La cromatografía es un método físico de

separación para la caracterización de

mezclas complejas, la cual tiene
aplicación en todas las ramas de la
ciencia; es un conjunto de técnicas
basadas en el principio de retención
selectiva, cuyo objetivo es separar los
distintos componentes de una mezcla,
permitiendo identificar y determinar las
cantidades de dichos componentes. Diferencias sutiles en el coeficiente de
partición de los compuestos dan como resultado una retención diferencial sobre
la fase estacionaria y, por tanto, una separación efectiva en función de
los tiempos de retención de cada componente de la mezcla.

La cromatografía puede cumplir dos funciones básicas que no se excluyen

mutuamente:

 Separar los componentes de la mezcla, para obtenerlos más puros y

que puedan ser usados posteriormente (etapa final de muchas síntesis).

 Medir la proporción de los componentes de la mezcla (finalidad

analítica). En este caso, las cantidades de material empleadas suelen
ser muy pequeñas.

HISTORIA:

La cromatografía, como indica su nombre (proviene del griego χρῶμα chrōma y

γράφω gráphō, que significan respectivamente "color" y "escribir, registrar",
literalmente "escritura de color", o mejor "registro de color") , fue empleada
originalmente con sustancias coloreadas.

Ya en 1850, Runge describió la formación de zonas coloreadas cuando se

depositaban gotas de sustancias colorantes sobre papel secante, pero el
desarrollo más importante vino con los experimentos de Mijaíl Tsvet . (1872-
1919), que empleó por primera vez en 1906 el término "cromatografía". A
comienzos del año 1903, Mijaíl Tsvet, botánico ruso, logró separar una mezcla
de pigmentos de plantas (clorofilas) en una columna de carbonato de calcio.
Más tarde, en 1910, cromatografió un extracto de yema de huevo en una
columna de inulina. Sus investigaciones, sin embargo, no fueron utilizadas por
otros investigadores hasta 1931. Esta demora quizá se debió al hecho de que
los trabajos de Tsvet fueron publicados en ruso y en una revista que no tenía
amplia circulación.

El rápido desarrollo de la cromatografía como herramienta analítica sensible no

ocurrió hasta 1931, cuando Kuhn, con Lederer y con Winterstein, empleó la
técnica para el análisis de pigmentos de plantas, confirmando los primeros
trabajos de Tsvet y su predicción de que el caroteno no era una sola sustancia,
sino una mezcla de varios homólogos estrechamente relacionados. Al mismo
tiempo, el tamaño de las columnas empleadas fue aumentando para poder
recuperar los componentes separados. La técnica, por lo tanto, no era solo
analítica sino preparatoria.

La cromatografía en columna por este

tiempo tenía aplicaciones limitadas,
dado que los componentes que se
podían separar eran
invariablemente lípidos. Pasaron 10
años antes de
que Martin y Synge desarrollaran una
técnica mediante la cual se pudieran
separar compuestos acuosos o
hidrofílicos. Esto marcó un nuevo
interés en la técnica y en 1944
Consden, Gordon y Martin lograron
separar mezclas complejas de
aminoácidos en papel y fueron
premiados con el Premio Nobel por sus
trabajos. Al poco tiempo, en 1947,
en Estados Unidos de Norteamérica, la
Comisión de Energía Atómica dio a
conocer información sobre el uso de la
cromatografía de intercambio iónico para la separación de productos de fisión
nuclear.

El desarrollo más reciente en el campo de la cromatografía se deriva de los

trabajos de Stahl, quien en 1956 presentó una técnica práctica mediante la cual
una capa delgada sílice gel, celulosa o alúmina era diseminada sobre una
placa de vidrio. Esta técnica, llamada cromatografía de capa fina, resultó en un
análisis más rápido y más sensible para el examen de mezclas complejas y, en
muchos casos, ha sustituido a otros métodos similares más antiguos de
cromatografía en papel toche.

Los primeros equipos de cromatografía de gases aparecieron en el mercado a

mediados del siglo XX. A su vez, la cromatografía líquida de alta
resolución (HPLC High Performance Liquid Chromatography, en inglés)
comenzó a desarrollarse en los años 1960, aumentando su importancia en las
décadas siguientes, hasta convertirse en la técnica cromatográfica más
empleada. Sin embargo esto se irá modificando con el paso de los años.
CROMATOGRAFÍA EN PAPEL
La cromatografía en papel es un proceso muy utilizado en los laboratorios para
realizar unos análisis cualitativos ya que pese a no ser
una técnica muy potente no requiere de ningún tipo de
equipamiento.

La fase estacionaria está constituida simplemente por

una tira de papel filtro. La muestra se deposita en un
extremo colocando pequeñas gotas de la solución y
evaporando el disolvente. Luego el disolvente empleado
como fase móvil se hace ascender por capilaridad.
Luego se coloca la tira de papel verticalmente y con la
muestra de abajo dentro de un recipiente que contiene
fase móvil en el fondo.

Después de unos minutos cuando el disolvente deja de

ascender o ha llegado al extremo se retira el papel y se
deja secar. Si el disolvente elegido fue adecuado y las
sustancias tienen color propio se verán las manchas de
distinto color separadas. Cuando los componentes no
tienen color propio el papel se somete a procesos de
revelado.

Hay varios factores de los cuales depende una

cromolitografía eficaz: la elección del disolvente y la del
papel de filtro.

Un ejemplo podría ser que utilices un pedazo de papel y

le hagas puntos de colores con plumones permanentes
y le pongas un lápiz del lado donde no están los puntos
de colores (esto te servirá como soporte), después en
un vaso pon alcohol y coloca la tira de papel con el lápiz
horizontalmente en la parte de arriba para que el papel
no caiga y tienes que esperar para que el alcohol haga
efecto en el papel, lo que sucederá es que a los puntos de colores se les harán
unas pequeñas líneas hacia arriba.

HISTORIA:

El descubrimiento de la cromatografía en papel en 1943 por el químico

inglés Archer John Porter Martin (1910-2002) y el también bioquímico
inglés Richard Laurence Millington Synge (1914-1994) proporcionó, por primera
vez, los medios de explorar los constituyentes de plantas y para su separación
e identificación. Hubo una explosión de actividad en este campo a partir de
1945.
CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA

La cromatografía en capa fina (en inglés thin layer chromatography o TLC) es

una técnica analítica rápida y sencilla, muy utilizada en un laboratorio de
Química Orgánica. Entre otras cosas permite:

Determinar el grado de pureza de un compuesto. Se puede determinar

así, por ejemplo, la efectividad de una etapa de purificación.
Comparar muestras. Si dos muestras corren igual en placa podrían ser
idénticas. Si, por el contrario, corren distinto entonces no son la misma
sustancia.
Realizar el seguimiento de una reacción. Es posible estudiar cómo
desaparecen los reactivos y cómo aparecen los productos finales o, lo
que es lo mismo, saber cuándo la reacción ha acabado.
La muestra a analizar se deposita cerca de un extremo de una lámina de
plástico o aluminio que previamente ha sido recubierta de una fina capa de
adsorbente (fase estacionaria). Entonces, la lámina se coloca en una cubeta
cerrada que contiene uno o varios disolventes mezclados (eluyente o fase
móvil). A medida que la mezcla de disolventes asciende por capilaridad a
través del adsorbente, se produce un reparto diferencial de los productos
presentes en la muestra entre el disolvente y el adsorbente.

ADSOBENTES Y ELUYENTES
Los dos adsorbentes (fase estacionaria) más ampliamente utilizados son la gel
de sílice (SiO2) y la alúmina (Al2O3), ambas de carácter polar. La alúmina
anhidra es el más activo de los dos, es decir, es el que retiene con más fuerza
a los compuestos; por ello se utiliza para separar compuestos relativamente
apolares (hidrocarburos, haluros de alquilo, éteres, aldehídos y cetonas).
El gel de sílice, por el contrario, se utiliza para separar sustancias más polares
(alcoholes, aminas, ácidos carboxílicos). El proceso de adsorción se debe a
interacciones intermoleculares de tipo dipolo‐dipolo o enlaces de hidrógeno
entre el soluto y el adsorbente. El adsorbente debe ser inerte con las
sustancias a analizar y no actuar como catalizador en reacciones de
descomposición. El adsorbente interacciona con las sustancias mediante
interacción dipolo‐dipolo o mediante enlace de hidrógeno si lo presentan.

ELECCIÓN DEL ELUYENTE

Influyen varios factores:
 Precio.
Pureza.
No utilizar mezclas de eluyentes (reproducibilidad).
No utilizar compuestos muy volátiles.
Evitar que contengan trazas de metales (catalizadores).

La elección del eluyente se realiza de forma empírica. Hay que estudiar la

polaridad del componente y probar con eluyentes cada vez menos polares.
Generalmente se utiliza como reactivo revelador yodo, el cual forma complejos
coloreados con los componentes orgánicos (con tonos amarillo-marrón), pero
las manchas desaparecen con el tiempo con lo que es conveniente señalar las
manchas aparecidas.
Otro reactivo revelador bastante utilizado es el ácido sulfúrico, que reacciona
con los componentes orgánicos produciendo manchas negras. Sin embargo
debe tenerse en cuenta que el tamaño de las manchas no está relacionado con
la cantidad de componente separado.

DESARROLLO DE LA CROMATOGRAFÍA
El desarrollo de los cromatogramas en capa fina se realiza normalmente por el
método ascendente, esto es, al permitir que un eluyente ascienda por una
placa casi en vertical, por la acción de la capilaridad. La cromatografía se
realiza en una cubeta. Para conseguir la máxima saturación posible de la
atmósfera de la cámara, las paredes se impregnan del eluyente.
Generalmente el eluyente se introduce en la cámara una hora antes del
desarrollo, para permitir la saturación de la atmósfera. El tiempo de desarrollo,
por lo general, no llega a los 30 minutos. El tiempo de una cromatografía
cualitativa suele ser de un par de minutos, mientras que el tiempo de una
cromatografía preparativa puede llegar a un par de horas.
Las placas pueden desarrollarse durante un tiempo prefijado, o hasta que se
alcance una línea dibujada a una distancia fija desde el origen. Esto se hace
para estandarizar los valores de RF. Frecuentemente esta distancia es de 10
cm, ya que parece ser la más conveniente para medir valores de RF. Después
del desarrollo, las placas pueden secarse rápidamente con una corriente de
aire caliente.
La mejor posición de desarrollo para un componente es el punto medio entre el
origen y el frente del eluyente, ya que permite separar las impurezas que se
desplazan con mayor y menor velocidad. El frente del eluyente nunca debe
llegar a tocar el borde de la placa.

La Cromatografía en Capa Fina ( TLC ) es una técnica altamente versátil y

económica para ensayos analíticos y preparativos. Ampliamente utilizada en
numerosos campos científicos, la cromatografía TLC es particularmente
popular para el monitoreo de reacciones, la purificación de muestras y la
identificación de compuestos y contaminantes en mezclas.

CROMATOGRAFIA EN GAS
La cromatografía de gases es una técnica cromatografía en la que la
muestra se volatiliza y se inyecta en la cabeza de un mechero de una columna
cromatografía. La elución se produce por el flujo de una fase móvil de gas
inerte. A diferencia de los otros tipos de cromatografía, la fase móvil no
interactúa con las moléculas del analito; su única función es la de transportar el
analito a través de la columna.
Existen dos tipos de cromatografía de gases (GC): la cromatografía gas-sólido
(GSC) y la cromatografía gas-líquido (GLC), siendo esta última la que se utiliza
más ampliamente, y que se puede llamar simplemente cromatografía de gases
(GC). En la GSC la fase estacionaria es sólida y la retención de los analitos en
ella se produce mediante el proceso de adsorción. Precisamente este proceso
de adsorción, que no es lineal, es el que ha provocado que este tipo de
cromatografía tenga aplicación limitada, ya que la retención del analito sobre la
superficie es semipermanente y se obtienen picos de elución con colas. Su
única aplicación es la separación de especies gaseosas de bajo peso
molecular. La GLC utiliza como fase estacionaria moléculas de líquido
inmovilizadas sobre la superficie de un sólido inerte.
La GC se lleva a cabo en un cromatógrafo de gases. Éste consta de diversos
componentes como el gas portador, el sistema de inyección de muestra, la
columna (generalmente dentro de un horno), y el detector.

HISTORIA:
La cromatografía data de 1903 en la obra del científico ruso, Mijaíl Tsvet. El
estudiante de doctorado alemán Fritz Prior desarrolló la cromatografía de gas
de estado sólido en 1947. Archer John Porter Martin, que fue galardonado con
el Premio Nobel por su trabajo en el desarrollo de la cromatografía líquido-
líquido (1941) y de papel (1944), sentó las bases para el desarrollo de la
cromatografía de gas y más tarde de la cromatografía líquido-gas (1950). Erika
Cremer sentó las bases y supervisó gran parte del trabajo de Prior.
CROMATOGRAFIA LIQUIDA:
La cromatografía líquida, también conocida como cromatografía de líquidos, es
una técnica de separación y no debe confundirse con una técnica cuantitativa o
cualitativa de análisis. Es una de las técnicas analíticas ampliamente utilizadas,
la cual permite separar físicamente los distintos componentes de una solución
por la adsorción selectiva de los constituyentes de una mezcla. En
toda cromatografía existe un contacto entre dos fases, una fija que suele
llamarse fase estacionaria, y una móvil (fase móvil) que fluye constantemente
durante el análisis, y que en este caso es un líquido o mezcla de varios de
ellos. La fase estacionaria por su parte puede ser alúmina, sílice o resinas de
intercambio iónico que se encuentran
disponibles en el mercado. Los
intercambiadores iónicos son matrices
sólidas que contienen sitios activos
(también llamados grupos ionogénicos)
de carga electrostática (positiva o
negativa). De esta forma, la muestra se
fija al soporte sólido por afinidad
electrostática. Dependiendo de la
relación carga/tamaño algunos
constituyentes de la mezcla se
retendrán con mayor fuerza sobre el
soporte sólido que otros, es decir serán
adsorbidos, lo que provocará su
separación. Las sustancias que permanecen más tiempo libre en la fase móvil
avanzan más rápidamente con el fluir de la misma, y las que quedan más
unidas a la fase estacionaria o retenidas avanzan menos y por lo tanto tardarán
más en salir o fluir. Éste es el principio fundamental de la cromatografía. Un
ejemplo notable es la cromatografía de intercambio iónico. Las columnas más
utilizadas son las de sílice.

La fase móvil es un disolvente o mezcla de disolventes y la fase estacionaria un

sólido que interactúa con las sustancias que se desea separar (cromatografía líquido-
sólido), o bien un líquido inmiscible con la fase móvil, depositado en la superficie de un
sólido (cromatografía líquido-líquido). Esta forma de cromatografía puede realizarse
con diferentes arreglos experimentales: en columna, en capa delgada o en papel. En
el primer caso, la fase estacionaria se encuentra rellenando un tubo; en el segundo, se
dispersa sobre una lámina de vidrio o aluminio formando un lecho de espesor
uniforme; en la cromatografía en papel, la fase estacionaria es la solución acuosa.

CROMATOGRAFÍA DE PERMEACIÓN EN GEL

La cromatografía de permeación en gel, también conocida como cromatografía
de exclusión es una variante de la CLAE que consiste en una columna
cromatográfica empacada de tal manera que las partículas de dicho
empacamiento tienen diferentes tamaños de poros o de redes de poros con el
fin de que las moléculas de soluto sean retenidas o excluidas basándose en su
forma y tamaño y no en el peso molecular.
Bajo este entendido, las moléculas de mayor tamaño no caben dentro de los
poros y son arrastrados alrededor de la fase estacionaria, por lo que son
excluidas y eluyen en el volumen de “cama de vacío” de la fase móvil. Por el
contrario, las partículas de menor tamaño eluyen hasta el final porque tiene más
espacio de columna que recorrer debido a un fenómeno de difusión hacía los
poros que tienen accesibles. Las moléculas de tamaños intermedios tardan
diferentes tiempos en eluir, debido a la cantidad de poros por los que puedan
pasar.

Empaquetamientos de columna. Existen distintos tipos de empacamientos

columna. Entre ellos están los polímeros macromoleculares semirígidos, los
entrecruzados, las sílices rígidas ó las de “poro controlado”. Los materiales
semirígidos se hinchan ligeramente se debe tener cierto cuidado en su uso ya
que se limitan a una presión de 300psi. Las cuentas de poliestireno parcialmente
sulfonado que tienen un tamaño usual de 5µm, son buenas para usarse con
sistemas acuosos mientras los no sulfonados son compatibles con sistemas no
acosos.
 “Año del dialogo y la reconciliación nacional”
UNIVERSIDAD NACIONAL DE PIURA

FACULTAD:
Ingeniería industrial

ESCUELA PROFESIONAL:
Ingeniería agroindustrial e industrias alimentarias

CURSO:
Química analítica

DOCENTE:

Ing. Alburquerque Velasco

TEMA:
Técnicas cromatográficas en análisis químico

INTEGRANTES DE GRUPO:
 Aquino Godos Fiorella
 Dueñas Labán Shirley
 Landacay Morocho Mirtha
 Madrid Sandoval Cristina
 Olaechea Jiménez Valeria
CROMATOGRAFÍA DE FLUIDOS SUPERCRÍTICOS
La cromatografía de fluidos supercríticos (SFC) es una forma cromatografía de
fase normal que se utiliza para el análisis y purificación de moléculas de bajo o
moderado peso molecular. Los principios son similares a los del HPLC sin
embargo, SFC típicamente utiliza Co2 como la fase móvil.
Esta es una modalidad híbrida entre la cromatografía d gases y la de líquidos
que se combina, alguna de las mejores características de c as a una de ellas, la
cual permite la separación y determinación de un grupo de compuestos que no
son manipulables convenientemente ni por la cromatografía de gases ni por la
de líquidos.
Los fluidos supercríticos tienen densidades, viscosidades y otras propiedades
que son intermedias entre las características de esa sustancia en estado
gaseoso y en estado líquido.
Comparación de las propiedades de los fluidos supercríticos con las de gases y
líquidos. (Los datos sólo indican el grado de magnitud).

Las propiedades seleccionadas son aquellas que son significativas para la

cromatografía de gases, líquidos y fluidos supercríticos, así como la extracción
de fluidos supercríticos. Una propiedad importante de los fluidos supercríticos,
que está relacionada con sus densidades elevadas (de 0,2 a 0,5 g/cm3), es su
notable capacidad para disolver moléculas grandes no volátiles. Por ejemplo, el
dióxido de carbono supercrítico disuelve fácilmente n- alcanos que poseen entre
5 y 30 átomos de carbono. Una segunda propiedad notable de los fluidos
supercríticos es que los análitos disueltos en ellos pueden ser fácilmente
recuperados por el procedimiento simple de permitir que las disoluciones se
equilibren con la atmósfera a temperaturas relativamente bajas. Otra ventaja de
los fluidos supercríticos es que son baratos, inocuos y no son sustancias tóxicas,
por lo que se pueden dejar evaporar libremente en la atmósfera sin efectos
ambientales dañinos.
La cromatografía de fluidos supercríticos (SFC) es una modalidad híbrida entre
la cromatografía de gases y de líquidos que combina algunas características de
cada una de ellas. Esta técnica es una de los tres tipos importantes de
cromatografía en columna, ésta permite la separación y determinación de
compuestos que no son manipulados ni por la cromatografía de gases ni por la
de líquidos: compuestos no volátiles o térmicamente lábiles para los que la
cromatografía de gases es inaplicable y (2) los compuestos que tienen grupos
funcionales que no son detectables por las técnicas espectroscópicas o el
electroquímicas empleadas en cromatografía de .

 Propiedades de los fluidos supercríticos

La T crítica de una sustancia es la T por encima de la cual no puede existir
en fase líquida independientemente de la presión .
La presión de vapor de una sustancia a su T crítica es su presión crítica.
Una sustancia a T y • por encima de su T y P crítica (punto crítico) se
denominan FLUIDOS SUPERCRITICOS.

 Aplicaciones

La SFC es una herramienta de gran importancia en la separación y

determinación de compuestos para los que las cromatografías de gases o
líquidos no son adecuados :
 Compuestos no volátiles o termolábiles, que descomponen técnicamente
antes de volatilizarse por lo que la cromatografía de gases no se puede
aplicar
 Compuestos sin grupos funcionales que pueden ser detectados mediante
técnicas espectroscópicas o electroquímicas que se emplean en
cromatografía de Líquido

Los fluidos supercríticos son capaces de disolver moléculas grandes no

volátiles.

CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN

La cromatografía de líquidos de alta eficacia es la técnica analítica de separación
más ampliamente utilizada. Las razones son la sensibilidad, su fácil adaptación
a las determinaciones cuantitativas exactas, es ideal para la separación de
especies no volátiles o termolábiles y por su gran aplicabilidad a sustancias que
son de interés en la industria. Algunos ejemplos son: aminoácidos, proteínas,
ácidos nucleicos, hidrocarburos, carbohidratos, fármacos, terpenoides,
plaguicidas, antibióticos, esteroides, especies organometálicas y gran variedad
de sustancias inorgánicas. La fase móvil es un líquido y la fase estacionaria es
una columna que puede ser de acero inoxidable.

La cromatografía líquida de alta resolución se caracteriza por el empleo de una

fase estacionaria constituida por partículas de tamaño muy pequeño. Esto hace
que la eficacia del sistema sea muy elevada proporcionando columnas con un
número muy grande de platos teóricos.
Otra característica importante de la HPCL es la detección continua de los análitos
conforme sus fluidos

 Componentes de un cromatógrafo de líquidos

Un cromatógrafo de líquidos es un instrumento que responde al

siguiente esquema

 Cuentan con una serie de componentes esenciales como el

deposito de disolvente, la bomba de alta presión, el sistema de
inyección la columna, el detector y el registrados (o integrador )
 Tiene componentes necesarios si se quiere llevar acabo una
elucion en gradiente como son depósitos de disolventes, el sistema
de gradiente
 También tienen otros componentes que mejoran el funcionamiento
como el supresor de pulsos, el sistema de control de la T decía
columna, el sistema de control de caudal, el indicador de presión.

CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO

La cromatografía (IEX) De intercambio iónico es una técnica que es de uso

general en la purificación de la biomolécula. Implica la separación de moléculas
en base de su carga.

Esta técnica explota la acción recíproca entre las moléculas cargadas en una
muestra y las mitades opuesto cargadas en la fase del papel de la matriz de la
cromatografía. Este tipo de separación es difícil usando otras técnicas pues la
carga es manipulada fácilmente por el pH del almacenador intermediaro usado.

Dos tipos de separación de intercambio iónico son posibles - intercambio

catiónico e intercambio de aniones. En intercambio de aniones la fase
estacionaria - cargado mientras que en intercambio catiónico está negativo - se
carga positivo.

Principio de la Cromatografía De intercambio iónico

La cromatografía de IEX se utiliza en la separación de biomoléculas cargadas.

La muestra cruda que contiene las moléculas cargadas se utiliza como la fase
líquida. Cuando pasa a través de la olumna de cromatografía, las moléculas
atan a los sitios opuesto cargados en la fase estacionaria.

Las moléculas separadas en base de su carga se enjuagan usando una

solución de variar fuerza iónica. Pasando tal solución a través de la olumna, la
separación altamente selectiva de moléculas según sus diversas cargas ocurre.

La Técnica
Los pasos de progresión Dominantes en el procedimiento de intercambio iónico
de la cromatografía son mencionados abajo:

Una muestra impura de la proteína se carga en la olumna de cromatografía de

intercambio iónico en un pH determinado.

Las proteínas Cargadas atarán a los grupos funcionales opuesto cargados en

la resina

Un gradiente de la sal se utiliza para enjuagar las proteínas separadas. En las

concentraciones poco saladas, las proteínas que tienen pocos grupos cargados
se enjuagan y en concentraciones más altas de la sal, las proteínas con varios
grupos cargados se enjuagan.

Las proteínas y las impurezas Indeseadas son quitadas lavando la columna.

Un gradiente del pH se puede también aplicar para enjuagar las proteínas

individuales en base de su punta isoeléctrica (pI) es decir la punta en la cual los
aminoácidos en una proteína llevan la carga neutral y por lo tanto no emigra en
un campo eléctrico. Pues los aminoácidos son pastas iónicas del zwitter
contienen a los grupos que tienen cargas positivas y negativas. De Acuerdo
con el pH del ambiente, las proteínas llevan una carga positiva, negativa, o de
la nada. En su punta isoeléctrica, no obrarán recíprocamente con las mitades
cargadas en la resina de la olumna y por lo tanto no se enjuagan. Un gradiente
de disminución del pH se puede utilizar para enjuagar las proteínas usando una
resina del intercambio de aniones y un gradiente cada vez mayor del pH se
puede utilizar para enjuagar las proteínas de las resinas del intercambio
catiónico. Esto es porque aumenta el almacenador intermediaro pH de la fase
movible hace la proteína protonated menos (menos positivo - cargado) así que
no puede formar una acción recíproca iónica con negativo - resina cargada,
permitiendo es elución. Inversamente, bajar el pH de la fase movible hará la
molécula protonated (menos negativo charged_, permitiendo su elución.

Selección de la Resina en la Cromatografía De intercambio iónico

Las resinas De intercambio iónico tienen positivo o negativo - los grupos

funcionales cargados covalente conectados a una matriz sólida. Las Matrices
se hacen generalmente de la celulosa, del poliestireno, de la agarosa, y de la
poliacrilamida. Algunos de los factores que afectan a la opción de la resina son
cambiador del anión o de catión, flujo, intercambiador de iones débil o fuerte,
talla de partícula de la resina, y capacidad de enlace. La estabilidad de la
proteína del interés dicta la selección de un anión o de un cambiador de catión
cualquier cambiador puede ser utilizado si la estabilidad es de ningún interés.

Las Aplicaciones de la Cromatografía De intercambio iónico

El Intercambio de iones es el método cromatográfico más ampliamente
utilizado para la separación y la purificación de biomoléculas cargadas tales
como polipéptidos, proteínas, polinucleótidos, y ácidos nucléicos. Su
aplicabilidad dispersa, alta capacidad y simplicidad, y su alta resolución son las
razones dominantes de su éxito como método de separación. La cromatografía
De intercambio iónico es ampliamente utilizada en varias aplicaciones
industriales que son algunos de los cuales como sigue:

Separación y Purificación de los componentes de la sangre

tales como albúmina, factores de incremento recombinantes y enzimas.

Biotecnología - aplicaciones Analíticas tales como control de

calidad y control de procesos operativos

Comida e investigación clínica - estudiar variedades del trigo y

la correlación del proteinuria con diversas enfermedades renales.

Fermentación - las resinas del intercambio catiónico Se utilizan

para vigilar el proceso de fermentación durante la producción de la ß-
galactosidasa.

CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE EXCLUSIÓN

La cromatografía líquida, también conocida como cromatografía de líquidos, es

una técnica de separación y no debe confundirse con una técnica cuantitativa o
cualitativa de análisis. Es una de las técnicas analíticas ampliamente utilizadas,
la cual permite separar físicamente los distintos componentes de una solución
por la adsorción selectiva de los constituyentes de una mezcla. En toda
cromatografía existe un contacto entre dos fases, una fija que suele llamarse
fase estacionaria, y una móvil (fase móvil) que fluye constantemente durante el
análisis, y que en este caso es un líquido o mezcla de varios de ellos. La fase
estacionaria por su parte puede ser alúmina, sílice o resinas de intercambio
iónico que se encuentran disponibles en el mercado. Los intercambiadores
iónicos son matrices sólidas que contienen sitios activos (también llamados
grupos ionogénicos) de carga electrostática (positiva o negativa). De esta
forma, la muestra se fija al soporte sólido por afinidad electrostática.
Dependiendo de la relación carga/tamaño algunos constituyentes de la mezcla
se retendrán con mayor fuerza sobre el soporte sólido que otros, es decir serán
adsorbidos, lo que provocará su separación. Las sustancias que permanecen
más tiempo libres en la fase móvil avanzan más rápidamente con el fluir de la
misma, y las que quedan más unidas a la fase estacionaria o retenidas
avanzan menos y por lo tanto tardarán más en salir o fluir. Éste es el principio
fundamental de la cromatografía. Un ejemplo notable es la cromatografía de
intercambio iónico. Las columnas más utilizadas son las de sílice.
Métodos de cromatografía líquida

Método Abreviatura Mecanismo predominante

Líquido, sólido o de adsorción

LSC Adsorción sobre la superficie

Líquido LLC Reparto entre fases líquidas, una móvil y la otra

estacionaria.

Fase enlazada BPC Reparto y / o adsorción entre las fases móvil y

enlazada.

Afinidad -- Uso de la estructura de ligantes inmovilizados para unir

bioselectivamente la proteína deseada.

Selección de un método de cromatografía líquida

El conocimiento de la estructura molecular de los componentes de la muestra

puede ser muy útil en la selección de un método de cromatografía líquida. A
continuación se da una guía muy general para la selección de un método.

La cromatografía de absorción opera mejor en la separación por clases de

compuestos o para la separación de compuestos isoméricos. La técnica de
cromatografía líquido – líquido es mejor para la separación de homólogos. Los
grupos funcionales que son capaces de formar enlaces de hidrógeno fuertes se
retienen mucho en cromatografía de adsorción; sin embargo la CLL (Líquido –
líquido) proporciona una alternativa para la separación de estos compuestos;
estas serán las muestras que tienen polaridad media.