Un método alternativo y

rápido de extracción de
ADN vegetal para
Análisis de PCR
Dominique Brunel
Centre d'Etude du Polymorphisme Humain, 27 rue
Juliette Dodu, 75010 París, Francia
Enviado el 21 de abril de 1992
A pesar de la posibilidad de analizar muestras grandes y la
La rapidez de la tecnología de reacción en cadena de la
polimerasa (PCR), la
los protocolos habituales para la extracción de plantas
de ADN requieren mucho tiempo,
lento e incluso peligroso. Nuevos protocolos, los
cuales son tanto rápida
y de bajo costo, recientemente se han propuesto para
facilitar la
integración de 'marcadores genéticos de ADN' en programas
de fitomejoramiento
(1, 2). La tremenda ventaja de la tecnología derivada de PCR
versus la técnica del sur es su capacidad de tolerar 'baja
cantidad ' y' mala calidad 'de ADN: se necesitan de 5 a 40
ng para la PCR
contra 3 a 5 gramos para marcadores RFLP. De la misma manera
sólo la secuencia a ser amplificada tiene que estar intacto
para PCR
mientras que el tamaño del ADN después de la
extracción debe ser de 50 Kb para siempre
resultados con el método Southern. Por lo tanto, otro método,
inspirado
de los protocolos de YAC y el uso de tapones
de agarosa (3), se propone
aquí para la extracción de ADN de semillas
en germinación que permite
Varios cientos de individuos para ser extraídos
por día. Incluso
pequeñas plántulas , tales como los de las
Brassica especies pueden ser
analizado después de 2 días de germinación, en lugar de
hasta un mes
de crecimiento de la planta utilizada para RFLP análisis, la
reducción en el mismo
tiempo el costo del invernadero y la demora. Diferentes
restricciones:
'sin nitrógeno líquido , sin centrifugación, sin solventes
y sin notación'
fueron elegido durante theconception de este protocolo
para una más fácil
manejo durante operaciones rutinarias y para una
automatización suave.
Toda la plántula se coloca en un pozo de fondo plano de 96
microplacas.
en el caso de 'semillas pequeñas' como Brassica napus (2 días
plántulas). Para semillas más
grandes como Helianthus annuus (5 días
plántulas) se utilizan dos piezas de 3-5 mm de tallo . 100 u1
de
tampón de lisis ( 50 mM Tris HCI -20 mM EDTA - 1% Sarkosyl
- Se agrega 1 mg / ml de Proteinasa K - pH = 8) a cada pocillo.

Los tejidos se trituran, ya sea manualmente con unos pocos

giros rápidos.
de una barra de plexiglás , o usando un mini taladro. La
varilla se lava con
agua entre cada enamoramiento. La microplaca se coloca en un
horno a 55 ° C durante una hora. Aproximadamente 50 jd del
lisado
se retira fácilmente y se mezcla en una nueva microplaca
flexible,
Usualmente utilizado para análisis de PCR , que
contiene 50 i1 de un 2% bajo
fusión de agarosa mantenida en líquido en un aparato de PCR a
55 ° C.
Los extractos, aún dentro de la placa, primero se dejan
solidificar
a temperatura ambiente y luego se dializan contra el cambio
de agua
3 veces a intervalos de 30 minutos , y luego durante la
noche. Los enchufes
se conservan en una microplaca cubierta con película adhesiva,
o con
una gota de aceite en cada tapón, a 4 ° C, hasta su uso
durante al menos 9 meses.
La ventaja de utilizar microplacas durante las diferentes
etapas.
de esta técnica es que las muestras pueden ser identificadas
por el
símbolos marcados en las placas. La cantidad de ADN, estimada
en
gel de agarosa, es de aproximadamente 5 ng /, ul de tapón.
Antes de cada amplificación, los tapones de agarosa se funden
en el
Aparato de PCR a 68 ° C durante 5 a 10 minutos. 1-
5 j1l se extraen
con una micropipeta y se coloca en la microplaca donde se
realiza la PCR
es para ser realizado. 5-100 1l de la mezcla que
contiene todos los
Los componentes de la PCR se cargan y se cubren
con un mineral.
gota de aceite La presencia de agarosa
no no parece que perturbe
amplificación como las temperaturas utilizadas, durante los
ciclos de PCR,
son superiores a 38 °
C. Para análisis, 10 a 20 jil de productos de PCR
puede ser cargado en agarosa gel con no problema.
Hasta a 40 reacciones de PCR se podrían realizar con un
extracto.
Antes de cada amplificación, los tapones se funden y luego se
solidifican
y conservado nuevamente hasta otro muestreo a 4 ° C.
PCRs con diferentes tipos de cebador se realizan
exitosamente como se muestra en las Figuras 1 y
2: iniciadores cortos
(lOmers) para RAPD, primers largos con abrazadera
GC (65mers) utilizados
en DGGE.
Referencias
1. Landgridge, U. et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19, 6954.
2. Edwards, K. et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19, 1349.
3. Guidet, F. et al. (1990) Nucleic Acids Res. 18, 4955.
Figura 1. Electroforesis en gel de agarosa
al 1% de productos de amplificación con un
imprimación corta (10mers) para RAPD: el carril M contiene estándares de
tamaño obtenidos por
digestión (+ 'X174 DNA con HaeIll. Lane 2 contiene productos de PCR de
una mostaza
semilla. Los carriles 3-5 contienen productos de PCR de 3 semillas de colza
diferentes y el carril 6 de
una semilla de coliflor
Figura 2. Electroforesis en gel de agarosa al 1% de productos después de la
amplificación
con imprimación larga con una abrazadera GC (65mers) utilizada en DGGE. Carril M
contiene
ADN 4X174 digerido por HaeUI. Los carriles 2-7 contienen productos de PCR de
girasol
semilla individual. El producto de PCR esperado es un fragmento de 320 pb.

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Nucleic Acids Research, 1993, vol. 21, núm. 17 4153-4154

Un método simple
para preparar muestras
de plantas para PCR
Hong Wang, Meiqing Qi y Adrian J.Cutler *,
Plant Biotechnology Institute, NRC, Saskatoon,
Saskatchewan S7N OW9, Canadá
Recibido el 9 de noviembre de 1992; Revisado y aceptado el 4
de julio de 1993
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (1) se está
incrementando
utilizado para detectar secuencias de ADN específicas en
plantas (por ejemplo, 2, 3).
El tiempo y el esfuerzo necesarios para la preparación
de muestras de ADN a menudo es
El paso limitante . Aunque hay varios protocolos disponibles
para
Para este propósito (4, 5, 6, 7, 8), todos implican múltiples
pasos. Desde PCR
requiere solo una pequeña cantidad de ADN de plantilla para
tener éxito
amplificación y tiene buena tolerancia hacia el ADN crudo
preparaciones, podría ser posible extraer suficiente ADN en
un tampón apropiado y úselo directamente para la PCR. los
los requisitos para tal amortiguador serían que permita
suficiente
Extracción de ADN al mismo tiempo que no inhibe la
reacción de amplificación
Protocolo inicial desarrollado para Arabidopsis thaliana
Para explorar tal posibilidad, un gen inducido por el frío y
el ABA
de Arobidopsis thaliana fue elegida como la secuencia a ser
amplificado (9). PCR usando dos cebadores (izquierda, 5'-
TACTCGTGGC-
ACCACACTCC-3 '; derecha, 5'-TGCAGCATCCTTGGCC-
TTGT-3 ') amplifica un fragmento de 395 pb de genómica
purificada
ADN Las extracciones iniciales se realizaron con TE buffer
modificado
mediante la adición de sustancias como el detergente no
iónico NP-40,
proteinasa K o EDTA. Los resultados no fueron satisfactorios
(Figura
1, carriles 2 y 3). Posteriormente, el tampón estándar de PCR
Taq
(1 x, que consiste en Tris 10 mM , KCl 50 mM , MgCl2 1,5 mM,
0.01% de gelatina y DTT 3 mM (ditiotreitol) con pH 8.3), fue
investigado Se obtuvieron buenos resultados mediante
extracción utilizando
tampón concentrado PCR en la presencia de NP-40. En todos los
pruebas duplican muestras se prepararon para el mismo
tratamiento.
El procedimiento fue el siguiente: A.thaliana parte de
Las plantas cultivadas en invernadero se colocaron en un tubo
de 1,5 ml y,
por cada mg de tejido de la hoja , 2 1l de 6x concentración
de PCR
el tampón ( se probaron 1 x a 1O x ) que contenía 0,5% de NP-
40 fue
adicional. El tejido de la hoja se molió con una mano de
mortero desechable. los
la suspensión se centrifugó brevemente , luego
se usó directamente para PCR.
Las PCR se realizaron en un volumen total de 40 A1l
que consiste
de 1 x tampón de PCR , 200 , tM de cada dNTP, 0.25 ,
AM cada uno de
los dos cebadores, 1 U Taq DNA polimerasa y 0.5 (il de la
extracto de hoja El perfil de amplificación consistió en 1
minuto a 95 ° C,
Siguieron 30 ciclos de 50 s a 94 ° C, 50 s a 57 ° C y 60
s a 72 ° C
por 3 min a 72 ° C para la extensión final. Una alícuota de
7 tdl fue
utilizado para electroforesis. La Figura 1
muestra algunos de los resultados.
La amplificación mejoró dramáticamente con el aumento de la
memoria intermedia de PCR
concentración hasta al menos 6x (carriles 4-13 de la Figura
1).
Identificación de la condición alcalina como el factor
principal para
extracción de ADN mejorada
Cuando el protocolo anterior se aplicó a varias otras plantas
especies los resultados variaron de buenos (p.
ej., lino) a pobres (p. ej.
tabaco). Nosotros , por lo tanto decidimos a identificar
a la crítica de los factores (s)
* Para quien la correspondencia debe ser dirigida
que causó la preparación mejorada de la muestra con concentrado
Tampones de PCR, para modificar el protocolo para que sea más
amplio
útil. Las muestras se prepararon usando una serie de
soluciones,
que consiste en tampón de PCR estándar con concentraciones
elevadas
(10 veces en relación con el tampón de PCR estándar) de un
individuo
componentes: Tris (100 mm, pH 8.3) o KCI (500 mM) o
MgCl2 (15 mM) o DTT (30 mM). En adición a A. thaliana,
También se utilizaron plantas transgénicas de
Brassica napus . Una cartilla izquierda
5'-GTGGAGAGGCTATTCGGCTA-3 ' y cebador derecho 5'-CC-
ACCATGATATTCGGCAAG-3 ' se utilizaron para amplificar un 553 pb
fragmento del NPTII (neomicina fosfotransferasa II)
secuencia codificante (10) en las plantas transgénicas. Los
resultados son
mostrado en la Figura 2A. En ambas especies, se produjo Tris
100 mM
El mejor resultado (Figura 2A: carriles 2 y 7). Aumento de la
concentración
de KCl (500 mM) (Figura 2A: carril 8) o DTT (30 mM) (Figura
2A: carril 5) tuvo algunos efectos benéficos a baja
concentración de Tris
(10 mM). Posteriormente, KCl y DTT se probaron adicionalmente
en
mayor concentración de Tris (100 mM, pH 8.3). Ninguno de estos
Dos factores a cualquiera de las concentraciones probadas
(KCl, 0-500 mM
y DTT, 0-100 mM) tuvieron un efecto claro en ya mejorado
amplificación (datos no mostrados). Por lo tanto,
Tris fue identificado
como el factor crítico.
Para confirmar aún más los resultados anteriores
y para evaluar la óptima
Rango de pH, los extractos se prepararon utilizando un conjunto
de tampones que consisten
de 1 x tampón de PCR pero que contiene Tris 100 mM a pH 7,0,
7,5,
8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10.0, 10.5, 11.0 o 12.0. Resultados
usando 0.5
El extracto A1 se muestra en la Figura
2B. Buena amplificación fue
obtenido solo cuando el pH del tampón era igual o mayor
de 8.0. Estos resultados implican que una mejor extracción
de ADN fue
logrado en condiciones alcalinas.
Un protocolo general para muchas especies de plantas:
extracción de NaOH
método
Como el pH
alcalino se identificó como el factor más importante,
que estaba más motivado que el ADN nuclear podría ser
óptimamente
se extrajo con NaOH, que en el mismo tiempo podría inactivar
nucleasas durante la extracción. De
hecho, se obtuvieron resultados positivos
con extractos preparados con NaOH 0,1-1,0 N. Subsecuente
Se realizaron experimentos para optimizar las condiciones. Efe
ctos
de algunos aditivos (sal-KCl, detergente-NP40, DTT y 3-
mercaptoetanol) fueron examinados pero ninguno de
ellos claramente
mejoró los resultados. Estos experimentos conducen
así a lo siguiente
protocolo:
(1) Coloque unos pocos miligramos de hoja
joven (callo o cotiledón)
en un tubo de 1,5 ml y, a cada mg de tejido, agregue 10 A1 0.5
N
NaOH Nota: El muestreo podría
ser convenientemente hecho por punzonado
un disco de hoja y agregando la misma cantidad de solución a cada
disco
muestra.
(2) Moler hasta que no queden trozos grandes de tejido .
kl y 1993 Oxford University Press

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4154 NucleicAcids Research, 1993, vol. 21, núm. 17
(3) Transfiera 5 p1 rápidamente a un nuevo tubo que contenga
495 p1 100
mM Tris pH 8.0, mezcle bien y use 1 p1 directamente en 30-40
p1
PCR ejecutada durante 35 ciclos. Nota: Esto dará una dilución
de 1/100
desde el original de extracto. La
centrifugadora no es necesaria si se pipetea
no está bloqueado La muestra debe almacenarse a -20 ° C si
es
No se utiliza de inmediato.
Usando este protocolo, se detectaron secuencias de
ADN específicas en
siete especies de plantas
diversas y hasta ahora ninguna especie ha demostrado
recalcitrante. Resultados de seis especies, A. thaliana,
B.napus, tabaco,
lino, guisante, B.olerecea, se muestran en la Figura 3.
Para A.thaliana el
los cebadores y el gen objetivo fueron como se describió
anteriormente. Para todos los demás
especies, se utilizaron plantas transgénicas que
contienen el gen NPTII
para reducir el número de cebadores requeridos para
diferentes especies.
Esta 'molienda y uso' protocolo no no requiere orgánica
disolventes u otros tratamientos (calentamiento, tratamiento
con proteinasas
etc.) Debería ahorrar un tiempo considerable y reducir
el cruce
problema de contaminación en relación con la mayoría de los
protocolos anteriores
implicando purificación parcial. El método que emplea muy
pequeño
piezas de hoja directamente en PCR (11) produjeron malos
resultados en nuestro
manos. Usando tejidos de las mismas fuentes que en
la Figura 3, los resultados
fueron
todos negativos excepto A. thaliana (datos no mostrados). U
n más
el protocolo reciente (12) usa extracto directamente pero
aún requiere líquido
tratamiento con nitrógeno , ebullición , etc. El presente
método será
particularmente útil en el cribado de grandes cantidades
de plantas para
secuencias de ADN definidas . Ya
que solo una pequeña cantidad de material
se utiliza, el cribado se puede realizar en
las primeras etapas de la planta
regeneración o en pequeños trozos de callo .
El éxito ofthis protocolo es probablemente debido a la mej
ora
extracción de ADN
nuclear con solución alcalina (NaOH), que
a su vez permite una dilución suficiente del extracto
paraeliminar o
Reducir significativamente el efecto
de los inhibidores potenciales en la PCR. Eso
Se observa que entre las especies probadas, A.
thaliana fue la más
material flexible para producir extractos amplificables
por PCR .
Se obtuvieron resultados reproducibles usando extractos
de NaOH
o extractos con un tampón Tris de alcalina pH. En este
último caso
los extractos originales o sus diluciones 1/100 funcionaron
igualmente
bien. En Además, diferentes tipos de tejidos fueron también
utilizados en el
estudiar. Tejidos más jóvenes ( plandetos in
vitro , callos, hojas jóvenes )
en general dio mejor amplificación. Cuando se aplica a otra
planta
especies o nuevos materiales, puede ser necesaria una prueba
simple para
determinar la dilución óptima (en el Paso 3
del protocolo), que
es por lo general alrededor de 1/100 y entre 1/10 o 1 /
1.000 de la
extracto original
AGRADECIMIENTOS
El apoyo financiero a HW fue proporcionado por Saskatchewan
Fondo de Desarrollo Agrícola (donación R-89-12-
0475). Nosotros somos
agradecidos a siguiente colegas -en proporcionar materiales
vegetales: Dr
J.Dong ( lino transgénico ), el Sr. Sun Lee y el Dr. W.
Keller
(transgénico B. oleracea), Dr. J. Mahon (guisante
transgénico), Dr
HMWang y el Dr. M.Oelck (B.napus trgénico ). Esto es NRCC
publicación no. 26493.
6. McGarvey, P. y Kaper, JM (1991) Biotechniques 11, 428-432.
7. Brunel, D. (1992) Nucleic Acids Res. 20, 4676.
8. Oard, JH, Dronavalli, S. (1992) Plant Mol. Biol. Rep. 10, 236-241.
9. Kurkela, S. y Franck, M. (1990) Plant Mol. Bio. 15, 137-144.
10. Beck, E., Ludwig, G., Auerswald, EA, Reiss, B. y Schaller, H. (1982) Gene
19, 327-336.
11. Berthomieu, P. y Meyer, C. (1991) Plant Mol. Biol. 17.555-557.
12. Luo, G., Hepbum, AG y Widholm, JM (1992) Plant Mol. Biol. Reps.
10, 319-323.
Figura 1. Resultados de PCR usando muestras preparadas a partir de hojas
de A.thliana en diferentes
tampones extracdon . A cada PCR de 40 A1, se añadió directamente 0,5 p1
de muestra .
Carril S, estándar de escalera de ADN
de 1 kb (BRL). Carril 1, control positivo usando 50
ng de ADN genómico purificado (en un volumen de 0.5 jil ) de las hojas. Los
carriles 2 y 3 son
muestras preparadas usando tampón TE: carril 2, TE; carril 3, TE
+ 0.5% NP40. Carriles
4 a 13 son muestras preparadas
usando 1 x 10 x concentraciones de tampón de PCR
todos contienen 0,5% de NP-40: calle 4, lx; carril 5, 2x; lan 6, 3x; carril 7,
4x;
carril 8, Sx; carril 9, 6x; carril 10, 7x; carril 11, 8x; carril 12,
9x; carril 13, 10X.
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B _ C-.tU) VNOS
Figura 2. Un efecto de la composición del tampón en la preparación de la
DNA extcs directamente
utilizado para PCR. A. thaliana (carriles 1-5) y B. napus (Anes 6-
10) hojas eran'
extraído utilizando 1 x tampón de PCR estándar o modificado con concentración
de lOx
de componentes individuales (todos con 0,5% de NP-40): carriles 1 y
6, 1 x PCR
tampón solo; carriles 2 y 7, Tris aumentó a 100 mM (pH 8,4); carriles 3 y
8, KCI aumentó a 500 mM; carriles 4 y 9, MgCl2 aumentó a 15 mM; carriles
5 y 10, la TDT aumentó a 30 mM. La PCR se ejecutó durante 30 ciclos para
A.thalina
o 35 ciclos para B.napus usando 0.5 p1 de extracto. B Efecto del pH del
tampón en la preparación
Extractos de ADN directamente utilizados para PCR. Extrat se preparó a
partir de B. napus hojas
y 0,5, se usó extracto ul en PCR. Todos los tampones
consistieron en l x PCR (excepto
Tris aumentó a 100 mM) y 0.5% NP-40 con pH ajustado a (desde el carril 1
a 10) 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10.0, 10.5, 11.0 o 12.0.
Figura 3.Resultados de PCR usando extractos de ADN de diferentes
especies preparadas por
Método de extracción de NaOH. Se prepararon extractos (dos de cada especie)
de acuerdo con el protocolo y l ; d de las 1/100 diluciones de los
extractos originales
se utilizaron en la ejecución de PCR durante 35 ciclos. Los números de carril
y exactos correspondientes
son los siguientes: Carril S, estándar de ADN de 1 kb ; carriles 1-
2, A.thalia (invernadero
plantas); carriles 3-4, B.napus ( plantas propagadas in vitro ); carriles 5-
6, tabaco
(plantas de invernadero); carriles 7-8, lino (plántulas); carriles 9-10,
guisante (invernadero
plantas); carriles 11-12, B.olerecea ( plantas in vitro ).
Referencias
1. Mullis, KB y Faloona, FA (1987) Methods Enzymo., 155, 335-350.
2. Deragon, J.-M. y Landry, B. (1992) PCR Methods Appt. 1, 175-180.
3. Hamill, JD y col. (1991) Plant Cell Rep. 10, 221-224.
4. Edwards, K., Johnstone, C. y Thompson, C. (1991) NucleicAcids Res. 19,
1349.
5. Langidge, U., Schwall, M. e Iangridge, P. (1991) NucleicAcids Res. 19,
6954.