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Apostila de aula prática

Disciplina: Microbiologia e
Imunologia

Professora: Eliane de Oliveira Ferreira

2009
Laboratório de Microbiologia

As aulas práticas de microbiologia têm como objetivo ensinar ao estudante os


princípios e os métodos utilizados em um laboratório de microbiologia. Pelo fato de
trabalharmos com uma diversidade de bactérias, sendo algumas delas patogênicas ao
homem, é que é essencial seguirmos as normas de segurança estabelecidas em um
laboratório de microbiologia, a fim de evitarmos a contaminação dos estudantes,
professores e funcionários. Desta forma algumas normas iniciais devem ser estabelecidas
antes de iniciarmos as nossas atividades:
1- Desinfetar a bancada de trabalho no início e término de cada aula prática. Para
isso, utilizamos o álcool comercial (70%). Tal prática diminui a contaminação
das nossas culturas na área de trabalho;
2- Não comer, beber, ou fumar no laboratório. Se a bancada, equipamentos ou
instrumentos tiverem sido contaminados acidentalmente com quaisquer
microrganismos, comer ou fumar é um meio eficiente para autocontaminação;
3- Usar sempre um jaleco. Este não deve ser utilizado fora do laboratório, pois
pode estar contaminado;
4- Lavar as mãos antes de iniciar as atividades no laboratório e ao término das
mesmas;
5- Avisar ao professor ao a pessoa responsável em caso de contaminação acidental;
6- Não colocar materiais contaminados (pipetas, lâminas, etc) sobre a bancada.
Esses materiais devem ser descartados em locais ou recipientes apropriados que
serão dispostos em cada bancada, contendo ou não uma solução
descontaminante;
7- Cada aluno será responsável pelo material que receber;
8- Seguir as normas de uso dos aparelhos. O microscópio é um instrumento de
trabalho valioso e deve ser manipulado cuidadosamente. Desta forma o aluno
deverá saber como manipulá-lo.
9- Deve-se ter cuidado ao acender o bico de Bunsen. Substâncias inflamáveis não
podem estar por perto.
10- Alças, agulhas e pinças devem ser flambadas antes e após o uso.
Morfologia bacteriana e coloração de Gram

Para que se observar às células bacterianas ao microscópio óptico (MO) é preciso


que se tenha pleno conhecimento da sua morfologia e tamanho. Além disso, por serem
pequenas elas não apresentam contraste quando observadas ao MO e por isso devem ser
coradas.
As células bacterianas são caracterizadas morfologicamente quanto aos seguintes
aspectos:
a) Tamanho: as bactérias são microrganismos microscópicos que medem desde 0,3
por 0,8 µ até 10 por 25 µm. As espécies de maior interesse médico medem entre 0,5
a 1 µm por 2 a 5 µm. Sendo assim não é possível visualizá-las a olho nu, sendo
necessário um MO uma objetiva de imersão (100 X). O uso de um microscópio
eletrônico só é útil quando se deseja estudar as estruturas bacterianas.
b) Forma: as bactérias podem ser classificadas quando à forma em três grupos
básicos:
Cocos- células esféricas
Bacilos- células cilíndricas, em forma de bastão
Espirilos- células espiraladas. Algumas delas se comportam como bacilos curvos que
podem ser denominadas víbrios. Entre as bactérias espiraladas existem as espiroquetas
que são células flexíveis que se movimentam por rotação e flexão.

c) Arranjo (cocos): são grupos de células bacterianas que dependendo do plano e do


número de divisões através das quais as bactérias continuam unidas podem aparecer
com os seguintes arranjos:
c.1) Pares- diplococos (pneumococos):
c.2) Cadeias (estreptococos):

c.3) Cachos (estafilococos):

c.4) Tétrades:

c.5) Sarcina (cúbico):


d) Bacilos

d.1) Cocobacilos

e) Espirilos

Leptospira sp Borrelia sp

f) Víbrios
Bacilos e espirilos apresentam-se, normalmente, como células isoladas, porém,
aocasionalmente pode-seobservar bacilos aos pares (diplobacilos) ou em cadeias
(estreptobacilos).

Coloração morfotinturial ou de Gram

Esta coloração é bastante utilizada porque a maioria das bactérias cora-se por este
método, permitindo observar sua morfologia e fornecendo informações a respeito do
comportamento do material celular diante de corantes básicos (corantes do Gram).

Método
A coloração de Gram é melhor realizada quando o material vem da placa de cultivo
e não do meio de cultura líquido que pode trazer muitos debris celulares. Para realizar a
coloração deve-se primeiramente pingar uma gota de salina sobre uma lâmina de
microscopia e em seguida espalhar um pouco da colônia bacteriana, com o auxílio de uma
alça ou agulha de inoculação, nesta gota. Em seguida, os seguintes passos devem ser
realizados:
1. Fixar o esfregaço pelo calor passando-se a lâmina na chama do bico de Bunsen;
2. Cobrir o esfregaço com cristal violeta e esperar 1 minuto.
3. Lavar rapidamente com água destilada.
4. Cobrir o esfregaço com lugol (iodo) e esperar 1 minuto.
5. Lavar rapidamente com água destilada.
6. Cobrir o esfregaço com álcool: acetona (1:1) e esperar 30 segundos.
7. Cobrir o esfregaço com fucsina e esperar 1 minuto.
8. Lavar rapidamente com água destilada e secar a lâmina a TA.
9. Colocar uma gota de óleo de imersão sobre o esfregaço corado.
10. Observar em objetiva de imersão (100X resultando em um aumento final de 1000X).
Notas:
a) O etanol pode ser usado com um agente descorante fraco;
b) O material dos corantes empregados na técnica, principalmente sedimento do cristal
violeta, poderá aparecer como artefato;
c) O descoramento para mais ou para menos é resultante da utilização incorreta do
descorante (álcool: acetona);
d) A idade da cultura bacteriana tem importância fundamental na coloração de Gram.
Culturas envelhecidas, células Gram-positivas freqüentemente se tornam Gram-
negativas.
e) Enzimas líticas excretadas normalmente por culturas envelhecidas podem causar
danos à membrana das células, como, por exemplo, alterando a permeabilidade aos
solventes (álcool:acetona ou éter:acetona). Conseqüentemente, o complexo iodo-
cristal violeta poderá ser retirado da célula.
f) Caso surja um questionamento quanto à coloração positiva ou negativa do Gram,
uma coloração paralela utilizando-se culturas conhecidas como Gram positiva
(Staplylococcus aureus) e negativa (Escherichia coli) devem ser usadas como
controles.

O mecanismo da coloração de Gram refere-se à composição da parede celular


bacteriana, sendo que as Gram-positivas possuem uma espessa camada de
peptideoglicano e ácido teicóico e as Gram-negativas, uma fina camada de
peptideoglicano rica em lipopolissacarídeo e outros componentes. Durante o processo
de coloração, o tratamento com o descorante extrai os lipídeos resultado em uma maior
porosidade ou permeabilidade da parede celular das Gram-negativas que se coram com
a fucsina e ficam rosadas (Figura 1). Já a parede celular das Gram-positivas, por ser
mais espessa, torna-se desidratada durante o tratamento com o descorante, e a
porosidade e a permeabilidade diminuem, impedindo a saída do complexo cristal
violeta e iodo (lugol). Desta forma elas coram-se de roxo (Figura 2).

Gram-negativa (E. coli) Gram-positiva (S. aureus)

Preparo dos corantes do Gram

A finalidade da coloração é facilitar a observação microscópica das bactérias e


diferenciá-las de acordo com as suas características morfotinturiais. Na prática, os corantes
são divididos em dois grupos: os ácidos e os básicos. Os básicos são sais com base corada
que se unem eficazmente a substratos ácidos, tendo uma grande afinidade por material
nuclear. As bactérias comportam-se como material nuclear e, desse modo, quase toso os
corantes utilizados em bacteriologia são corantes básicos. Os corantes ácidos tendem a
corar mais eficientemente os substratos básicos como o citoplasma.
Em todo método de coloração existem vários fatores que podem influenciar os
resultados, como por exemplo, o pH das soluções, a limpeza das lâminas, a pureza dos
reagentes e o modo de preparação do corante.

Técnica do preparo dos corantes

1) Cristal violeta: 1g de cristal violeta; 2g de ácido fênico; 10 mL de álcool absoluto; 100


mL de água destilada. Diluir o cristal violeta no álcool e juntar aos pouco o ácido fênico,
misturando sempre, de modo a obter uma mistura bem homogenia. Juntar a água, pouco a
pouco, misturando bem. Filtrar em papel de filtro após 24h de repouso.

2) Lugol: 1g de iodo; 2 g de iodeto de potássio; 300 mL de água destilada. Diluir o iodo


com o iodeto de potássio em água e misturar bem. Preparar a solução em quantidade que
seja usada antes de 30 dias.

3) Álcool acetona: 800 mL de álcool; 200 mL de acetona. Misturar as duas soluções. Éter
acetona: 500 mL de éter e 500 mL de acetona. Misturar as duas soluções. Guardar em um
recipiente com vedação já que as duas substâncias são voláteis.

4) Fucsina: 2,5g de fucsina; 100mL de álcool etílico; 90 mL de água destilada. A solução


estoque (fucsina e álcool etílico) deve ser prepaparada unindo-se os dois componentes e
misturando bem. Para usar juntar 10mL da solução estoque em 90 mL de água destilada, ou
seja, diluir 10% em água destilada.
Todos os corantes devem ser armazenados em frasco de vidro âmbar em local com a
temperatura entre 20 e 25oC (TA) e sem umidade.

Técnica de Inoculação de Bactérias em Meios de Cultura e Verificação da Atmosfera


de Crescimento

Meios de Cultura

Os meios de cultura destinam-se ao cultivo artificial dos microrganismos. Eles


fornecem os nutrientes indispensáveis ao seu crescimento bacteriano. As exigências
nutritivas estão relacionadas a uma fonte de carbono, de nitrogênio, de energia e de sais
minerais. Alguns microrganismos também precisam de fatores de crescimento que são
susbstâncias que eles não são capazes de sintetizar, como vitaminas, aminoácidos, etc.
Outras condições inerentes ao meio de cultura necessário ao desenvolvimento são as
condições de pH, pressão osmótica e grau de umidade. Os meio de cultura são classificados
em diversos tipos:

a) Quanto à consistência
Líquido: Tioglicolato, Infusão de coração e cérebro (BHI)
Semi-sólido: Sulfeto indol motilidade (SIM)
Sólido: agar sangue (AS), ágar manitol salgado (MSA)

b) Quanto à função
Enriquecedor: BHI e AS
Seletivos: MSA e MacConkey (MC)
Diferenciadores: MC e AS
Manutenção: Ágar nutriente (NA)

Meio líquido: é aquele em que os nutrientes estão envolvidos em uma solução aquosa;
Meio semi-sólido: este meio possui na sua composição, além dos nutrientes, uma
pequena porcentagem de agar;

Meio sólido: é um meio que possui na sua composição nutrientes e uma quantidade de
agar maior do que o semi-sólido. Em torno de 1,5% (1,5g em 100mL);

Meio enriquecedor: é aquele que permite o crescimento de microrganismos exigentes


que necessitam fatores de crescimento, mas não inibem o crescimento de outros. Este
meio, além das fontes nutritivas usuais, mencionadas anteriormente, pode possuir
sangue, soro, carne moída, etc;

Meio contendo
Agar carne moída
sangue (chopped meat)

Meio seletivo: é aquele que contém substâncias que inibem o crescimento de certos
microrganismos, porém seleciona aquele de interesse. Dentre as substâncias inibidoras
estão o cristal violeta, cloreto de sódio, etc.;

Agar manitol salgado


Meio diferencial: este meio possui substâncias que evidenciam uma característica que
permite separar um grupo ou espécie de microrganismo. Como por exemplo,
carboidratos (lactose; Meio MacConkey);

MacConkey

Meio de manutenção: a manutenção adequada da viabilidade e das características


fisiológicas de uma cultura pode exigir um meio diferente daquele que é recomendado
para o seu crescimento ótimo, pois o crescimento rápido pode estar associado com a
rápida morte celular devido à eliminação de substâncias tóxicas como produto de
metabolismo dos microrganismos. A glicose deve ser evitada, pois durante o seu
metabolismo, ácidos são liberados.
Além destes meios de cultura, existem aqueles que são preparados pela união de
componentes naturais e sintéticos, sendo denominados semi-sintéticos. A lista de meios
de cultura é enorme e a escolha é feita de acordo com o laboratório de diagnóstico ou de
pesquisa.
Os meios de cultura devem ser preparados tendo-se em mente alguns fatores que
possam interferir com resultado satisfatório do crescimento bacteriano, tal como o pH,
temperatura, potencial redox, etc. A maioria dos meios de cultura são vendidos na
forma de pó ou granulados. Após misturar cada um dos ingredientes, estes devem ser
bem misturados e terem o pH aferido. Só então devem ser esterilizadas em uma
autoclave (121oC por 15 min). Os meios líquidos devem ser distribuídos antes de serem
autoclavados (Figura 3); aqueles que levam Agar, ou precisam de outros ingredientes
como sangue, devem ficar em um banho Maria (Figura 4) a uma temperatura entre
55oC-60oC para só então serem distribuídos em placas de Petri ou tubos. Alguns meios
de cultivo que não contêm Agar, não podem ser autoclavados e sim esterilizados por
filtração (filtro com poros de 0.22 µm) (Figura 5).

Figura 3 Figura 4 Figura 5


Os meios, após a sua preparação, devem ser esfriados à TA. Quando a quantidade
de meios for pequena e de uso imediato (uma semana), eles devem ser armazenados em
geladeira e preferencialmente no interior de sacos plásticos ou recipientes fechados para
evitar desidratação. Para usar frascos de meios líquidos, estes também podem ser
esterilizados separadamente com rolhas de algodão e em ambiente estéril, o meio de
cultura pode ser transferido. Cada tubo ou placa de Petri com meio de cultura devem ser
rotulado para indicar claramente o seu conteúdo, data de preparação e de vencimento..
Os tubos e placas codificados devem ter referências suficientemente claras, de maneira
que mesmo o pessoal estranho ao laboratório, possa interpretar o código.

Controle da Qualidade

Embora muitos materiais sejam obtidos de fontes comerciais fidedignas e tenham


sido submetidos a controle da qualidade pelo fabricante, em muitos casos deve-se
repetir a avaliação no laboratório, antes de sua utilização. Deve-se em cada novo lote de
mios, inocular microrganismos conhecidos (da coleção do laboratório - bacterioteca),
pois as suas reações nesses meios já são conhecidas. Estreptococos do grupo A, por
exemplo, devem ter um bom crescimento e apresentarem beta-hemólise no meio de
ágar sangue.

Métodos físicos e químicos de controle do crescimento microbiano

Os microrganismos podem ter seu crescimento controlado por agentes químicos e


físicos, os quais podem atuar eliminando totalmente os microrganismos ou impedindo o
seu crescimento, criando condições nos quais eles podem se reproduzir. Diversos
métodos podem ser utilizados, como, por exemplo, calor e radiações ionizantes. O
controle do crescimento dos microrganismos é muito importante e necessário na
medicina e em outras áreas das Ciências da Saúde como Odontologia, Biologia,
Nutrição, Farmácia e Enfermagem. Como exemplos da aplicação dos métodos de
controle, temos a prevenção das infecções hospitalares por procedimentos e técnicas
adequados que vão desde o modo correto de lavar as mãos até os processos indicados,
de acordo com as normas do Ministério da Saúde, para limpar, esterilizar e/ou
desinfetar artigos e equipamentos e superfícies hospitalares. O processamento correto
garante o nível adequado de microrganismos, o que é imprescindível para a segurança
nos atendimentos aos pacientes e da equipe.
Em laboratórios de pesquisa e também de análises clínicas estes métodos estão
presentes no preparo de meios de cultura, esterilização de vidraria como pipetas, placas
de Petri, ponteiras e vários outros materiais. Desta forma, noções básicas de limpeza,
desinfecção e assepsia são importantes no preparo dos alimentos. Os métodos de
esterilização dependem do tipo de material e do tipo de controle desejado.

Conceitos importantes:

1- Superfícies: o termo superfície se refere a mobiliário, pisos, paredes, portas, tetos,


janelas, equipamentos e demais instalações hospitalares ou estabelecimentos da área
de saúde.
2- Artigos: são instrumentos, objetos de natureza diversa, utensílios, comadres,
acessórios de equipamentos, louça, talheres, etc.

A limpeza é importante no controle do crescimento dos microrganismos. A


simples remoção mecânica da sujeira retira os compostos que poderiam ser usados
como nutrientes pelos microrganismos, como, por exemplo, matéria orgânica
(sangue, vômito, soro, detritos alimentícios, etc). A limpeza também remove pó,
terra e matéria orgânica (sais), além, evidentemente, de também remover os
microrganismos. A limpeza de artigos e superfícies pode ser feita com fricção
mecânica com água, sabão, esponja, pano ou escova. Também pode-se utilizar
máquinas de limpeza com jatos de água quente ou detergente ou ainda máquinas de
ultra-som com detergentes/desincrustantes associados ou não a produtos
enzimáticos auxiliares de limpeza como peptidades e lípases. Após a limpeza, deve-
se realizar o enxágüe com água potável e corrente. Os artigos podem ser secos com
panos limpos, com secadora de ar quente, estufa ou ar comprimido. Dependendo do
destino do artigo, ele será então guardado ou submetido à esterilização ou
desinfecção.
Dentre os termos utilizados para a limpeza dos materiais estão:

a) Descontaminação: é a limpeza realizada com agentes físicos ou químicos com o


objetivo de remover agentes contaminantes, como fluidos e secreções corporais com
agentes infecciosos. Pode ser feita também por fricção com esponja, pano ou
escova, embebidos em produtos químicos. Após a limpeza por desinfecção, os
artigos devem ser secos, guardados ou processados para esterilização.

b) Sanitação: é o tratamento que leva à diminuição da vida microbiana nos utensílios


alimentares e equipamentos de manipulação de alimentos até os níveis seguros de
saúde pública. Este processo é realizado com agentes químicos que podem ser sabão
ou detergentes e desinfetantes do tipo sanitizantes.

c) Desinfecção: é a eliminação parcial (ou redução) do número de microrganismos


(principalmente patogênicos) presentes em um material inanimado. A desinfecção é
feita por agentes químicos – os desinfetantes. Pode também, como na
descontaminação, ser realizada por método físico com água em ebulição e máquina
automática de água quente (60oC-90oC)

d) Anti-sepsia: semelhante à desinfecção, porém relacionada a tecidos vivos. É feita,


também, por meio de agentes químicos, denominados anti-sépticos, em
concentrações adequadas para estes tecidos.

e) Esterilização: é a eliminação total dos microrganismos e endoesporos (esporos).


Métodos químicos e físicos podem ser usados.

Os agentes químicos e físicos podem atuar impedindo o crescimento dos


microrganismos ou eliminando-os totalmente. Desta forma eles apresentam alguns
alvos celulares que eventualmente levarão a morte daquele microrganismo, como
por exemplo: a parede celular, membrana plasmática, enzimas e proteínas, DNA e
RNA. Assim, o crescimento microbiano pode ser controlado por diferentes métodos
(Quadro 1). Existe uma enorme variação em termos de sensibilidade entre os
microrganismos e os endoesporos de procariotos aos métodos físicos e químicos.
Em ordem decrescente de resistência a estes agentes estão os prions (proteínas
simples – não são considerados seres vivos, porque não têm genoma, mas são
infecciosos, causando sérios distúrbios, como mal da vaca louca ou encefalopatia
espongiforme bovina, doença de Creutzfeldt Jacob), endosesporos bacterianos
(Bacillus subtillis, Clostridium difficile), micobactérias (Mycobacterium
tuberculosis, Micobactérias atípicas), vírus não lipídicos (Poliovírus, Rinovírus),
Fungos (Cândida sp. e Criptococcus sp), formas vegetativas de bactérias
(Pseudomonas sp., Salmonella sp.) e vírus lipídicos (HBV, HIV, Herpes vírus).

Quadro 1: Métodos físicos e químicos de controle dos microrganismos


Métodos físicos Temperatura
Radiação
Filtração
Dessecação
Remoção de O2
Vibraçõa ultra-sônica
Métodos químicos Desinfetantes
Anti-sépticos
Preservativos usados em alimentos

Quanto aos métodos físicos de descontaminação, desinfecção e a


esterilização, os mais empregados usam como princípio básico o calor, as radiações
e a filtração. O calor é um dos mais importantes métodos usados para controle do
crescimento e para eliminar os microrganismos. É o método de eleição pos ser
seguro, de baixo custo e não formar produtos tóxicos. Acima da temperatura ideal
de crescimento o calor irá promover a desnaturação de proteínas estruturais e
enzimas, levando a perda da integridade e morte celular. O calor seco (estufa e
fornos) elimina os microrganismos também pelo processo de oxidação. Este método
tem menor poder de penetração do que o calor úmido e usam temperaturas e tempos
maiores. O calor úmido na forma de vapor tem maior poder de penetração e elimina
formas vegetativas dos procariotos, vírus e fungos e seus esporos. A autoclavação é
um equipamento que utiliza esse tipo de metodologia produzindo uma temperatura
mínima de 121oC (1 atm acima do nível do mar). Os prions não são destruídos por
essa metodologia. A morte pelo calor é uma função exponencial que ocorre à
medida que a temperatura se eleva.
A Pasteurização é um método usado na indústria de alimentos que só podem
ser submetidos ao calor em condições controladas para não desnaturar os nutrientes.
Neste método ocorre uma redução no número de microrganismos pela exposição
breve a uma temperatura relativamente alta. Não esteriliza. Existem basicamente
três tipos: ultra-alta temperatura (UHT – 141oC/2s), alta temperatura (72oC/15s) e
baixa temperatura (63oC/30 min).
Microscopia de microrganismos

Os microrganismos constituem um grupo de seres vivos de dimensões


reduzidas e bastante variáveis de acordo com o grupo a que pertencem. Os
procariotos (bactérias e arqueas) variam entre 300nm e 1µm. Os eucariotos (fungos,
algas e protozoários) constituem o grupo mais heterogêneo, variando de 10 µm a
100 µm (célula vegetal). Os vírus cuja organização estrutural não corresponde a
uma célula, variam de 27 nm (bacteriófago φX 174) até 300 nm (Pox vírus) de
diâmetro.
Devemos levar em consideração que o ser humano que o ser humano é capaz
de enxergar a olho nu estruturas com diâmetro de 0,2 mm, chegamos à conclusão
que para observarmos os microrganismos e seus detalhes precisamos de
microscópios. Dependendo do tipo de análise, podemos utilizar microscópios
ópticos ou de luz (Figuras 1 e 2), campo claro e escuro (Figura 7 e 8), confocal
(Figura 9) e eletrônico (transmissão e varredura) (Figuras 10 e 11, respectivamente).

Figuras 7 e 8- Paramecium aurelia Figura 9 – Microscopia confocal


– microscopia de campo claro da mosca da fruta, D.
(esquerda) e campo escuro (direita) melanogaster (verde) e a bactéria
Wolbachia (seta – vermelho)

Microscopia eletrônica de transmissão da Microscopia eletrônica de


bactéria Paenibacillus larvae. O varredura de vasos do xilema
peptidioglicano (parede celular) é mostra-se obstruídos com a bactéria
mais espesso. Xyllela fastidiosa.
Bibliografia

- Práticas de Microbiologia, Alane Beatriz Vermelho, Antônio Ferreira Pereira, Rosalie


Reed Rodrigues Coelho e Thaïs Souto-Padron. Editora Guanabara Koogan.

- Diagnóstico Microbiológico, Koneman, Elmer W./Allen, Stephen D./Janda, William


M./Schreckenberger, Paul C./Winn, Washington C. Editora Guanabara Koogan.