Manual de prácticas de laboratorio

Fundamentos de Biotecnología
(3007815)

Ángela Adriana Ruiz Colorado

Juan Camilo Acosta Pavas
David Sebastián Jimenez Villota

Última actualización: octubre de 2019

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Minas, Departamento de Procesos y Enegía
Medellín, Colombia
2019
Resumen
Este manual presenta una serie de practicas de laboratorio enfocadas en la
profundización de los temas trabajados en la parte teórica del curso de Funda-
mentos de Biotecnología. Se busca que los estudiantes tengan un conocimiento
básico en el área en cuanto a métodos de cuantificación comúnmente usados a
nivel industrial, caracterización morfológica de microorganismos con potencial
para la generación de productos de valor agregado y caracterizar enzimas en
términos de su actividad enzimática.

Para esto se presentan tres guías de laboratorio:

Cuantificación de carbohidratos y proteínas.

Medios de cultivo y microorganismos.

Cuantificación de la actividad enzimatica de una celulasa.

 CUANTIFICACIÓN DE CARBOHIDRATOS Y PROTEÍNAS

1. Método de determinación de azucares reductores por ácido 3,5

dinitrosalicílico (DNS) (Miller, 1959)
1.1. Objetivo
Determinar cuantitativamente la presencia de azúcares reductores mediante la técnica de espectrofo-
tómetrica.

1.2. Marco teórico

El método descrito a continuación determina la presencia de grupos carbonilos libres (C=O), por
ejemplo, grupos aldehídos en la glucosa y lactosa o grupos cetona en la fructosa, los cuales denominan
azúcares reductores debido a esta propiedad.

Se basa en la utilización de ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS) para provocar la oxidación de los azúcares
y, al mismo tiempo, su propia reducción, desarrollándose la reacción presentada en la Figura 1.

Figura 1. Reacciones de oxido-reducción.

Según lo anterior, un mol de azúcar reaccionará con un mol de ácido 3,5-dinitrosalicílico, dando lugar
a una relación estequiométrica que permite conocer la cantidad de azúcares reductores presentes en la
muestra.

La interacción de estos compuestos da lugar a una reacción colorimétrica: el ácido 3,5-dinitrosalicílico

es de color amarillo, mientras que la aparición del ácido 3-amino, 5-nitrosalicílico provoca un viraje a
pardo oscuro-marrón, cuya intensidad será, por tanto, proporcional a la cantidad de azúcares reductores.
Dicho cambio puede ser detectado a simple vista o medido por técnicas espectrofotométricas, si se conoce
el comportamiento de una solución patrón (glucosa), se pueden utilizar estos métodos para la medición
de la cantidad de azúcares reductores.

El reactivo consiste en una disolución formada por compuestos como: Ácido dinitrosalicílico (ácido
2-hidroxi-3,5 dinitrobenzoico), que actúa como oxidante; Sal de Rochelle (tartrato sódico-potásico), que
impide la disolución de oxígeno en el reactivo e hidróxido sódico, que aporta el medio requerido para
que se produzca la reacción redox. De esta forma, el ácido 2-hidroxi-3,5-dinitrobenzoico se reduce, en
presencia del grupo reductor de azúcares reductores tales como: glucosa, fructosa, lactosa y maltosa,
hasta ácido 3-amino-nitrosalicílico, mientras que el grupo aldehído reductor se oxida, para formar un
grupo carboxílico, como se ilustra en la Figura 2. En éste método analítico el DNS está en exceso frente
a los grupos reductores y en todas las muestras se adiciona la misma cantidad, de tal forma que mayores
concentraciones de azúcares reductores provocan una mayor coloración de la muestra. Estas diferencias
de coloración pueden determinarse por espectrofotometría visible, a la longitud de onda de máxima
absorbancia de 540nm.

3
 Figura 2. Oxidación de la glucosa mediante el ácido 3,5-dinitrosalicílico.

La reacción del DNS puede ser interferida por el oxígeno presente en la muestra, en tal caso se puede
adicionar sulfito de sodio para evitar la interferencia. Además, se puede aumentar la sensibilidad al
adicionar fenol en concentraciones de 2g/L, con el fin de aumentar la pendiente de la recta.

1.3. Equipos, materiales y reactivos

Espectrofotómetro y celdas de cuarzo
Tubos de ensayo con tapa.
Gradilla
Micropipeta de 1000µl y de 100µl
Puntas para micropipeta
Baño maría (o beaker grande y plancha de calentamiento)
Balanza analítica
Vórtex
Beaker con hielo
Solución estándar de glucosa (Preparada)
Agua destilada
Solución de DNS (preparada)

1.4. Preparación del reactivo DNS

Disolver 1.6g de NaOH en agua destilada.
Adicionar 30g de tartrato de sodio y potasio y 1g de DNS, aforar a 100mL con agua destilada.
Almacenar en frascos ámbar a 4◦ C.

1.5. Preparación curva de calibración de glucosa

Pesar 0.4 g de glucosa, diluir con agua destilada y llevar a un balón volumétrico de 100mL, para
obtener una solución stock de 4g/L.
Tomar 161 tubos de ensayo y depositar en cada uno de ellos las cantidades de solución de glucosa
preparada y agua que se observan en la Tabla 1.5.

Tabla 1. Concentraciones de glucosa para elaboración de curva de calibración.

Concentración (g/L) Solución stock de glucosa (mL) H2 O (mL) Volumen total (mL)
Blanco 0.0000 0.500
0.5 0.063 0.4375
1.0 0.125 0.375
0.5
2.0 0.250 0.250
3.0 0.375 0.125
4.0 0.500 0.000
1 Cada concentración se realiza por triplicado, más el blanco

4
 Una vez prepara las soluciones:
1. Adicionar a cada tubo 0.5mL del reactivo DNS.
2. Agitar todas las muestras.
3. Llevar a ebullicion las muestras en baño de maría por 5 minutos.
4. Enfriar en agua con hielo.
5. Adicionar 5.0mL de agua destilada.
6. Agitar y dejar en reposo por 5 minutos.
7. Leer a 540nm en el espectrofotómetro.
8. Construir la curva de Concentración (g/L) respecto a Absorbancia y obtener la ecuación que describe
dicha curva.

1.6. Tratamiento de muestras

Adicionar 0.5mL de muestra estándar y agregar 0.5mL de reactivo DNS.
Agitar todas las muestras.
Colocar a ebullir las muestras en baño de maría por 5 minutos.
Enfriar en agua con hielo.
Adicionar 5.0mL de agua destilada.
Agitar y dejar en reposo por 10 minutos.
Leer a 540nm en el espectrofotómetro.
La concentración de azúcares reductores de la muestra se determina mediante la ecuación de la
curva estándar.
Recomendaciones: Si después de adicionar los 5.0mL de agua destilada a las muestras, la absor-
bancia no se encuentra en el intervalo de la curva de calibración realizar una dilución, 0.5mL de muestra
y 0.5mL de H2 O.

2. Determinación de proteínas por el método de Bradford (Wal-

ker, 2002)
2.1. Objetivo
Determinar la cantidad de proteína presente en un complejo enzimático.

2.2. Marco teórico

De todas las moléculas de importancia biológica, las proteínas están entre las moléculas que más se
estudian por ser las más versátiles; muchas, como las enzimas y las inmunoglobulinas, tienen actividad
biológica, otras son proteínas de transporte que facilitan o controlan el movimiento de sustancias a través
de las membranas en las células.

Existen varios métodos de análisis cuantitativo para determinar la cantidad de proteína en una mues-
tra. Que método utilizar dependerá de la cantidad de proteína esperada, si la muestra analizada debe
ser recuperada o si la muestra puede ser destruida. Los métodos desarrollados para medir el contenido
proteico en una muestra están basados en las determinaciones de nitrógeno, en los enlaces peptídicos,
en los aminoácidos aromáticos, en la absortividad en la región UV, en los grupos amino libres, en la
dispersión de la luz o en la capacidad de adhesión de ciertos colorantes.

Uno de los métodos comúnmente usados es el método de Bradford (Comassie Blue): Se basa en la
unión del colorante Azul de Comassie a las proteínas. El colorante existe en dos formas, una azul y otra
naranja. Las proteínas se unen a la forma azul para formar un complejo proteína-colorante. El tinte
azul de Comasie G-250 tiene absorción máxima a 465nm; al unirse a la proteína absorbe a 595nm. El
colorante azul de Coomassie se une principalmente a los residuos de amino ácidos básicos y aromáticos,
especialmente arginina.

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2.3. Equipos, materiales y reactivoss
Espectrofotómetro

Celdas de vidrio y de cuarzo

Pipetas de 10µL-100µL y de 1mL a 5mL y sus respectivas puntas
Bomba de vacío
Beakers

Probeta
Matraz aforado de 50mL, 100mL, 1L
Agitador magnético

Plancha de agitación
Papel Whatman N◦ 1
Tubos de ensayo
Recipiente de almacenaje del reactivo de Bradford oscuro

Balanza analítica.
Etanol absoluto (99,9 %)
Ácido fosfórico (85 %)

Azul de coomassie G250

Agua Destilada
Estándar de proteína Albúmina de Suero Bovino (ABS) 1mg/mL

2.4. Preparación del colorante reactivo coomassie blue brilliant G-250

Para 500mL de Colorante Reactivo, se disolvió 50mg de Coomassie Blue Brilliant G-250 en 25mL de
etanol al 95 %. Se añadió a esta solución 50mL de ácido fosfórico 85 % (w/v). Finalmente, en un balón
de 500mL adicionar la solución resultante y aforar el volumen con agua destilada. Agitar en la plancha
magnética por 5 minutos. Filtrar en montaje de vacío con papel Whatman N◦ 1 y depositar en frasco
oscuro o ámbar a temperatura ambiente, éste es estable por semanas, sin embargo, el colorante tiende a
sedimentar, así que antes de su uso debe ser filtrado.

2.5. Preparación curva de calibración de ABS

Patrón de albúmina: disolver 10mg de albúmina de suero bovino en 10mL de agua destilada, con lo
que tenemos una solución stock con una concentración de 1mg/mL.

Tomar 162 tubos de ensayo y depositar en cada uno de ellos las cantidades de solución de albúmina
preparada y agua que se observan en la Tabla 2.

Tabla 2. Concentraciones de ABS para elaboración de curva de calibración.

Concentración(mg/mL) H2 0(µL) Patrón BSA3 (µL) Volumen Total (µL)
Blanco 100 0 100
0.2 80 20 100
0.4 60 40 100
0.6 40 60 100
0.8 20 80 100
1.0 0 100 100

Una vez preparadas las soluciones:

2 Cada concentración se realiza por triplicado, más el blanco

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 1. Adicionar 3.0mL de reactivo de Bradford.
2. Dejar en reposo por 5 minutos (es estable hasta por 1 hora) y leer la muestra en el espectrofotómetro
a 595nm.
3. La curva es no lineal, y los valores de absorbancia dependen de la edad del reactivo, por consiguiente,
es esencial hacer la curva de calibración para cada ensayo.

4. Construir la curva de Concentración (mg/mL) respecto a absorbancia y obtener la ecuación que

describe dicha curva.

2.6. Preparación de muestras

Hacer una dilución de la muestra de modo que al realizar la lectura se encuentre dentro de la curva
de calibración, luego tomar 100µL de muestra y 3mL de reactivo de Bradford.
Dejar en reposo por 5 minutos (es estable hasta por 1 hora) y leer la muestra en el espectrofotómetro
a 595nm.

La curva es no lineal, y los valores de absorbancia dependen de la edad del reactivo, por consiguiente,
es esencial hacer la curva de calibración para cada ensayo.
La concentración de proteína en la muestra en la muestra se determina mediante la ecuación de la
curva estándar.

Recomendaciones: Si después de adicionar los 3.0mL de reactivo de Bradford a las muestras, la absor-
bancia no se encuentra en el intervalo de la curva de calibración realizar una dilución, 0.5mL de muestra
y 0.5mL de H2 O.

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 MEDIOS DE CULTIVO Y MICROORGANISMOS

3. Preparación de medios de cultivo

3.1. Objetivo
Identificar microorganismos morfológicamente aislados de diferentes fuentes.

3.2. Marco teórico

Los medios se clasifican de acuerdo con su origen, consistencia, composición y función
(Campuzano Montoya, 1999).

3.2.1. Clasificación acuerdo a su origen

Medios de cultivos Naturales: se preparan a partir de sustancias de origen animal

o vegetal de composición química no rigurosamente constante: leche, suero, mace-
rado de maíz, peptonas, extractos de carne, levadura. Son aptos para el cultivo de
quimiorganotrofos.
Medios de cultivos Sintéticos: estrictamente definidos desde el punto de vista químico,
generalmente se usan para cultivar fotótrofos y quimiolitótrofos.
Medios de cultivos semi-sintéticos: son aquellos a los que se les añaden factores de
crecimiento bajo una forma de extracto orgánico complejo, como por ejemplo extracto
de levadura.

3.2.2. Clasificación de acuerdo con su consistencia

Dependiendo de la adición o no de un agente solidificante, como el agar que es un

polímero de azúcares obtenido de algas rojas (Gellidium y Gracillaria, entre otros). Se
trata de una molécula insoluble en agua fría, pero soluble en agua caliente. Es utilizado
por sus propiedades físicas únicas al fundirse a 100◦ C, permaneciendo líquido y se vuelve
gel por debajo de 50◦ C no es metabolizado por las bacterias de interés.
Medios de cultivo líquidos: (sin agar-agar), los que presentan este estado se denomi-
nan caldos. Por ejemplo, el caldo nutritivo, caldo cerebro corazón (BHI).
Medios de cultivo sólidos: se preparan a partir de los medios líquidos, agregándoles
el agar en una concentración entre 1.5 y 2 %p/v, formando un gel firme entre 32◦ C
y 39◦ C. Estos medios permiten el aislamiento y observación de las colonias.
Medios de cultivo semi-sólidos: se preparan a partir de los medios líquidos, agregando
a éstos el agar en una concentración entre 0.2 y 0.3 %p/v de agar. Uno de sus usos
es la observación de la movilidad de las bacterias.

3.2.3. Clasificación acuerdo a su composición

Son aquellos que presentan una serie de sustancias que los hacen simples o específicos.
Medio de cultivo básico: incluyen una formula nutritiva simple como son: extracto de
carne, extracto de levadura, peptona, carbohidratos y trazas de sales para permitir
el crecimiento de microorganismos poco exigentes. A partir de estos componentes se
pueden preparar los otros tipos de medios de cultivo, por la adición de los colorantes,
las proteínas, los antibióticos, los aminoácidos, entre otros. De acuerdo al uso de cada
uno.

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 Medios de cultivos enriquecidos: son aquellos elaborados a partir de leche, sangre,
huevo, o líquidos corporales y extractos proteicos y permite el cultivo de bacterias
exigentes. Este tipo de medio se clasifican según su función en:
• Medios de cultivo de enriquecimiento: son medios líquidos que incorporan una
serie de factores indispensables para el crecimiento de microorganismos exigentes,
incapaces de sintetizar aminoácidos, vitaminas u otros elementos necesarios para
su metabolismo. Su fin es recuperar aquellos microorganismos estresados o que se
encuentran en muy poca cantidad. Como ejemplo se tiene Caldo cerebro corazón
(BHI), peptona buferada, caldo tetrationato.
• Medios de cultivo selectivos: son medios sólidos que, de manera parecida a los an-
teriores, permiten el desarrollo de ciertos microorganismos e impiden el desarrollo
de otros, cuando se le añade alguna sustancia o compuestos químicos selectivos
del microorganismo de interés o inhibidores de aquellos que alteran el estudio.
Estas sustancias pueden ser antibióticos, sales biliares; entre otros.

Medios de cultivo diferenciales: permiten demostrar características metabólicas de un

determinado grupo de microorganismos. Como es la fermentación de carbohidratos,
la asimilación de aminoácido, la producción de un metabolito en especial. La clave es
incluir en la fórmula, el sustrato adecuado para la característica metabólica que desea
estudiar y un sistema indicador que refleje por variación de color u otro fenómeno
perceptible, los cambios que hayan tenido lugar.
Medios de cultivo de transporte: se utilizan para transportar frotis o muestras de
microorganismos conservándose su viabilidad y las características bioquímicas y fi-
siológicas. Se ha observado que la carencia de una fuente de nitrógeno impide consi-
derablemente la multiplicación de estos microorganismos.

3.2.4. Saccharomyces Cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae es una levadura unicelular y eucariótica, de forma esférica

u ovalada y su tamaño varía entre 5 y 10 micras dependiendo de la edad, Figura 3. La
reproducción de la levadura se realiza por vía asexual mediante duplicación celular y el
tiempo de reproducción varía entre 2 y 3 horas. Cada célula puede reproducirse entre 4 y
5 veces (Domingues and Flavia, 2013).

Figura 3. Saccharomyces Cerevisiae (Domingues and Flavia, 2013).

Tiene la propiedad de producir, en un medio rico en carbohidratos y en ausencia de

oxígeno, alcohol etílico (C2 H5 OH) y dióxido de carbono (CO2 ). Esta levadura requiere
nutrientes como: carbono, nitrógeno, fósforo, oxígeno, y micro-nutrientes como el calcio,
magnesio, zinc, vitaminas, entre otros. Las levaduras son microorganismos facultativos, lo
que significa que tienen la capacidad de vivir en presencia o ausencia de oxígeno, es decir,

9
aerobia o anaeróbicamente.

Metabolismo aeróbico: La levadura utiliza el mecanismo de respiración o ruta metabó-

lica aeróbica con el fin de obtener energía para crecer y reproducirse. La fuente de energía
la constituyen los azúcares fermentables (glucosa y fructosa) que son absorbidos a través
de la pared celular, al igual que el oxígeno. Dentro de la célula se desencadenan una serie
de reacciones bioquímicas donde los principales productos son la energía en forma de mo-
lécula de ATP (Adenosin Trifosfato) y CO2 , el cual se envía hacia el exterior de la célula
a través de la pared celular. La energía obtenida de la molécula de ATP se utiliza en el
crecimiento y reproducción de la célula.

Metabolismo anaeróbico: Este proceso se lleva a cabo en ausencia de oxígeno. La leva-

dura absorbe, a través de la pared celular, los azúcares fermentables (glucosa y fructosa) y
desarrolla una serie de reacciones bioquímicas cuyos productos son alcohol etílico (etanol),
CO2 , glicerol y succinato; los cuales son enviados al exterior de la célula por medio de la
pared celular. Los productos generados en mayores proporciones durante este proceso son
el etanol y el CO2 . Este mecanismo lo usa la célula únicamente para su conservación y no
para su crecimiento ni reproducción.

3.2.5. Factores que afectan la levadura

Como principales factores que afectan la levadura se presentan los contaminantes bac-
terianos, Figura 4, generalmente se encuentran en procesos fermentativos y son de varios
tipos:
Bacterias gram positivas: Células en forma de cocos y bacilos, productoras de ácido
láctico, generalmente prefieren condiciones anaeróbicas y son acidotolerantes. Entre
éstas tenemos: Lactobacillus, Pedicoccus y Leuconostoc.
Bacterias gram negativas: Células en forma de bacilos, oxidan el etanol a ácido acéti-
co, son aerobias obligadas, causan problemas serios en la propagación de la levadura
y son acido-alcohol tolerantes. Algunas de ellas son Acetobacter, Gluconobacter y
Zymomonas.
Otro tipo de bacterias Gram negativas, aerobias facultativas, que se consideran con-
taminantes son: Coliformes totales como el Aerobacter que produce ácido a partir de
la glucosa.

Figura 4. Interacción entre levaduras y bacterias heterofermentativas (Domingues and Flavia, 2013).

3.2.6. Coloración de gram

La coloración de gram, es una técnica diferencial que utiliza dos colorantes básicos
un mordiente y un decolorante. Se caracteriza por no teñir de forma homogénea a todas

10
las especies bacterianas; clasificando las bacterias en dos grandes grupos gram positivas y
gram negativas, según retengan o no el colorante primario usado en la tinción (Domingues
and Flavia, 2013).

La técnica permite agrupar las bacterias en gram Negativas y gram Positivas, se di-
ferencian entre sí por la composición química de la pared celular y su permeabilidad. La
pared de las gram negativas es más delgada y presenta un contenido lipídico diez veces
mayor que el de las gram positivas, lo cual dificulta la tinción y la retención del colorante
en el citoplasma.

El cristal violeta y la safranina o fuscina, actúan como colorante primario y secundario

respectivamente y requieren de un mordiente llamado Lugol, que fija el cristal violeta a
la pared celular para evitar ser decolorado con el alcohol acetona; donde ambos grupos
bacterianos se observan de un azul más fuerte. El alcohol acetona, actúa como decolorante
al eliminar la capa externa lipídica de la pared celular de las gram Negativas y como esta
presenta solo una monocapa de Peptidoglicano, se generan grandes poros por donde se
elimina el cristal violeta; en cambio las gram Positivas, no se ven afectadas por la acción
del decolorante, debido a que no presentan la capa externa lipídica, pero si varias capas
de Peptidoglicano, el cual se deshidrata formando poros pequeños evitando la salida del
colorante. En consecuencia, las Gram Negativas se decoloran y las gram Positivas retienen
el colorante. La safranina, colorante secundario tendrá la función de hacer el contraste al
teñir las bacterias gram Negativas decoloradas en el paso anterior.

Durante el desarrollo de esta práctica se trabajará con microorganismos empleados en la

producción de bioetanol, levadura S. cerevisiae, bacterias gram positivas y gram negativas.
Durante el proceso de fermentación los nutrientes que se encuentran en el medio de cultivo
se transforman debido a la acción de las células, en tres productos principales: etanol, CO2
y nuevas células (Biomasa). Todos los elementos teóricos necesarios para el desarrollo de
esta práctica ya fueron adquiridos en el curso de fundamentos de biotecnología. Por lo
tanto, deberán sustentar durante el desarrollo de la práctica, las actividades a realizar.

3.3. Materiales y reactivos

Equipos y materiales de laboratorio día 1: incubadora, erlenmeyer de 100mL,
asas para inoculación, mechero de alcohol, autoclave. Reactivos día 1: Extracto de
levadura, glucosa, extracto de malta, peptona para preparar el extracto YPD, células
de S. cerevisiae, agar eosina y azul de metileno (EMB ), agar Nutritivo, agar de papa
y dextroxa (PDA).
Equipos y materiales de laboratorio día 2: Microscopio (porta y cubre objetos).
Reactivos día 2: agua destilada, cristal violeta, lugol, alcohol acetona, fucsina.

3.4. Procedimiento

Día 1. Inoculación de medios de cultivo

3.4.1. Preparación de medios de cultivo YPD

Para el medio sólido: Se debe pesar la cantidad necesaria de nutrientes requeridos

para un volumen total de cultivo de 15mL. por lo tanto una vez se pesen y solubilizan
los nutrientes indicados en la Tabla 3, estos se aforan a un volumen total de 15mL. Con
el fin de preparar un medio sólido se debe agregar 20g/L de agar-agar, antes de aforar el
volumen.

11
 Tabla 3. Composición del medio de cultivo YPD.
Sustancia Concentración (g/l)
D-Glucosa 10
Extracto de levadura 3
Extracto de Malta 3
Peptona 5

Una vez preparados los medios de cultivo, se rotulan los erlenmeyers con cinta de en-
mascarar y marcador y se calienta en plancha de calentamiento a temperatura moderada,
durante 3min para solubilizar el agar.

Nota: Para los demás medios de cultivo sólidos se debe preparar la misma cantidad
que el medio YPD, siguiendo las especificaciones de cada uno.

Para el medio líquido: Se debe pesar la cantidad necesaria de nutrientes requeridos

para un volumen total de cultivo de 50mL de acuerdo a la Tabla 3, una vez solubilizados
los componentes y esterilizado el medio, se adiciona una cantidad necesaria para una
concentración de 4g/L de levadura.

3.4.2. Esterilización

Después de preparar los medios de cultivo, estos se esterilizan en autoclave protegiendo

la boquilla de los erlenmeyers con un tapón de algodón. Adicionalmente se esterilizan 12
cajas de Petri, y asas de inoculación. La esterilización se lleva a cabo a 121◦ C (15psi)
durante 15min, sin embargo, el autoclave requiere alrededor de 40min. en llegar al valor
de temperatura deseada (tener la autoclave en calentamiento al inicio de la práctica).

3.4.3. Inoculación

Una vez esterilizados los medios de cultivo sólidos se dejan enfriar hasta aproxima-
damente 50◦ C (tolerable al tacto), después se sirven las cajas de petri aproximadamente
5mL de medio por cada caja de petri de 5cm de diámetro. Los medios servidos en las
cajas de petri se dejan en reposo hasta que el agar se solidifique.

Microbiota del medio ambiente:

Tomar un hisopo en solución salina.

Frotar sobre la superficie, mesa, pared, suelo, baños, etc.
Proceder a inocular el medio de cultivo.
Tapar e invertir la caja de petri con el medio de cultivo marcado.
Incubar el medio de cultivo s 37◦ C de 24 horas a 48 horas.
Microbiota del cuerpo:

Tomar un hisopo envuelto en papel kraft y destaparlo al lado del mechero.

Introducir el hisopo humedecido en solución salina estéril.
Pasar el hisopo por la cavidad bucal.
Proceder a inocular el medio de cultivo.
Tapar e invertir la caja de petri con el medio de cultivo marcado.
Incubar el medio de cultivo s 37◦ C de 24 horas a 48 horas.
Si es posible observar cada 24 horas.

12
3.4.4. Determinación de biomasa por espectrofotometría

La determinación de biomasa se lleva a cabo por espectrofotometría midiendo la absor-

bancia a una longitud de onda de 600nm para S. Cerevisiae, para el cálculo de la biomasa
en (g/L) el valor de la absorbancia se reemplaza en la ecuación de la curva de calibración
realizada con antelación (ver anexos). Se siguen los pasos a continuación:
Tomar l.0mL de muestra en tubos eppendorf.
Centrifugar a 7000rpm por 10minutos.
Eliminar el sobrenadante.
Adicionar 1mL de solución salina al pellet centrifugado y re-suspender con ayuda de
un vortex.
Diluir la solución de biomasa en solución salina isotónica si es necesario.
Medir absorbancia a la longitud de onda requerida según el microorganismo, usando
como blanco solución salina isotónica.
Mediante interpolación con la curva de calibración se puede estimar la concentración
en peso seco dada una determinada absorbancia.

3.4.5. Determinación de biomasa por peso seco

Se toma 1.0mL de medio de cultivo y se lleva a un tubo eppendorf previamente

secado a 105o C y pesado.
Se lleva a estufa a 105 o C durante 12 horas.
Pesar y realizar los cálculos correspondientes:

peso eppendorf con biomasa − peso eppendorf vaco

Concentracion peso seco(g/L) =
V olumen total
Reemplazar el dato de la concentración de peso seco en la curva de calibración y
determinar el tiempo de cultivo del microorganismo (Ver anexos).

Día 2. Tinción de gram

3.4.6. Tinción de gram

Este procedimiento se desarrollará con las colonias sembradas en las cajas de Petri
para la levadura y una bacteria. Con este fin se deposita en un portaobjetos limpio una
gota de agua destilada, luego se toma con el asa estéril una colonia de cultivo y se hace
una emulsión con la gota, después se fijan las células con calor (llama de mechero) y se
fija la muestra, se agregan los colorantes en el siguiente orden:
Hacer un frotis de las colonias bacterianas.
Fijar el frotis con calor, deslizando el portaobjetos sobre la llama del mechero.
Agregar cristal violeta durante un minuto.
Lavar con agua, para eliminar el exceso de colorante.
Cubrir con lugol durante un minuto y lavar con agua.

13
Cubrir el frotis con alcohol-acetona, durante 20 segundos y lavar rápidamente con
agua.
Agregar fucsina durante un minuto.
Lavar con agua el exceso de colorante y dejar secar, poner el cubreobjetos.
Observar al microscopio.

14
 DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

4. Objetivo
4
Determinar la actividad enzimática de la enzima Cellic R CTec2

5. Introducción
El siguiente método describe el procedimiento para medir la actividad de la celulasa
usando las directrices de la Unión Internacional de Química Pura y Aplicada (IUPAC).
El procedimiento ha sido diseñado para medir la actividad de la celulasa en términos de
unidades de papel de filtro (FPU) por mililitro de solución de enzima original (sin diluir).
Para obtener resultados cuantitativos, la preparación de las enzimas debe ser comparada
sobre la base de una conversión significativa e igual. El valor de 2,0 ha sido designado
como el punto de intercepción para calcular los valores de unidades de celulosa de papel
mg de azúcar reductor como glucosa a partir de 50 mg de papel filtro (4 % de conversión)
en 60 minutos fltro (FPU) por la IUPAC.

Es muy importante tener en cuenta que el FPU sólo se define en este grado de con-
versión. El rendimiento de azúcar reductor no es una función lineal de la cantidad de
enzima dosificada en la mezcla de ensayo, como lo discute Ghose (1987), es decir, se pone
dos veces la cantidad de enzima no se va a producir dos veces la cantidad de azúcares
reductores en un tiempo igual. El procedimiento consiste entonces en encontrar una dilu-
ción de la solución de enzimas original tal que una alícuota de 0.5 mL de dicha dilución
catalizará el 4 % de la conversión en 60 minutos, (o, en términos prácticos, encontrar dos
puntos de dilución, tales que enmarquen el punto del 4 % de conversión tan cerca como
sea posible) y calculando después la actividad (FPU/mL) de la solución original desde la
dilución requerida.

En algunos casos, las mezclas de ensayo pueden contener algunos azúcares reductores
que no están relacionados con la hidrólisis enzimática de enlaces glucosídicos del sustrato.
Cultivos filtrados a los cuales quiere medirse la celulasa pueden contener azúcar como
nutriente, y los extremos reductores del polímero de celulosa del sustrato a veces pueden
ser medibles como equivalentes de glucosa antes de cualquier ataque enzimático. Por esta
razón los controles (a) enzima sin sustrato y (b) sustrato sin enzima son incluidos en los
valores de todos los demás ensayos y los valores de las muestras se corrigen para cualquier
valor en blanco.

6. Equipos, materiales y reactivos

Baño de maría capaz de mantener 50◦ C ± 0.1◦ C
Espectrofotómetro
Centrífuga
Balanza analítica
pHmetro y agitador magnético
Plancha para mantener agua a punto de ebullición
4 El siguiente procedimiento es una adaptación de la norma NREL/TP-510-42628 (Laboratory Technical Report) por la

National Renewable Energy.

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Micropipetas de 1000 µL, 100 µL
Puntas para micropipetas
Celda de cuarzo para espectrofotómetro
Papel filtro Whatman No. 1
Frasco lavador
Balde mediano para baño de agua helada
Olla para hervir en plancha
Hielo
Guantes
13 eppendorf (para centrifugar los tubos que tengan sustrato)
1 balón de 20 mL para preparar solución stock de glucosa
1 balón de 10 mL para prepara solución stock de enzima
8 tubos falcon (para preparar diluciones de glucosa y enzima)
Agua destilada
30 tubos de ensayo (12 para la curva de glucosa y 12 para los ensayos con filtro
whatman con las 4 diluciones de enzima + 4 para los blancos de dilución de enzima
+ 2 tubos para controles de DNS y sustrato)
Reactivo DNS:
Mezclar :
• Agua destilada: 198.93 mL
• Ácido 3,5-Dinitrosalicílico: 1.49 g
• Hidróxido de sodio: 2.78 g
Disolver antes y mezclar:
• Tartrato de sodio y potasio: 42.99 g
• Fenol (derretir a 50◦ C): 1.07 mL
• Metilsulfito de sodio: 1.17 g
Bufer Citrato: Los ensayos de celulasa se llevan a cabo en una solución buffer de
citrato 0.05 M y pH 4,8. Para otras enzimas celulasa, el pH y la temperatura de
ensayo pueden ser diferentes. Las condiciones a las cuales se llevan a cabo los ensayos
deben de definirse cuando se reportan los resultados. Las siguientes cantidades son
las necesarias para preparar 100 mL de solución stock:
• Monohidrato de ácido cítrico: 21 g
• Agua DI: 75 mL
• NaOH-hasta pH igual a 4.5: 5 a 6 g
Pesar 21g de monohidrato de ácido cítrico en un beaker y luego traspasarlo con un
embudo a un balón de 100 mL. Pesar aparte y adicionar entre 5:6g de hidróxido de
sodio (NaOH) en perlas al balón, luego aforar con agua desionizada hasta completar
el volumen agitándose con magneto en el agitador magnético. Chequear el pH para
que quede a 4.5 y adicionar más NaOH en caso de requerirse. De esta solución stock
se deben tomar 5 mL y verter en un balón de 100 mL, aforar con agua destilada para
generar la concentración de 0.05 M. Ajustar el pH a 4.8 unidades.

16
7. Procedimiento para el ensayo de papel de filtro para celulasa
sacarificante
Nota: Antes de iniciar el proceso se recomienda prender el baño María a 50◦ C, verificar
que hay hielo, encender el espectrofotómetro y alistar olla para ebullición.

La detección de la rotura del enlace glucosídico por este método implica el tratamiento
idéntico y en paralelo de tres tipos de tubos de ensayo (mezclas de ensayo, blancos y
controles, y estándares de glucosa) preparados como se detalla a continuación. El sustrato
es una tira de papel de filtro Whatman N◦ 1 de 50 mg (0.05 g) (Tira:1.0x5.0 cm).

7.1. Tubos de ensayo sacarificante

Colocar una tira de papel de filtro enrollada en 13 tubos de ensayo.
Preparar la solución stock de enzima: En un balón de 20 mL adicionar 0.1 mL (100
µL) de enzima y aforar con solución buffer citrato. Agitar y reservar.
Para construir la curva de dilución de enzima se deben seleccionar al menos cuatro
puntos5 . Para este caso por la experiencia del laboratorio se ha identificado tres di-
luciones que se realizan a partir de la solución madre de enzima del paso anterior en
tubos falcon de 50 mL:

E1 = 400µL enzima + 3600µL buffer

E2 = 1000µL enzima + 3000µL buffer
E3 = 2000µL enzima + 2000µL buffer
E4 = Solución de enzima stock

Adicionar a cada tubo 1.0 mL de buffer citrato pH 4.8und, verificando que la solución
buffer sature la tira de papel de filtro.
Equilibrar los tubos con solución buffer y sustrato a 50◦ C por 10 minutos aproxima-
damente (hacerlo junto a los estándares de glucosa).
De cada En tomar 0.5 mL (500 µL), colocarlo en el tubo de ensayo previamente
equilibrado (realizar este paso por triplicado).

7.2. Blancos y controles

Blanco de DNS: 1.5 mL de buffer citrato.
Control de Enzima: 0.5 mL de cada En propuesta y 1.0 mL de buffer sin sustrato.
Control de sustrato: 1.5 mL buffer y sustrato (papel filtro).

7.3. Estándares de glucosa

Preparar 20 mL de una solución de glucosa anhidra (10 mg/mL): Se debe pesar en
un balón de 20 mL, 0.2 g de glucosa anhidra, aforar el balón con agua destilada y
agitar en vortex. Si fuera monohidratada hacer corrección: 0.1 g de glucosa anhidra
equivalen a 0.11 g de glucosa monohidratada; por lo tanto, se deben adicionar 0.22
g de glucosa monohidratada para obtener la concentración de 10 mg/mL.
5 Al menos dos diluciones deben de ser realizadas con cada una de las muestras de enzima, con una dilución liberando

un poco más de 2mg de glucosa (cantidad absoluta) y ligeramente inferior a 2.0mg de glucosa. Tener como objetivo 2.1
y 1.9mg de glucosa, respectivamente. Dependiendo de la enzima, estos objetivos pueden ser difíciles de alcanzar y deben
hacerse más diluciones.

17
 Realizar las siguientes 4 diluciones6 a partir de la solución stock de glucosa en tubos
falcon de 50 mL (son sugeridos para poder ingresar posteriormente la micropipeta):

G1 = 2.0mL glucosa+1mL buffer=1:1.5=6.7mg/mL (3.35mg/0.5mL)

G2 = 1.0mL glucosa+1.0mL buffer=1:2=5mg/mL (2.5mg/0.5mL)
G3 = 1.0mL glucosa+2.0mL buffer=1:3=3.3mg/mL (1.65mg/0.5mL)
G4 = 1.0mL glucosa+4.0mL buffer=1:5=2mg/mL (1.0mg/0.5mL)

De cada Gn tomar 0.5 mL (500 µL), colocarlo en el tubo de ensayo (realizar este
paso por triplicado).
Adicionar a cada tubo 1.0 mL de buffer citrato pH 4.8und.
Incubar todos los tubos de ensayo (blancos, controles, enzima y glucosa) en baño
maría a 50◦ C por 60 minutos exactamente 7 .
Al final del periodo de incubación, remueva los tubos de ensayo del baño a 50◦ C
y detenga la reacción de la enzima, añadiendo inmediatamente 3.0 mL de reactivo
DNS a cada tubo y mezcle.

7.4. Desarrollo del Color (Miller, 1959)

Hervir todos los tubos durante exactamente 5.0 min en un baño de María en el punto
de ebullición, con suficiente agua que cubra la porción de los tubos ocupada por la
mezcla de la reacción y el reactivo DNS. Todas las muestras, controles, blancos y
estándares de glucosa deben ser hervidos juntos.
Mientras transcurren los 5 minutos, colocar en un balde mediano agua con hielo para
el siguiente paso. Luego de los 5 min, transfiera todos los tubos de ensayo a un baño
de agua helada hasta que se enfríen.
Agite muy bien cada tubo que contenga papel, centrifugue todos los tubos a 10.000
rpm por 5 min.
Con las celdas se debe determinar la formación de color midiendo la absorbancia
a 540nm. Se prende el espectrofotómetro y se deja estabilizar por 15min hasta que
aparezca en la pantalla el valor de absorbancia; en caso que no sea 540nm se puede
acomodar con las teclas llamadas "nm arriba/nm abajo".
Diluya todos los tubos (ensayos, blancos, controles y estándares) (0.1 mL (100 µL) de
la mezcla colorida + 2.5 mL de agua destilada en una celda para espectrofotómetro,
no olvide mezclar la solución final con la punta de la pipeta). Se inicia con el blanco
del reactivo DNS, realizar la medición y tarar el espectrofotómetro en cero; continúe
con la medición del resto de tubos. Con esta dilución, los estándares de glucosa
descritos anteriormente deberían proporcionar una absorbancia en el rango de 0.1 a
1.0.

8. Cálculos
Construir una curva lineal de glucosa estándar lineal utilizando las cantidades absolu-
tas de la glucosa (mg/0.5mL) en función de A540. Los datos para la curva estándar deben
de ajustarse a una línea recta, con un coeficiente de correlación para esta línea cercano a
6 Para los factores de dilución se tiene como ejemplo el caso G1: 1.5=3(total de líquido glucosa+buffer)/2(cantidad de

glucosa que es la muestra que se quiere diluir). Este 1.5 es el factor de dilución que se le debe multiplicar al resultado.
7 Al final se tendrán 30 tubos en total (Para las 4 diluciones por triplicado de enzima (12), los controles de cada dilución

de enzima (4), para las 4 diluciones por triplicado de glucosa (12), el control de sustrato (1) y el blanco de reactivo (1).

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1. Verificar la curva estándar con una verificación estándar de calibración, una solución
de glucosa preparada independientemente que contenga una cantidad conocida de glucosa
que cae sobre el punto medio de la curva estándar. Utilizando esta curva estándar, deter-
minar la cantidad de glucosa liberada en cada tubo de ensayo después de extraer el blanco.

Estimar la concentración de glucosa que ha liberado exactamente 2.0 mg de glucosa por

medio de una gráfica de glucosa liberada contra el logaritmo de concentración de enzima.
Para encontrar la concentración de enzima requerida, se toman dos puntos de datos que
estén muy cerca del punto de 2.0 mg y se dibuja una línea recta entre ellos, que servirá
para interpolar entre los dos puntos para encontrar la dilución de enzima que produciría
exactamente 2.0 mg de equivalentes de azúcar reductor.

Nota: en este gráfico y en la ecuación 8, el término “concentración de enzima” se refiere

a la proporción de la enzima original presente en cada dilución de enzima (es decir, el
número de mL se solución original presente en cada mL de dilución).

Para calcular FPU:

0,37
Actividad de papel filtro = unidades/mL
[Enzima] que libera 2, 0mg de glucosa
Donde [Enzima] representa la porción original de solución de enzima presente en la
dilución de enzima examinada directamente (esta dilución de la cual 0.5 mL son añadidos
a la mezcla de ensayo. La obtención de la ecuación anterior puede verse en (Ghose, 1987).

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9. Anexos
9.1. Curva de calibración de glucosa para DNS
Para la determinación de carbohidratos por DNS se debe realizar la curva de calibración
propuesta, para fines prácticos se entregan los datos de concentración y absorbancia a
partir de los cuales se puede construir.

Tabla 4. Datos para curva de calibración de glucosa.

Concentración (g/L) Absorbancia 1 Absorbancia 2 Absorbancia promedio
0,5 0,259 0,271 0,265
1,0 0,573 0,579 0,576
2,0 1,113 1,157 1,135
3,0 1,681 1,662 1,672
4,0 2,186 2,182 2,184

En la Figura 5 se observa la variación de color a medida que aumenta la concentración

de izquierda a derecha, tomando el primero como blanco, esto quiere decir que a medida
que aumenta la concentración el color tomará más fuerza.

Figura 5. Soluciones de la curva de calibración del método de DNS.

9.2. Curva de calibación de ABS

Al igual que en el item anterior para fines prácticos se presenta los datos para realizar
la curva de calibración de ABS.

Tabla 5. Datos para curva de calibración de ABS.

Concentración (mg/mL) Absorbancia 1 Absorbancia 2 Absorbancia 3 Absorbancia promedio
0.2 0.141 0.158 0.154 0.151
0.4 0.341 0.368 0.278 0.329
0.6 0.537 0.494 0.468 0.500
0.8 0.659 0.662 0.660 0.660
1.0 0.949 0.957 0.933 0.946

En la Figura 6 se observa la variación de color a medida que aumenta la concentración

de izquierda a derecha, tomando el primero como blanco, esto quiere decir que a medida
que aumenta la concentración el color se hará más intenso.

Figura 6. Soluciones de la curva de calibración del método de Bradford.

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9.3. Curva de calibración de biomasa S. Cerevisiae

Tabla 6. Curva de calibración para cuantificación de biomasa para S. Cerevisiae (Ethanol red).
Absorbancia Concentración de biomasa promedio (g/L)
0,1040 0,1019
0,1698 0,1415
0,2229 0,1755
0,3376 2719
0,4076 3113
0,5287 0,4245
0,8769 0,7698

9.4. Curva de calibración para cuantificación por peso seco S. Cerevisiae

Tabla 7. Curva de calibración para cuantificación de biomasa por peso seco S. Cerevisiae.
Tiempo (horas) Peso seco promedio (g/L)
0,0000 2,0395
2,9870 4,8026
6,0173 6,9079
9,0043 8,9474

9.5. Curva de estándares de glucosa para actividad enzimática

En la Tabla 8 se presentan los datos de Concentración (mg/0.5mL) y de Absorbancia
para construir la curva de estándares de glucosa.

Tabla 8. Datos para curva de estándares de glucosa para actividad enzimática.

Concentración
Absorbancia 1 Absorbancia 2 Absorbancia 3 Absorbancia prom
(mg/0.5mL)
1,0 0,091 0,095 0,090 0,092
1,65 0,135 0,158 0,137 0,148
2,5 0,226 0,214 0,232 0,220
3,35 0,286 0,295 0,305 0,291

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10. Bibilografía

Campuzano Montoya, O. I. (1999). Manual de microbiologia.

Domingues, M. and Flavia, P. (2013). Tipos de contaminações bacterianas presentes no
processo de fermentação alcoólica. pages 29–37.
Ghose, T. K. (1987). Determination of fluoride in various matrices. Pure and Applied
Chemistry, 59(5):695–702.
Miller, G. L. (1959). Use of Dinitrosalicylic Acid Reagent for Determination of Reducing
Sugar. Analytical Chemistry, 31(3):426–428.
Walker, J. M. (2002). The Protein Protocols Handbook, volume 3. New Jersey: Humana
Press.

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