J Vis Exp. 2010; (44): 2259.

Publicado en Internet el
12 de octubre de 2010.
doi: 10.3791 / 2259 PMCID: PMC3185625 PMID: 20972413|
Benjamin JC Quah y Christopher R. Parish Departamento
de Inmunología, Escuela de Investigación Médica John
Curtin, Universidad Nacional de Australia
Correspondencia a: Christopher R. Parish at
Christopher.Parish@anu.edu.au Copyright © 2010,
Journal of Visualized Experiments Este es un artículo
de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons
AttributionNonCommercial-NoDerivs 3.0 Unported. Para ver una copia de esta
licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/

El uso de diacetato de carboxifluoresceína succinimidil éster (CFSE) para

controlar la proliferación de linfocitos
Resumen
El diacetato de carboxifluoresceína succinimidil éster (CFSE, por sus siglas en
inglés) es un medio eficaz y popular para controlar la división linfocitos. CFSE
marca de manera covalente las moléculas intracelulares de larga vida con el
colorante fluorescente, carboxifluoresceína.
Por lo tanto, cuando una célula marcada con diacetato de carboxifluoresceína
succinimidil éster (CFSE) se divide, su progenie está dotada con la mitad del
número de moléculas marcadas con carboxifluoresceína y, por lo tanto, cada
división celular puede evaluarse midiendo la disminución correspondiente en la
fluorescencia celular a través de la citometría de flujo.
La capacidad del diacetato de carboxifluoresceína succinimidil éster (CFSE)
para marcar poblaciones de linfocitos con una alta intensidad fluorescente de
varianza excepcionalmente baja, junto con su baja toxicidad celular, lo
convierten en un tinte ideal para medir la división celular. Dado que es un
colorante a base de fluoresceína, también es compatible con una amplia gama de
otros fluorocromos que lo hacen aplicable a la citometría de flujo de varios
colores.
Este artículo describe los procedimientos que se utilizan normalmente para
etiquetar linfocitos de ratón con el fin de monitorear hasta 8 divisiones
celulares en estudios in vitro e in vivo.
Palabras clave: Inmunología, Número 44, éster succinimidílico del diacetato de
carboxifluoresceína (CFSE), marcaje, linfocitos, Protocolo de proliferación.

1) Configuración del reactivo

1.1) Solución madre de diacetato de carboxifluoresceína succinimidil éster
(CFSE). El colorante diacetato de carboxifluoresceína succinimidil éster (CFSE)
se compra como diacetato de carboxifluoresceína éster succinimidílico (CFDA, SE)
(PM 557.47 g / mol), típicamente en viales de 25 mg.
Disuelva los 25 mg en 8,96 ml de DMSO para obtener una solución madre final de
5 mM (almacene en forma de alícuotas de 50-100 μL a -20 ° C durante varios
meses).
El diacetato de carboxifluoresceína éster succinimidílico (CFDA, SE)
reaccionará con la solución acuosa, por lo que es fundamental que se evite dicha
exposición durante el almacenamiento.
1.2) Aísle los linfocitos del bazo y / o los ganglios linfáticos de los ratones y
resuspenda en 1 ml de medio de cultivo (p. Ej., RPMI) con un 5% de suero fetal
bobino (SFB) inactivado por calor (FCS), con una concentración celular de entre
0.5x106 a 10x107/ mL.

2) Etiquetado diacetato de carboxifluoresceína succinimidil éster (CFSE)

 2.1) Método de rutina:
1. Resuspenda completamente las células en el volumen de 1 ml de medio y
colóquelas cuidadosamente en el fondo de un tubo cónico de 10 ml nuevo (no
humedecido).
2. Coloque el tubo horizontalmente (el uso de un tubo no humedecido evitará que
la suspensión de 1 ml de células se mueva y se mezcle prematuramente con las
soluciones de diacetato de carboxifluoresceína éster succinimidílico (CFDA, SE).
3. Con cuidado, agregue 110 μL de PBS a la parte no mojada del plástico en la
parte superior del tubo, asegurándose de que no haga contacto con la solución
celular.
4. Resuspender 1.1 μL del stock 5 mM de diacetato de carboxifluoresceína éster
succinimidílico (CFDA, SE) en el PBS de 110 μL.
5. Tapar rápidamente el tubo e invertir y agitar bien para obtener una mezcla
rápida y uniforme de las soluciones. Tenga en cuenta que el colorante CFSE se
encuentra en una concentración final de 5 μM, sin embargo, la concentración
óptima puede tener que determinarse para cada lote preparado y luego verificarse
cada 6 meses para asegurarse de que sea efectivo.
6. Incubar las células durante 5 minutos a temperatura ambiente. Tenga en
cuenta que después de la conversión de CFDA, SE a diacetato de
carboxifluoresceína succinimidil éster (CFSE) (ver discusión) el tinte se vuelve
fluorescente y, por lo tanto, propenso a la decoloración por exposición a luz
excesiva. Por lo tanto, es aconsejable proteger el tubo de la luz desde este
punto, por ejemplo, cubriéndolo con papel de aluminio.
7. Lave las células diluyendo en 10 volúmenes de PBS a 20 ° C que contengan 5%
de HI FCS, sedimentando por centrifugación a 300 xg durante 5 minutos a 20 ° C y
descartando el sobrenadante. Repita el lavado dos veces más.

2.2) Método alternativo, que también es apropiado para números de células más
altos (10-30x 107):

1. Prepare una solución de 2 x (10 μM) CFDA, SE agregando 2 μL del stock de 5

mM a 1 ml de PBS y agregue rápidamente esto a 1 ml de células completamente
resuspendidas, luego tape rápidamente el tubo e invierta y agite en vórtice para
obtener Mezcla rápida y uniforme.
2. Incubar las células durante 5 minutos a temperatura ambiente y lavar como en
los pasos 2.1 (f) y 2.1 (g).
2.3) Las células pueden aplicarse a un protocolo de interés para la inducción
de la división celular. Las células marcadas se pueden usar tanto en ensayos in
vitro como in vivo.
2.4) Al finalizar el ensayo de proliferación, las células se recolectan y
analizan mediante citometría de flujo (consulte a continuación los ejemplos
representativos).
3) Resultados representativos Para evaluar la proliferación de linfocitos
mediante la dilución de CFSE, es útil conocer la fluorescencia de las células no
divididas (es decir, la fluorescencia máxima) y las células no marcadas (es
decir, la fluorescencia mínima). Por lo tanto, su diseño experimental debe tener
en cuenta estos controles. A continuación, se incluyen ejemplos de ensayos in
vitro e in vivo que utilizan CFSE para medir la división de las células T CD8+ por
citometría de flujo. 3.1)

Estimulación in vitro La Figura 1 muestra los perfiles CFSE de células TCD8+ OT-I
transgénicas del receptor de células T específicas para ovoalbúmina (OVA)
marcadas con CFSE después de 3 días de cultivo con células dendríticas pulsadas
con diversas cantidades de OVA.
Las células TCD8+ purificadas a partir del bazo y los ganglios linfáticos de
ratones OT-I se marcaron con CFSE y se cultivaron 1x105 células con 3.3x104
CORRIENTE CONTINUA. La DC se pulsó con OVA durante 1 hora a 37 ° C y se lavó dos
veces antes del cultivo. Después de 3 días, las células se recolectaron y se
marcaron con anticuerpos anti-CD8-APC y Hoechst 33258 y luego se analizaron por
citometría de flujo (50,000 eventos recolectados). Se muestran las células CD8 +
vivas (Hoechst 33258-). Como controles, las células TCD8+ cultivadas solas,
muestran la intensidad diacetato de carboxifluoresceína succinimidil éster (CFSE)
de las células no divididas, mientras que las células no marcadas muestran la autofluorescencia de las células y
los límites de las divisiones celulares detectables. Tenga en cuenta que se pueden ver 4 picos CFSE en cada uno de los
paneles en este ejemplo, lo que indica que las celdas han sufrido hasta 3 divisiones. 3.2) Estimulación in vivo.

Figura 1. Capacidad de las células T CD8 + OT-I transgénicas del receptor de

células T específicas para ovoalbúmina (OVA) marcadas con CFSE para responder in
vitro a DC pulsadas con diferentes concentraciones de OVA, los datos que se
muestran después de 3 días de cultivo. Obsérvese la población no dividida de
células T CD8 + en ausencia de antígeno (histograma gris claro) y auto-
fluorescencia de la población no marcada (histograma gris oscuro). La figura
muestra las células T CD8 + que se han dividido de 1 a 3 veces en función de los
picos de dilución CFSE, con más células T dividiéndose en las concentraciones más
altas de antígeno.
Figura 2. Capacidad de las células T CD8 + OT-I transgénicas del receptor de
células T específicas para ovoalbúmina (OVA) marcadas con CFSE, cuando se
transfieren de forma adoptiva a ratones C57BL / 6 para responder a OVA, los datos
se muestran 3 días después de la transferencia adoptiva. Panel izquierdo: células
T CD8 +, CD45.1 + OT-1 en ratones receptores. Panel derecho: perfil de
proliferación CFSE. Note la población no dividida de células T CD8 + en ratones
receptores que no reciben antígeno (histograma de color gris claro) y auto-
fluorescencia de linfocitos no marcados (histograma de color gris oscuro). La
figura muestra las células T CD8 + que se han dividido de 1 a 6 veces en función
de los picos de dilución CFSE.
La Figura 2 muestra los perfiles CFSE de células T CD8 + OT-I transgénicas del
receptor de células T específicas para OVA marcadas con CFSE después de 3 días in
vivo en presencia de 20 μg de OVA. Las células T CD8 + purificadas a partir del
bazo y los ganglios linfáticos de los ratones OT-I congénicos CD45.1 se marcaron
con CFSE y 5 x 10 células inyectadas iv en la vena lateral de la cola de ratones
C56BL / 6J (CD45.2 +). Después de 2 horas, los ratones fueron inyectados iv con
20 µg de OVA. Después de 3 días, se recogieron los bazos de los ratones, se
hicieron en una suspensión de células individuales, se marcaron con anticuerpos
anti-B220-PerCP, anti-CD8-APC-Cy7 y antiCD45.1-PE-Cy7 y se analizaron Hoechst
33258 y luego se analizaron. Por citometría de flujo (1.000.000 eventos
recogidos). Las células B220- vivas (Hoechst 33258-) se muestran en el panel
izquierdo y las células CD8 + CD45.1 + cerradas se muestran en el panel derecho.
Como controles, las células T CD8 + marcadas con CFSE no estimuladas, muestran la
intensidad de la CFSE de las células no divididas, mientras que las células no
marcadas muestran la autofluorescencia de las células y los límites de las
divisiones celulares detectables. Tenga en cuenta que el uso de la diferencia
alotípica CD45 es vital para resolver las células T CD8 + transferidas desde el
host, ya que son un subconjunto menor del total de células T CD8 + (panel
izquierdo). Tenga en cuenta que la mayoría de las celdas caen dentro de los 7
picos CFSE en este ejemplo (panel derecho), lo que indica que las celdas han
sufrido hasta 6 divisiones.
Discusión
Para apreciar cómo funciona el diacetato de carboxifluoresceína succinimidil
éster (CFSE) y por qué se requiere un marcado uniforme rápido para su uso en el
análisis de proliferación, es útil comprender las bases moleculares del
etiquetado de células CFSE. Esto se puede dividir en dos fases,
1) Entrada celular: la entrada del colorante a la célula está mediada por la
forma diacetilada del colorante, éster succinimidílico de diacetato de
carboxifluoresceína (CFDA, SE). Los acetatos hacen que el tinte sea altamente
permeable a la membrana permitiendo su rápido flujo a través de la membrana
plasmática. Las esterasas, presentes en la célula, escinden los acetatos de CFDA,
SE y, por lo tanto, dan lugar a la forma CFSE del colorante, que es mucho menos
permeable a la membrana, concentrando así el colorante dentro de la célula.
2) Etiquetado de proteínas(Figura 3): mientras tanto CFDA, SE y CFSE tienen
cadenas laterales de succinimidilo reactivas con amino, Sólo el CFSE es
fluorescente. La alta concentración intracelular de CFSE facilita el marcado
intracelular rápido y alto nivel de las proteínas. El etiquetado CFSE de las
células se debe realizar rápidamente para obtener una población de células
marcadas de manera homogénea, lo cual es crítico para resolver las células que
han sufrido varias divisiones, como se muestra en los resultados representativos
(Figura 1 y 2). Revelaciones No hay conflictos de interés declarado. Expresiones
de gratitud El trabajo reportado en este artículo fue apoyado por un Consejo
Nacional de Investigación de Salud y Medicina (NHMRC) de Australia Programa de
Subvención (CRP) y una Subvención de Proyecto de NHMRC (CRP y BJCQ). También BJCQ
es un miembro postdoctoral Peter Doherty NHMRC.

Figura 3. Una representación de los diversos eventos moleculares que ocurren

durante el marcaje de las células con diacetato de carboxifluoresceína éster
succinimidil (CFDA, SE). Para detalles del proceso, vea el texto de discusión.
Nota: El acrónimo genérico 'CFSE', no CFDA, SE, se utiliza para describir el
reactivo de marcaje y el procedimiento de etiquetado en general. Figura basada en
la parroquia4.
2) Etiquetado de proteínas:
Referencias
1. Lyons AB, Parish CR. Determinación de la división de los linfocitos por
citometría de flujo. J. Immunol. Los metodos 1994; 171 : 131-137. [ PubMed ]
2. Parroquia CR, Glidden MH, Quah BJ, Warren HS. Coligan JE, editor. Uso del
colorante fluorescente intracelular CFSE para monitorear la migración y
proliferación de linfocitos. Protocolos actuales en inmunología. 2009. [ PubMed ]
3. Quah BJ, Warren HS, Parish CR. Monitoreo de la proliferación de linfocitos in
vitro e in vivo con el tinte fluorescente intracelular diacetato éster de succinimidil
carboxifluoresceína. Protocolos de la naturaleza. 2007; 2 : 2049-2056. [ PubMed ]

4. Parroquia CR. Tintes fluorescentes para la migración de linfocitos y estudios de proliferación. Immunol Cell Biol. 1999;
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