QUÍMICA BIOLÓGICA GUÍA DE TRABAJOS PRÁCTICOS

Cátedra Química Biológica

Licenciatura en Genética

GUÍA DE TRABAJOS PRÁCTICOS

Equipo Docente:
Profesor Adjunto: Dr. Pablo Martina
Jefes de Trabajos Prácticos: Lic. Teresa Espinosa
Ing. Darío Ferreyra
Auxiliar de Primera: Dra. Adriana Alvarenga
Auxiliar Alumno: Nicole Freiberger

AÑO 2019

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Trabajo PrÁctico Nº 5
ESPECTROFOTOMETRIA UV – VISIBLE

OBJETIVOS:
• Conocer los fundamentos de la espectrofotometría para su utilización como recurso de
investigación.
• Lograr que el alumno aprenda a manejar este instrumento como una herramienta de
análisis, conociendo sus ventajas, cuidados y limitaciones.

FUNDAMENTOS TEÓRICOS:

• Introducción
• Propiedades de la luz
• Absorción de la luz
• El espectrofotómetro
• Errores en espectrofotometría
• Curvas de calibración
• Trabajo práctico

Introducción

Espectrofotometría: es cualquier procedimiento que usa la luz para medir la concentración de

compuestos químicos.

Instrumental:
Esquema de un espectrofotómetro convencional

• fuente
• monocromador
o ranura de entrada
o elemento de dispersión
o ranura de salida
• muestra
• detector

Aplicaciones: Dos propósitos diferentes

1. Análisis Cualitativo: Determinar el espectro de absorción de una sustancia pura.
2. Análisis Cuantitativo: Determinar la concentración de una solución.

Propiedades de la luz
La radiación ultravioleta (UV) y visible comprende una pequeña parte del espectro
electromagnético, entre 190 y 1000 nm.), que incluye otras formas de radiación como las de
radio, infrarrojo (IR), cósmica y rayos X.

Esta radiación o energía radiante se puede describir por sus propiedades ondulatorias, esto es:
Longitud de onda (): es la distancia entre dos máximos sucesivos de una onda; se mide en
nanómetros (nm) que equivale a 10-9 m.
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Frecuencia (): es el número de máximos de una onda que pasa en un punto del espacio en un
segundo, se mide en Hertz que corresponde a un ciclo por segundo (1/s).
que están relacionados por la velocidad de la luz c (2.998 * 10 8 m/s).
. = c
Además la energía radiante se comporta como si esta formado por paquetes de energía
llamados fotones.
La energía de los fotones depende de la frecuencia de la radiación y esta dada por la siguiente
relación.
E(fotón) = h (fotón) (h = 6.626 * 10-34 J.s es la constante de Planck )
Que podemos poner en función de la longitud de onda, esto es:
E = h c /
Absorción de la luz
Cuando una intensidad (I) de luz (esto es, energía por unidad de área y de tiempo) atraviesa un
espesor dx de disolución de concentración c sufre una absorción dI que es proporcional al
espesor, a la intensidad incidente y a la concentración de la disolución.
- dI  I c dx
expresión que podemos igualar agregando un parámetro k que será función de la naturaleza de
la sustancia y de la longitud de onda.
- dI = k I c dx
operando e integrando entre el espesor cero (intensidad incidente Io) y el espesor l (intensidad
transmitida I) se obtiene:
I = Io e-kcl
Esto es, la intensidad de luz transmitida.
A partir de esta expresión se define la: transmitancia T = I/ Io = e-kcl
Como la fracción de luz incidente que pasa a través de la muestra.
Como la transmitancia no es proporcional a la concentración de soluto se convierte la misma
en Absorbancia A (aplicando logaritmo) la cual si es proporcional a la concentración:
A = log10 (I/ Io = e-kcl )
A = -log10 T =  c l
Relación que se conoce como la ley de Beer
A=cl
Donde c es la concentración molar (moles/litro)  es
la absorción molar (lt/mol*cm). l longitud del camino
óptico (cm).
La ley de Beer es aplicable a soluciones diluidas de
concentraciones iguales o menores a 0.01 M (0.01
mol/lt) .

El espectrofotómetro
Un espectrofotómetro es un instrumento para medir la transmitancia o la absorbancia de una
muestra como una función de la longitud de onda de la
radiación electromagnética.
Las partes de un espectrofotómetro son:
o Una fuente que genera una radiación
electromagnética en un amplio rango de longitudes de
onda.
o Un equipo de dispersión que selecciona
una longitud de onda en particular ( en realidad
selecciona ancho de banda).
o Un compartimiento para la muestra.
o Uno o más detectores para medir la
intensidad de la radiación.
• Fuente
Una fuente ideal debería tener una intensidad constante para todas las longitudes de onda,
bajo ruido y una gran estabilidad térmica; desafortunadamente tal fuente no existe.

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Dos fuentes son las mas comúnmente usadas en espectrofotometría UV-Visible.

✓ La lámpara de deuterio:
Que tiene una buena intensidad continua en la región UV pero disminuye a medida que nos
acercamos a la región visible. Se la usa en el rango de 190 a 360 nm.
Con el tiempo de uso la intensidad de la luz de la lámpara disminuye rápidamente, teniendo
una vida media (tiempo en el cual su intensidad disminuye a la mitad de su valor inicial) de
1000 hs.

✓ La lámpara halógena de tungsteno:

Tiene buena intensidad en parte del espectro UV y en
todo el rango visible. Se la usa en el rango de 360 a
1000 nm y tiene una vida media de 10000 hs.

La mayoría de los espectrofotómetros usan ambos tipos

de lámparas para medir en el rango UV – Visible,
cambiando automáticamente de fuente de acuerdo a la
longitud de onda buscada.

• Elementos de dispersión
Un elemento de dispersión desvía las diferentes longitudes de onda de la radiación en
diferentes ángulos. Cuando se combina con una ranura de salida apropiada estos elementos
pueden ser usados para seleccionar una longitud de onda
en particular.
Dos son los más usados: a) prismas y b) redes de
difracción
o Prismas
Estos generan un arco iris a partir de la luz solar. Este
mismo principio es usado en los espectrofotómetros. Son
simples, económicos pero producen una dispersión angular
no lineal y además estos ángulos de dispersión son
sensibles a la temperatura.
Por esta razón los espectrofotómetros más modernos
contienen redes de difracción.

o Redes de difracción
Estos consisten en un gran número de líneas igualmente
espaciadas y paralelas entre sí, sobre una superficie de
vidrio a la que se aplica un recubrimiento de aluminio para crear una superficie reflejante.
La luz que incide sobre la red es reflejada en diferentes ángulos, dependiendo de la longitud de
onda. Además la dispersión angular es lineal y no depende de la temperatura.
Sin embargo, estos elementos reflejan la luz en diferentes órdenes, los
cuales se superponen; en consecuencia, se usan filtros o redes
cóncavas para dispersar y enfocar la radiación simultáneamente.
Un monocromador: consiste de una ranura de entrada, un elemento
de dispersión y una ranura de salida. Idealmente la salida de un
monocromador es una luz monocromática.
En la práctica, la salida es siempre una banda aguda simétricamente
distribuida. El ancho de banda a la media altura el ancho de
banda instrumental (SBB).

• Compartimiento para la muestra

La espectroscopia se usa para medir líquidos o soluciones.

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Las muestras se colocan en recipientes denominados cubetas o celdas para realizar las
mediciones.
Material: Idealmente las celdas deben ser completamente transparentes a todas las longitudes
de onda ya que cualquier absorbancia de la cubeta reduce el rango lineal efectivo para la
muestra.
Las celdas de más bajo costo son las de plástico, estas celdas no resisten a todos los
solventes y absorben fuertemente por debajo de 300 nm no pudiendo utilizarse para medir en
esta región.
Las celdas de vidrio son un poco más costosas que las de plástico pero
son más durables y resisten la mayoría de los solventes, sin embargo,
absorben fuertemente a partir de los 320 nm. Las celdas de cuarzo fundido
son razonablemente transparentes por debajo de 210 nm.
Las mejores celdas son hechas de sílice sintética fundida de alta pureza y
son transparentes por debajo de 190 nm.

Tipos de celdas
Hay una gran variedad de celdas disponibles pero las más usadas son:
a) La celda rectangular con extremo superior abierto con dimensiones internas
(camino óptico) que van desde 1 a 100 mm, la más popular es la de 10 mm.
b) La celda ranurada que es idéntica a la anterior pero se usa cuando los volúmenes
de las muestras son pequeño.

• Detectores
Un detector convierte una señal luminosa en una señal eléctrica, este puede ser un tubo
fotomultiplicador o un detector de fotodiodo.
Fotomultiplicador:
Es un tubo electrónico capaz de amplificar
significativamente una corriente. El cátodo esta construido
con un metal sensible a la luz capaz de absorber energía
radiante y emitir electrones en forma proporcional a la
energía radiante que hace impacto en la superficie del
metal sensible a la luz. Los electrones producidos en el
primer nivel de energía pasan a chocar con una superficie
secundaria donde cada electrón producen entre 4 a 6
electrones secundarios que va a otro nivel, repitiendo la
multiplicación de electrones hasta el nivel final donde llega
una corriente electrónica amplificada.
Fotodiodo:
En un fotodiodo la luz incide sobre un material
semiconductor y hace que los electrones fluyan a través del
mismo, de ese modo agota la carga de un capacitor
conectado a través del material. La cantidad de carga
necesaria para recargar el capacitor en intervalos regulares
es proporcional a la intensidad de la luz.
Algunos espectrofotómetros más modernos contienen
arreglo de diodos en lugar de un solo detector: este consiste
de una serie de diodos ubicados lado a lado sobre un cristal de silicona. Cada diodo tiene un
capacitor individual que esta conectado por un conmutador de estado sólido a una línea de
salida común. La cantidad de carga necesaria para recargar los capacitores es proporcional al
número de fotones detectado por cada diodo, el cual es proporcional a la intensidad de la luz.
De esta manera se obtiene el espectro de absorción midiendo la variación de la intensidad en
todo el rango de longitud de onda.
Un arreglo típico comprende entre 200 y 1000 elementos.

Tipos de espectrofotómetros
o Espectrofotómetro de simple haz:

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Primero se mide Io para una cubeta de referencia que contiene el solvente puro. Entonces se
reemplaza la cubeta de referencia por la cubeta que contiene la muestra a medir y se obtiene I.

o Espectrofotómetro de doble haz:

La luz pasa alternativamente a través de la cubeta de referencia y de la muestra. Un espejo
giratorio (choper) hace pasar la luz alternativamente entre las cubetas de muestra y de
referencia. En los procedimientos de rutina primero se registra un espectro de línea de base
con dos cubetas de referencia. Así la absorbancia de referencia es restada de la absorbancia
de la muestra para obtener la absorbancia verdadera de la muestra a cada longitud de onda.

Precauciones:
La mayoría de los espectrofotómetros operan mejor a A (absorbancia) entre 0.4 – 0.9.
Si la absorbancia es muy elevada la intensidad es difícil de medir.
Si la absorbancia es muy baja es muy difícil distinguir entre la referencia y la muestra.

Errores en espectrofotometría
La medición de las concentraciones se basa en la linealidad de la absorbancia con la
concentración, esto es, en la ley de Beer. Por lo tanto desviaciones a la ley son fuentes de
errores, esto sucede cuando:
o Se miden concentraciones muy elevadas.
o La energía de la radiación incidente no es monocromática.
o La absorción del solvente es significativa comparada con la absorción del soluto.
o La energía radiante es transmitida por otros mecanismos (luz errática).
o Los lados de las celdas no son paralelos

Curvas de calibración
En una curva de calibración la absorbancia es graficada como una función de una cantidad
conocida de un analito derivado de una muestra patrón.

Procedimiento para la construcción de una curva de calibración.

Paso 1: Preparar muestras de concentraciones conocidas de un analito cubriendo un rango de
concentración conveniente y medir la absorbancia (A) de estos patrones.

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Paso 2: Restar la absorbancia de la muestra de referencia si se uso un equipo de simple haz.

Paso 3: Hacer un gráfico de la absorbancia corregida versus la concentración de analito
analizado.

Ejemplo:
Se desea construir una curva de calibración para determinar la concentración de plomo en
agua potable. Se obtiene la siguiente información durante la medición de absorbancias a 427
nm.
Paso 1: Preparar patrones y medir sus absorbancias.
Se realizaron 3 repeticiones de cada patrón.

Patrón Concentración Absorbancia A A A (promedio)

(A)
1 0.100 0.923 0.929 0.926 0.926
2 0.060 0.681 0.682 0.677 0.680
3 0.030 0.453 0.454 0.453 0.453
4 0.004 0.258 0.257 0.265 0.260

Paso 2: Medición de la absorbancia del blanco y resta de la absorbancia de los patrones.

Si el espectrofotómetro es de doble haz no es necesario hacer este paso.

Blanco Concentración A A A A (promedio)

0.000 0.081 0.083 0.079 0.081

Patrón Concentración A (corregida)

1 0.100 0.845
2 0.060 0.599
3 0.030 0.372
4 0.004 0.179

Paso 3: Gráfico de datos y curva de calibración

a) Si se cumple la ley de Beer podemos obtener los parámetros de la ecuación que es una
línea recta.
Por regresión lineal obtenemos para A = m * C + b
Donde m = 6.96 y b = 0.16

b) Gráfico de absorbancia vs. Concentración:

Curva de Calibración
0,9
0,8
0,7
0,6
Absorbancia

0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0,000 0,050 0,100
Concentración

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MARCHA PRACTICA

Análisis cuantitativo de un compuesto

A. Experiencia
◼ Datos
o Solución patrón (std) cafeína, [ ]g/l
o Peso molecular (PM): 194,22 g/mol
o Peso de la muestra: W1= 0,9 g
o Concentración de la muestra a preparar: Cm= 0.5 (g/lt)
◼ Medir el espectro de Absorbancia del patrón en el rango de 200 – 400 nm
◼ Medir el espectro de Absorbancia de la muestra problema en el rango 200 – 400 nm

B. Evaluación
1. Determinar λmax de la solución patrón
2. medir Aλmaxstd
3. medir la absorbancia de la muestra a esa longitud de onda
4. Calcular la concentración de la muestra usando la ley de Lambert-Beer Aλ = ε c d
5. Determinar el % p/p de cafeína en la muestra

Problemas

1- Calcular la absorbancia de una solución con un 80% de tramitancia.

2- Calcular la absorbancia de una disolución cuya tramitancia es de 1%.
3- Calcular la tramitancia de una disolución cuya absorbancia es de 1.
4- Calcular la absorbancia a 340nm de una disolución 100 M de NADH, si su coeficiente de
absorción molar es de 6,22 x 103 M-1cm-1.
5- Una disolución de creatinina a 540nm manifiesta una absorbancia de 0,42 y en las mismas
condiciones experimentales un patrón de 1mg de creatinina en 100 ml presenta una
absorbancia de 0,57. Averiguar la concentración de la creatinina problema.
6- Una disolución de NADH tiene una concentración de 1mg/ml. la masa molecular del NADH
es 709. Calcular la absorbancia de esta disolución a 340 nm.  (NADH) = 6,22 x 103 M-1cm-1.
7- Se prepara una disolución de ATP-Mg puro (masa molecular = 529) de concentración 100
g/ml. La absorbancia medida a 259 nm resulta ser igual a 2,91. Calcular en estas condiciones
el coeficiente de absorción molar del ATP.
8- Para determinar la concentración de glucógeno en una muestra se produce la reacción
glucógeno-ioduro y a 450 nm en cubeta de 1 cm se mide una absorbancia de 0,25. En las
mismas condiciones una disolución de glucógeno patrón de concentración 10 mg/ml produciría
una absorbancia de 0,2.¿ Cuál es la concentración de la muestra?
9- Calcular el coeficiente de absorción (a 1cm 1%) a 328 nm de la vitamina A si una muestra de
esa sustancia de concentración 2 g/ml en cloroformo produce una absorbancia de 0,31.
10- Para determinar la concentración de creatinina en orina de tres pacientes A, B y C se
realiza la reacción de Haffe con una serie de patrones y con las orinas de estos pacientes
obteniendo los resultados de la siguiente tabla. Determinar gráficamente las concentraciones
de A, B y C.

Patrón A a 520 nm Problemas A a 520 nm

(mg/ml)
1 0,18 A 0,24
2 0,35
3 0,52 B 0,08
4 0,67
5 0,80 C 0,41