration en antibiotique obtenue dans la gélose Lame gélosée
   1    
à la limite entre croissance et absence de croissance.
3.4. Pourquoi le technicien mesure-t-il les diamètres
d’inhibition de la croissance autour des disques
d’antibiotique ?
3.5. Construire l’abaque de lecture pour la ticarcilline
(TIC), puis :
-- estimer la CMI de la ticarcilline pour la souche
E. coli ;
-- dire si le médecin peut prescrire la ticarcilline
pour soigner cette infection urinaire.

Données  2  Comptage des bactéries sur lame gélosée :


Diamètre d’inhibition mesuré pour la ticarcilline : 26 mm. tabelle du fournisseur
Diamètre correspondant à la concentration critique infé-
rieure : 22 mm.
Diamètre correspondant à la concentration critique supé-
rieure : 18 mm.
Concentration critique supérieure (concentration plasma-
tique maximale) : 64 mg.L-1.
Concentration critique inférieure (concentration plasma-
tique minimale) : 16 mg.L-1.

   4    Résultat galerie API 20E

   3    Bactériurie sur lame gélosée

Face CLED

Face Mac Conkey


   5    Résultat de l'antibiogramme

ANNEXE 1 
Principales espèces bactériennes retrouvées dans les infections urinaires 
• Bacilles Gram - de la famille des entérobactéries (oxydase -) : Escherichia coli (lactose +), Proteus mirabilis (lactose -),
Klebsiella spp. (lactose +).
• Bacilles Gram -, oxydase + : Pseudomonas spp.(lactose -).
• Coques Gram +  : entérocoques (catalase -) et Staphylococcus saprophyticus (catalase +).

69
Chapitre 3 Dénombrement d'une flore d'un produit microbien

ANNEXE 2
Extrait de la notice de la galerie API 20E
1. Principe
La galerie API 20E comporte vingt microtubes microcupule
contenant des substrats déshydratés. Les microtubes
sont inoculés avec une suspension bactérienne qui
reconstitue les tests. Les réactions produites pendant
la période d’incubation se traduisent par des virages
colorés spontanés ou révélés par l’addition de réactifs.
La lecture de ces réactions se fait à l’aide du tableau
de lecture et l’identification est obtenue à l’aide du microtube contenant le
Catalogue Analytique (vendu par le fournisseur) ou milieu déshydraté
d’un logiciel d’identification.

2. Échantillons (prélèvement et préparation)


La galerie API 20E ne doit pas être utilisée directement à partir des prélèvements d’origine clinique ou autres.
Les micro-organismes à identifier doivent, dans un premier temps, être isolés sur un milieu de culture adapté à
la culture des Enterobacteriaceae et/ou des bacilles à Gram négatif non exigeants selon les techniques usuelles de
bactériologie.
3. Mode opératoire
• Test oxydase
Le test oxydase doit être réalisé selon les instructions du fabricant, il constitue le 21e test d’identification à
noter sur la fiche de résultats.
• Préparation de l’inoculum
-- Ouvrir une ampoule d’API NaCl 0,85 % Medium (5 mL) ou utiliser un tube contenant 5 mL d’eau phy-
siologique stérile ou d’eau distillée stérile, sans additif.
-- À l’aide d’une pipette, prélever une seule colonie bien isolée sur milieu gélosé. Réaliser une suspension
bactérienne en homogénéisant soigneusement cette colonie dans le milieu. Cette suspension doit être
utilisée extemporanément.
• Inoculation de la galerie
-- Introduire la suspension bactérienne dans les tubes de la galerie à l’aide de la même pipette :
·· pour les tests CIT, VP et GEL, remplir microtube et microcupule ;
·· pour les autres tests, remplir uniquement les microtubes (et non les cupules) ;
·· pour les tests : ADH, LDC, ODC, H2S et URE, créer une anaérobiose en remplissant leur microcupule
d’huile de paraffine.
-- Refermer la boîte d’incubation. Incuber à 36 °C ± 2 °C pendant 18-24 h.
4. Lecture et interprétation
 ecture de la galerie
L
Noter sur la fiche de résultats toutes les réactions spontanées puis révéler les tests nécessitant l’addition de
réactifs, soient les tests :
TDA : Réduction des nitrates en nitrites (NO2)
Ajouter une goutte de réactif TDA (perchlorure de et en azote (N2) et cupule GLU  : après
fer). Une couleur marron rougeâtre indique une avoir lu le caractère glucose, ajouter 1
réaction positive (présence d’acide indol pyruvique) goutte des réactifs NR1 (acide sulfanilique)
à noter sur la fiche de résultats. et NR2 (α-naphtylamine). Attendre 2 à
5 minutes. Une coloration rouge indique
IND : une réaction positive (présence de NO2
Ajouter une goutte de réactif JAMES (ou de issu de la réduction des nitrates par une
KOVACS). Une couleur rose diffusant dans toute nitrate réductase bactérienne). Une réaction
la microcupule indique une réaction positive négative (coloration jaune) peut être due à la
(présence d’indole) à noter sur la fiche de résultats. production d’azote (N2) à partir des nitrites :
ajouter 2 à 3 mg de réactif Zn (poudre de
VP : zinc) dans la cupule GLU. Après 5 minutes,
Ajouter une goutte des réactifs VP1 (KOH) et VP2 un tube resté jaune indique une réaction
(α-naphtol). Attendre au minimum 10  min. positive (présence de N2) à noter sur la fiche
Une couleur rose ou rouge indique une réaction de résultats. Si la cupule est orange-rouge,
positive (présence d’acétoïne) à noter sur la fiche la réaction est négative, les nitrates encore
de résultats. Une faible coloration rose apparaissant présents dans le tube ont été réduits en
après 10 min doit être considérée négative. nitrites par le Zinc.

70
ACTIVITÉ 2
DÉNOMBREMENT DES E. COLI DANS UNE PRÉPARATION À BASE DE VIANDE

PRÉSENTATION 3. Combien attend-on au maximum de colonies sur les


Le tableau    1    présente un extrait du règlement (CE) boîtes de la dilution 10-2 si l’unité d’échantillon de
n° 2073/2005 de la commission européenne du 15 novembre l’aliment analysé est « acceptable » (classe 2) ?
2005 concernant les critères microbiologiques applicables 4. Les résultats du dénombrement réalisé  sont présentés
aux denrées alimentaires. dans le tableau    2   .
4.1. À l’aide de la formule de calcul normalisée, calculer
La norme NF ISO 16649-2 d’août 2001 (annexe    1   ) le nombre d’UFC :
est une méthode pour le dénombrement des E. coli - par mL de suspension mère ;
β-glucuronidase positive par la technique de comptage des - par gramme de préparation à base de viande.
colonies à 44  °C au moyen d’un milieu contenant du Donnée : formule de calcul normalisée :
5-bromo-4-chloro-indolyl-b-Dglucuronate, substrat
chromogénique permettant la détection de l’enzyme
β-glucuronidase.
4.2. Analyser les résultats obtenus pour cette unité
QUESTIONS
d’échantillon. Conclure.
1. Q ue traduit la présence de E. coli en quantité importante 4.3. Les analyses des autres unités d’échantillon ont
dans une préparation à base de viande ? donné les résultats suivants :
2. La présence du sérotype E. coli O157:H7 ne peut pas n2 = 9.102 UFC.g-1 ; n3 = 1.103 UFC.g-1 ;
être détectée avec la gélose TBX (annexe    2   ). À l’aide du n4 = 4.103 UFC.g-1 ; n5 = 6.102 UFC.g-1.
Zoom p. 23 (Les cas groupés de syndrome hémolytique
et urémique), indiquer si cela peut engendrer un Conclure.
problème de santé publique.

 1  Recherche et dénombrement d’E. coli dans une préparation à base de viande

Plan d’échantillonnage Limites en UFC/g Méthode


Stade d’application Action en cas de résultat
d’analyse de
n C m M du critère insatisfaisant
référence
Amélioration de l’hygiène de
Fin du procédé de production et amélioration de la
5 2 500 5000 ISO16649-1ou 2
fabrication sélection et/ou de l’origine des
matières premières

 2  Résultats du dénombrement

Suspension mère 10-1 10-2


Nombre de colonies Boîte 1 450 45 8
totales Boîte 2 380 56 9
Nombre de colonies Boîte 1 142 15 2
caractéristiques Boîte 2 138 17 3

71
Chapitre 3 L’eau, un composant
Dénombrement essentiel
d'une des produit
flore d'un organismes vivants
microbien

ANNEXE 1
Recherche et dénombrement des E. coli selon la norme NF EN ISO 16649-2
Introduire 10 g de préparation à base de viande dans 90 mL de tryptone-sel.
Homogénéiser après broyage. On obtient la « suspension mère ».

-1 -2
Réaliser les dilutions 10 et 10 de la « suspension mère » en tryptone-sel.
J0

Introduire 1 mL de la « suspension mère » et de chacune des dilutions dans


deux boîtes de Petri stériles. Ajouter 15 mL de milieu TBX en surfusion à 45-
50 °C. Bien homogénéiser. Laisser durcir. Recouvrir de milieu stérile.
Laisser durcir. Incuber 18 à 24 h à 44 °C.

Après la période d’incubation spécifiée, compter les UFC caractéristiques


de E. coli β-glucuronidase positive dans chaque boîte contenant moins de
150 UFC caractéristiques et moins de 300 UFC au total (UFC
caractéristiques et non caractéristiques).
Pour que le résultat soit valide, il est en général estimé nécessaire de
J1
compter les UFC caractéristiques sur au moins une boîte contenant un
minimum de 15 UFC caractéristiques. Dans la formule de calcul normalisée,
∑C est alors la somme des UFC comptées sur toutes lesboîtes de deux
dilutions successives dont au moins une contient un minimum de 15 UFC
caractéristiques.

ANNEXE 2
Le milieu TBX
Les sels biliaires inhibent la croissance de la majorité des micro-
organismes à Gram positif et favorisent la récupération des
Escherichia coli.
Le BCIG (acide 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronique)
est un substrat chromogène. La plupart des souches d’Escherichia
coli possédant une β-glucuronidase agissent par clivage du BCIG,
entraînant la coloration des colonies en bleu.
Il est important de noter que toutes les bactéries de l’espèce
Escherichia coli ne possèdent pas de β-glucuronidase. C’est le cas
notamment du sérotype O157:H7 qui présente donc des colonies
blanches.
L’incubation réalisée à 44  °C et impérativement limitée à 24  h
permet d’inhiber la croissance de la majorité des micro-organismes
contaminants.

72
ACTIVITÉ 3
DÉNOMBREMENT DES ENTÉROCOQUES DANS UNE EAU

PRÉSENTATION 1.1. Commenter le choix de la porosité de la membrane


Les entérocoques possèdent les propriétés suivantes : filtrante  ; en déduire le diamètre minimal des
-- ce sont des coques Gram +, catalase -, ne formant pas entérocoques.
d’endospore ; 1.2. Commenter l’aspect macroscopique des colonies
-- ils appartiennent aux streptocoques du groupe D (selon observées sur la gélose de Slanetz et Bartley.
Lancefield), groupe divisé en deux sous-groupes  : les Conclure.
entérocoques et les non-entérocoques ; 1.3. Après transfert de la membrane sur gélose BEA,
-- ils sont, entre autre, capables de cultiver à 45  °C et en on observe sous 2/3 des colonies l’apparition d’un
bouillon 6,5 % de NaCl à 35 °C ; halo noirâtre. Conclure.
-- ils résistent à de nombreux inhibiteurs et notamment à la 1.4. Rendre le nombre d’entérocoques pour 100  mL
bile et à l’azide de sodium ; d’eau analysée.
-- ils sont, entre autres caractères biochimiques, TTC+ et
esculine +. 2. Dénombrement des entérocoques par la méthode du
NPP (norme NF EN ISO 9308-3)
Leur présence dans une eau traduit une contamination Dans cette norme (annexe    2   ) sont considérés comme
fécale relativement ancienne si elle est associée à celle des entérocoques les micro-organismes donnant une réac-
coliformes fécaux. Il existe également des entérocoques tion positive en 48 h à 37 °C dans un milieu de Rothe
(document    3   ) et une réaction positive en 24 h à 37 °C
d’origine non fécale provenant de matières végétales, du
sur un milieu de Litsky (document    4   ). Le tableau    6    
sol et des insectes. Ces espèces ne sont pas associées à la
donne les résultats obtenus pour une eau analysée selon
présence de coliformes fécaux. cette norme.
Étant donné qu’il est difficile de discriminer les 2.1. Le choix des dilutions testées est-il satisfaisant ?
entérocoques d’origine fécale et les entérocoques d’origine 2.2. Pourquoi certains résultats dans la série de Litsky
non fécale, les entérocoques doivent être plutôt perçus sont « non effectués » ?
comme un indicateur général de pollution d’origine 2.3. Déterminer NPP, le nombre le plus probable
organique. d’entérocoques par mL d’eau analysée (cf. table de
Mc Grady p. 61).
Le dénombrement des entérocoques dans une eau peut se 2.4. Une eau analysée précédemment a donné comme
faire par filtration ou par une méthode de dénombrement résultat  : 2  000 entérocoques par mL. Quelles
en milieu liquide (selon le NPP). dilutions doivent être réalisées pour avoir une
série de résultats exploitables de façon optimale
QUESTIONS par cette méthode ?
1. Dénombrement des entérocoques par la technique de
filtration (norme NF EN ISO 7899-2) 3. Comparaison des deux méthodes
Selon cette norme (annexe    1   ) : 3.1. 
Dresser un tableau de comparaison entre la
-- les entérocoques présumés sont les bactéries se dé- technique par filtration et la technique par
veloppant en 44 ± 4  h à 36  °C, sur milieu sélectif dénombrement en milieu liquide (NPP) en
à l’azoture de sodium (gélose de Slanetz et Bartley, comparant les points suivants :
document    1   ) en donnant des colonies typiques -- temps de manipulation (court, long) ;
-- temps nécessaire à l’obtention du résultat de
réduisant le chlorure de triphényl-2,3,5 tétrazolium
l’analyse (en heures) ;
(colonies TTC+) ;
-- matériel nécessaire.
-- les entérocoques sont les bactéries se développant en 3.2. 
À partir des critères microbiologiques suivants
44 ± 4  h à 36  °C, sur milieu sélectif à l’azoture de établis pour différentes catégories d’eau, quelle
sodium en donnant des colonies typiques réduisant le méthode peut-on choisir pour leur analyse ?
chlorure de triphényl-2,3,5 tétrazolium qui, de plus -- eau de consommation  : 0  entérocoques pour
donnent une réaction positive sur une gélose biliée à 100 mL ;
l’esculine (colonies esculine +) (document    2   ) et une -- eau de baignade (eau de qualité correcte)  :
réponse négative au test catalase. 100 entérocoques pour 100 mL ;
Le document    5    montre le résultat de la membrane -- eau destinée à la production d’eau potable né-
déposée sur gélose de Slanetz et Bartley après incubation, cessitant un traitement classique : 1������������
 000 �������
entéro-
pour une eau analysée selon cette norme. coques pour 100 mL.

73
Chapitre 3 Dénombrement d'une flore d'un produit microbien

 2  Milieu confirmatif : gélose biliée à l’esculine et à


Milieu présomptif de Slanetz et Bartley
   1     l’azoture (BEA)

La présence d’azide de sodium limite la croissance de toutes Alors que la prolifération des entérocoques tolérant la bile
les bactéries pourvues d’une chaîne respiratoire (flore n’est pas ralentie, la croissance des bactéries secondaires
secondaire inhibée). Les entérocoques, bactéries anaérobies d’origine non intestinale est largement inhibée par les sels
aérotolérantes donc dépourvues de chaîne respiratoire, ne biliaires. Les entérocoques hydrolysent l’esculine (glucoside)
sont pas inhibés. De plus ils réduisent le TTC en formazan qui en glucose et en esculine. L’esculine forme avec les ions
colore leurs colonies en rouge. Fer(III), un complexe noir qui diffuse dans le milieu.

Milieu présomptif : bouillon glucosé à l’azoture (milieu


3     4    Milieu confirmatif : milieu de Litsky
de Rothe)

Le milieu de Rothe contient du glucose, indispensable à Le milieu de Litsky est plus sélectif que le milieu de Rothe car
la croissance des entérocoques (micro-organismes pour il contient, en plus de l’azide de sodium, un second inhibiteur,
lesquels la présence de peptones ne suffit pas à la production l’éthyl violet ou cristal violet. Les quelques souches de bacilles
d’énergie), et un inhibiteur, l’azide de sodium ou azoture sporulés et coques à Gram positif autres que les entérocoques
de sodium, qui rend le milieu sélectif pour les bactéries donnant des résultats positifs en milieu de Rothe, sont inhibés
dépourvues de chaîne respiratoire dont les entérocoques. en présence d’éthyl-violet.
Le développement des entérocoques se traduit par un trouble
associé à la formation (ou non) d’une pastille violette au fond
du tube.

5  Résultat de la culture sur gélose Slanetz et Bartley (44 h à 36 °C)

 6  Dénombrement des entérocoques en milieu liquide par la méthode du NPP

100 10-1 10-2 10-3 10-4


Bouillon de Rothe
- trouble + + + + + + + + - + - - - - -
Bouillon de Litsky
- trouble + + + + + + - - - - ne ne1 ne ne ne
- pastille violette + + + + - + - - - - ne ne ne ne ne
ne : test non effectué
1

74
ANNEXE 1
Recherche et dénombrement des entérocoques selon la norme NF EN ISO 7899-2

Filtrer 100 mL d’eau à analyser sur une membrane filtrante de 0,45 µm de


porosité.
J0

Placer la membrane sur une gélose de Slanetz et Bartley avec TTC.


Incuber 44 h à 36 °C.

Dénombrer les colonies caractéristiques d’entérocoques présumées


présentant une coloration rouge, marron ou rose, pouvant être limitée au
centre ou à la périphérie.
En cas de présence de colonies d’entérocoques présumées transférer la
J1 membrane sans la retourner sur une boîte de milieu confirmatif gélose Bile
Esculine Azide (BEA). Placer 2 h à 44 °C.
Compter les colonies d’entérocoques confirmées entraînant l’apparition
d’un halo noir dans le milieu. En cas de doute, une réaction négative au test
de la catalase confirmera la présence d’entérocoques.

ANNEXE 2
Dénombrement des entérocoques selon la norme NF EN ISO 9308-3
Méthode par ensemencement en milieu liquide et détermination du NPP
Réaliser une série de dilutions de l’eau à analyser en eau physiologique
J0 stérile de raison 1/10. Ensemencer trois bouillons présomptifs glucosés à
l’azoture (bouillon de Rothe) avec 1 mL d’eau analysée et de chaque dilution
réalisée. Incuber 24 h à 37 °C.

Lecture des bouillons de Rothe : considérer comme positifs les tubes pour
J1 lesquels on observe un trouble.
À partir de chaque bouillon de Rothe positif, ensemencer à l’aide d’une anse
calibrée, un bouillon confirmatif de Litsky. Incuber 24 h à 37 °C.

Lecture des bouillons de Litsky : la présence d’entérocoques se caractérise


J2
par l’apparition d’un trouble dû au développement bactérien, avec ou sans
dépôt violet au fond du tube.

75
Chapitre 3 Dénombrement d'une flore d'un produit microbien

FICHE TECHNIQUE 1
LA FILTRATION D’UN LIQUIDE

1 Stériliser, avant usage, l’unité de filtration par autoclavage.

Installer la trompe à vide et placer l’ensemble de l’appareil entre deux becs Bunsen de manière à
2
ménager une zone de travail stérile.

Séparer le godet de la base de l’unité de filtration, en déposant le godet, couvercle à l’envers, derrière
3
la zone de travail. Ne jamais passer les mains au-dessus des structures ouvertes.

4 Déposer stérilement sur le support, une membrane filtrante neuve et stérile (quadrillage vers le haut).

Replacer le godet et l’ouvrir. Déposer son couvercle à l’envers sur la paillasse, toujours derrière la
5
zone de travail pour éviter de passer les mains par-dessus.

Après avoir bien agité le liquide à analyser, le verser doucement jusqu’à la graduation adéquate.
6
Refermer le couvercle du godet.

7 . du liquide
Faire le vide sans brutalité pour ne pas briser la membrane filtrante et filtrer la totalité

8 Arrêter la filtration.

Ouvrir l’unité et rincer (trois fois) avec de l’eau stérile les parois internes du godet pour récupérer les
9
micro-organismes qui s’y seraient déposés. Filtrer après chaque rinçage.

9 . petits vides.
Sécher la membrane filtrante en effectuant plusieurs

10 Arrêter la filtration.

11 Ouvrir l’unité en déposant toujours le godet, couvercle à l’envers, derrière la zone de travail.

Prélever stérilement la membrane filtrante et la déposer sans la retourner sur une gélose nutritive.
12
Il ne doit pas y avoir de bulles d’air sous la membrane sous peine d’avoir des zones ne permettant
pas la diffusion des nutriments.

Dépôt de la
Échantillon d’H2O membrane
filtré au travers sur une boite
Membrane filtrante de la membrane contenant Incubation
sur un support (0,45 µm) le milieu. pendant 24 h

76

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