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Analyseur Sysmex 3-part Diff

SYSMEX Service Center - Accra, GHANA

Principes & Technologies


Sommaire

Principes de
 L’Hémoglobine

 L’Hématocrite

 Comptage des GB-, GR-, PLT

 différentiation en 3 parties

2
L’hémoglobine

La molécule de l’hémoglobine

3
L’hémoglobine

 L’hémoglobine est la
teinte rouge du sang dans le globule rouge
 Protéine contenant du fer
 Présente dans les érythrocytes
 Produite dans les érythroblastes de la moelle
osseuse
 l’Hgb est responsable du transport de l’oxygène et du
CO2
 La molécule de l’Hgb contient deux sous-unités de
chaines, deux chaines a et deux chaines.
Chacune d’elles contient un atome de fer, auquel
l’oxygène peut se lier de façon réversible
4
L’hémoglobine – Gammes de références

Nouveau-nés 14 - 26 g/dl
Enfants 10 - 26 g/dl
25 Femmes 12 - 16 g/dl
Hommes 14 - 18 g/dl
20

15

10

0
Nouveau-nés Bébés Enfants Femmes Hommes

Facteurs de conversion : g/dl g mmol/L x 0.6206


mmol/L g g/dL x 1.611
5
Information générale :
L’Hémoglobine pour la Méthode de Référence (DIN
58931)

 Les Erythrocytes sont lysés dans une dilution de 1:500


 1. Etape de réaction:
l’HBG avec le Fe2+ lié est oxydé par l’hexacyanoferrate de Potassium
(K3(Fe(CN)6) pour devenir du Méthémoglobine (avec le Fe3+).
 2.Etape de réaction:
le Méthémoglobine réagit avec le cyanure de Potassium (KCN),
construisant ainsi le complexe-hémoglobine Cyan rouge et stable avec
une absorption maximale de 546 nm.
 L’extinction au maximum d’absorption est directement proportionnelle à la
teneur en hémoglobone du sang total

Inconvénient: toxique: le cyanure! – +l’élimination du réactif nécessite


Une longue période d'incubation (30 min)
6
Méthode Hb- Sysmex sans cyanure
pour les analyseurs KX-21N et pocH-100i

 Le pocH-pack L ou le Stromatolyser WH (KX-21N)


pour l’analyse de l’hémoglobine et du leucocyte

 Contient des sels d’amonium quaternaire


(MTAC et LTAC)

 Bonne corrélation entre la methode


Sysmex SLS et la méthode de référence

7
Hémoglobine – Méthode sans Cyanure

1. Lyse des globules rouges par des sels ammonium


quaternaires

2. Changement de la conformité

3. Oxydation du Fe2+ au niveau du groupe haeme


(Fe2+ gFe3+)

8
Hémoglobine – Méthode sans cyanure

1. Lyse des GR

Molécule d’hémoglobine

Fe2+   Fe2+ Fe2+   Fe2+


Sels
Fe2+   Fe2+ ammonium Fe2+   Fe2+

RBC GR

9
Hémoglobine – Méthode sans cyanure

2. Changement de la conformité

Molécule d’hémoglobine

Fe2+   Fe2+ Fe2+   Fe2+

Fe2+   Fe2+ Fe2+   Fe2+

GR RBC

10
Hémoglobine – Méthode sans cyanure

3. Oxydation

Molécule d’hémoglobine
O2

Fe2+   Fe2+ Fe3+   Fe3+

Fe2+
Fe2+   Fe2+ Fe2+  

Complexe-méthémoglobine
 Complexe coloumétrique stable– directement proportionnel au HB

11
Photomètre d’hémoglobine

 Analyse photométrique à 555 nm

Flux d’échantillon Cellpack

LED lentille Flow cell photocapteur

12
Measure du HGB –
Graphique du cheminement

Début

La chambre du HGB est rinçée avec du diluant

Le blanc du HGB est déterminé et stocké

Measure de l’échantillon
dans une dilution de 1:500

Echantillon - Blanc = Résultat du HGB

Impression du résultat

Fin
13
Chambre de l’HGB du pocH-100i

Chambre du transduseur

Chambre de mélange

Cell Flow du HGB

14
Méthode de détection par CD

Des impulsions à l’histogramme

15
Méthode de détection par CD

Comptage de particules
● CC = Courant continu
= Principe de l’impédance
= Mesure volumétrique

● Comptage des GB et des 3-parties différentielles


● Comptage des GR
● Comptage des plaquettes

16
Méthode de détection par CC

La différentiation des cellules par taille (volume)

GB GR PLQ

?
MAIS : Comment séparer
3 classes de cellules
Quand la seule information
du volume est utilisée?

17
Méthode de détection par CC

Pour le comptage des GB

Les globules rouges sont lysés!

Ils interfèrent dans la taille

18
Méthode de détection par CC

Les globules rouges et les plaquettes


sont mesurées ensemble dans une même chambre

19
Méthode de détection par CC

Qu’en est-il des globules blancs dans ce


cas?
Note: Les GB sont inclus dans le compte des GR
MAIS : Le nombre des GB est très faible en comparaison du
nombre des GR de sorte que ceci n’est normalemnt pas pertinent
Exception: Leucocytose > 600 x 10^6/µl

20
Principe : Méthode de détection par
Courant Continu

résistance

Courant continu vide


(approx. 100 V)

Électrode externe Électrode interne

ouverture
Globules rouges
échantillon

Becher de l’échantillon
21
Méthode de détection par CC

Orifice Electrode
Électrode
interne
externe

vide

U=RxI

Impulsion 22
Technologie de Sysmex

Avantages et bénéfices

• Convergence hydrodynamique

• Principe absolu

23
Convergence hydrodynamique
pocH 100i seul
Pour les GR & PLQ

Les échantillons passent à travers le milieu de


l’ouverture avec la solution du sheath flow

 La recirculation et le hasard sont empêchés


 Amélioration de la linéarité et de la précision
24
Convergence hydrodynamique
Caractéristiques du HDF

L’échantillon peut être plus concentré avec le HDF:

Dilution
 pocH-100i: RBC/PLT: 1360 fois (WB);
2720 fois (PD)
 Sans le HDF 
KX-21N: RBC/PLT: 25.000 fois (WB et PD)
25
Comment le nombre correct de cellules par
microlitre est-il déterminé?

Deux méthodes sont connues :

Le principe relatif
Comptage de particule par séquence de temps
et calcul par courbe de référence
Le principe absolu
Comptage de particules dans un volume défini 26
Comptage absolu

 Le moyen fiable de compter les particules :

 Volume exact et défini :


 Valverotative d’échantillon (KX-21N)
 Moteur au pas à pas (pocH-100i)

 Le nombre de particules est directement compté dans le


volume défini

27
Comptage absolu

Seringue No.21
(diluant)

Seringue No. 22
(échant.& sheath)
28
Le comptage absolu

NOTE: Une seule ouverture est nécessaire :


● L’état de l’ouverture est vérifié continuellement
• Le temps de comptage du volume défini est surveillé continuellement
• L’état de l’ouverture est par conséquent vérifié avec chaque mesure
• En cas de synchronisation, le temps de comptage augmentera et le message d’erreur
se produira

Avantage :
UNE CALIBRATION REGULIERE N’EST PAS REQUISE

29
Méthodes de détection par CC- Comparaison

Comptage absolu
 Comptage des particules dans un
volume défini Comptage relatif
➢ comptage des particules par
Comtage absolu unité de temps
 Cell concentration is determined
by
➢ Comptage des sample
a known particules
volume and a known
dans un volume
dilutiondéfini ➢ le rythme de comptage est déterminé
indirctement par un échantillon de référence.
Un comportement semblable
➢ La concentration cellulaire est d’échantillon et de calibrateur –
déterminée par un volume et débouchant sur des résultats
une dilution bien connus d’échantillon comparables est observée,
 No calibration of the counting results
Avantageneeded
: Inconvénient :
Surveillance de chaque mesure Une calibration régulière est obligatoire,
Aucune calibration régulière Plus d’une ouverture est nécessaire
n’est nécessaire pour un bon suivi.

30
Méthode de détection par CC

Ouverture

 Vitesse normale de flux


encrassement  Vitesse de flux améliorée

Vide

Les changements au niveau de


l’ouverture (encrassement) auront
d’effet sur le rythme de flux

Principe absolu Principe relatif


Pas d’influence Interférence dans le temps de comptage !
Temps de comptage bien suivi recalibration exigée!

31
Méthodes de détection par CC- Comparaison

Comptage absolu Counting


Absolute Comptage relatif
➢ comptage des particules
 Counting of particles in a defined ➢ comptage des particules par
dans un volume défini
volume unité de temps

➢ le rythme de comptage est


➢ la concerntration cellulaire est
 Cell concentration is determined by déterminé indirectement
détermlinée par un volume et une
a known sample volume and a known par un échantillon de référence.
dilution d’échantillon bien connus
dilution Un compiortement similaire
d’échantillon et de calibrateur–
débouchant sur des résultats
comparables et observé.
Avantage :
Inconvénient :
Suivi de chaque mesure
 No calibration
aucune calibration the counting results La calibration régulière est obligatoire,
of n’est
régulière
needed Plus d’une ouverture est
requise
nécessaire pour un bon suivi

SYSMEX Competition
32
Méthode de détection par CC

Des pulsions à la courbe : diagramme de pulsions

temps 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Hauteur de pulsion
33
Méthode de détection par CC

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

tempss
Diagramme de pulsions
(30 cellules)

Hauteur de pulsions
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Cellules

30

20 Courbe de distribution cumulée

10

34
4 1 0 0 0 1 2 3 4 5 4 3 2 1
Méthode de détection par CC
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Cellules
30

20
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

10 Courbe de distribution
cumulée

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

4 1 0 0 0 1 2 3 4 5 4 3 2 1

Courbe

35
Méthode de détection par CC - Courbe

Des pulsions à la courbe


Courbe de distribution cumulée
3000

Maximum
2500

Courbe 2000

1500

1000

500

0
0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72 78 84 90 96 102 108 114 120

36
Courbe des Erythrocytes (GR)

RL RU

PLQ
GR

25-75 fl 200-250 fl

 Taille des GR : 80-100 fL


 Détection des GR : entre 25 et 250 fL
 Les courbes de distribution sont séparées par des
discriminants flexibles : RL & RU 37
Courbe des érythrocytes (GR)

RL RU

PLQ
GR

25-75 fl 200-250 fl

 La courbe devrait commencer et finir à la ligne de base


entre les discriminants
38
Courbe anormale des érythrocytes (GR)

RL RU
100%

Exemple:
Message RL
PLQ
GR
20%

25-75 fl 200-250 fl

 En cas de courbes anormales, les messages de signaux : RL;


RU ou MP sont générés et les résultats doivent être vérifiés.
39
Courbes des plaquettes (PLQ)

PL PU
100%

PLQ GR

20%

fixé à
2-6 fl 12 fl 12-30 fl
 Taille des PLQ : 8-12 fL
 Détection des PLQ : entre 2 et 30 fL
 Discriminant fixé à 12 fL
40
Courbe anormale des plaquettes (PLQ)

PL PU
Exemple :
Courbe anormale des PLQ
Message PU
100%

PLT RBC

20%

2-6 fl 12-30 fl

 En cas de courbes anormales, les messages des signaux: PL; PU


ou MP sont générés et les résultats doivent être vérifiés

41
Courbe des leucocytes (GB)

WL T1
WU
T2
100%

20%

fixé à
2-6 fl 12 fl 12-30 fl

 Détection des GB : entre 30 et 300 fL


 Les leucocytes sont séparés en trois parties :
lymphocytes, cellules mixtes (mono, eo, baso)
et neutrophiles par les discriminants : T1, T2
42
Courbe des leucocytes (GB)

WL WU
T1 T2
100%

20%

~30 fl -300 fl

 Inconvénient : Sysmex donne la population des neutrophiles en


groupe séparé
 Dans d’autres instruments la population des grandes cellules
comprend les neutrophiles, les éosinophiles et les basophiles 43
Courbe anormale des leucocytes (GB)

WL WU
T1 T2
100%
Exemple :
Courbe anormale des GB
message WL
au cas où les GB
sont résistants à la lyse

20%

~30 fl -300 fl

 La courbe devrait commencert entre les discriminants


inférieur et supérieur à la ligne de base
 Les courbes anormales sont indexées de : WL, WU, T1, T2,
F1, F2  les résultats doivent être vérifiés
44
L’hématocrite (HCT)

 Le ratio (%) du volume total des GR par rapport


au volume de sang total

 Référence: Détermination par centrifugation

 Outre l’hémoglobine, l’hématocrite est un taux


d’anémie

45
Les gammes de références de l’hématocrite

Nouveau-nés 0,51 - 0,65


Enfants 0,35 - 0,43
Femmes 0,38 - 0,48
Hommes 0,42 - 0,52
0,5

0,4

0,3

0,2

0,1

0
Nouveau-nés Bébés Enfants Femmes Hommes

46
Méthode de référence
centrifugation de l’hématocrite

 Détermination du volume des particules corpusculaires


dans le sang
 Normalement, équivalent à la masse érythrocytaire pure
 Le sang est aspiré dans des capillaires spéciaux, lesquels
contiennent de l’héparine asséché

 Les capillaires sont séchés et déposés dans une centrifugeuse


dédiée

 Dans la centri de forte rotation, le sang non coagulant est séparé


en ses parties solides et liquides en utilisant les différents poids
spécifiques du plasma et des particules sanguines
47
Centrifugation de l’hématocrite
Méthode de référence
centrifugation de l’hématocrite

Volume total VT

Centrifugeuse

VT
HCT (%) = (V / VT) x100
V
48
Méthode de référence
Centrifugation de l’hématocrite

1,0
0,9  La lecture est faite sur une échelle
0,8 qui est basée sur le principe des
triangles similaires.
Leucocytes 0,7
 Le guide, qui traverse la frontière
(couche leuco-plaquettaire) 0,6
entre les érythrocytes et la couche
Erythrocytes 0,5 des leucocytes donne la valeur
0,4 hématocrite.
0,3
0,2
0,1
0

49
Hématocrite – Méthode de détection par
hauteur cumulée des pulsions

Mesure volumétrique de chaque cellule

Volume total des globules rouges

Capteur de démarrage

Ph
Transduseur
Ph Hauteur des pulsions
Capteur d’arrêt

50
Hématocrite – Méthode de détection
par hauteur cumulée des pulsions

VT
Ph

Capteur de démarrage
V
Volume définiVT
Capteur d’arrêt
HCT (%) = V / VT x 100
Chambre du transduseur

HCT (%) = (1 / VTk)  Ph x 100

51
Hématocrite – Méthode de détection par
hauteur cumulée des pulsions

Ph = k x VEry VT Volume total


● Calcul : V Volume de tous les GR
VT VEry = (1 / k) x Ph
Ph Hauteur de pulsion
HCT (%) = (V / VT) x 100 k Constante
VEry Volume d’un GR
V =  VEry
V = (1 / k)  Ph
HCT (%) = (1 / VT k)  Ph x 100

● “C” constante :
• Pour ajuster à la référence (reste du plasma dans le volume des GR en mode de centrifugeuse)
• Les changements volumétriques dus au réactif sont compensés
(Le Cellpack est légèrement hypochrome – les GR sont sphériques)

52
Quotients des GR :
Calculs avec les GR, HGB, HCT

Volume Globulaire Moyen (VGM)


HCT (%) x10
VGM (fl) =
GR (x 106/µl)

Taux Cellulaire Moyen d’Hémoglobine (TCMH)


HGB (g/dl) x 10
TCMH (pg) =
GR (x 106/µl)

Concentration Cellulaire Moyenne en Hémoglobine (CCMH)


HGB (g/dl) x 100
CCMH (g/dl) =
HCT (%)
53
Variation Biol. des paramètres du NFS

Déviation de la médiane en %
100
WBC
PLT n = 411 , gamme de confiance 2,5 % à 97,5 %
80 Prise de : R. Haeckel, Rationalisierung des med.
Laboratoriums, 2. Auflage GIT Verlag, Darmstadt

60

40

HGB GR HCT
20
VGM CCMH
TCMH
0 5,0 190 14 4,5 42 90 34 31

-20
103/µl 103/µl g/dl x 106/µl % fl g/dl pg
-40
54
Tableau de mesure du Flux

Dilution pour Dilution pour


Hb & GB GR & PLT

Méthode d’HGB Méthode de Méthode courant


Sans cyanure courant continu continu avec HDF

Courbe des GB Courbe ders GR

Courbe des PLQ

GB, LYM PLQ, PDW, VPM, PLCR


HGB
MXD, NEU GR, HCT, IDR-SD, IDR-CV

VGM, TCMH, CCMH


55
Résumé :
Principes et Technologies

 GR / PLQ / GB : Méthode de détection par CC


 HGB: Analyse photométrique sans cyanure à 555 nm
 HCT: Méthode de détection par hauteur cumulée des pulsions

 Paramètres des GR : GR, HGB, HCT, VGM, TCMH, CCMH, IDR-


SD, IDR-CV
 Paramètres des PLQ : PLQ, IDP, VPM, RP L
 Paramètres des GB : GB, B-SCR, B-MCR, B-LCR, B-SCC, B-
MCC, B-LCC

 3 Courbes: GR, PLQ, GB


 Courbe de signalisation : messages d’erreur suspects
56
Interprétation des courbes

Paramètres-NFS

Courbe des leucocytes


GB Lymphocytes en % et en valeur absolue
Eo, Mono, Baso en % et en valeur absolue
Neutrophiles ien % et en valeur absolue

Courbe des érythrocytes


GR Indice de distribution des érythrocytes

Courbe des thrombocytes


Indice de distribution des thrombocytes
Volume Plaquettaire Moyen

PLQ Plaquettes- Ratio des Grandes Cellules

57
NFS : Gamme des références

Paramètre Sexe Unités Convent. Unités SL


GR Hommes 4,6-6,2 x 106/µl x 1012/l
Femmes 4,2-5,4 x 106/µl x 1012/l

HGB Hommes 14-18 g/dl 8,5-11,0 mmol/l


Femmes 12-16 g/dl 7,5-10,0 mmol/l

HCT Hommes 43-49 % 0,43-0,49 mmol/l


Femmes 36-46 % 0,36-0,46 mmol/l

VGM 85-95 fl
TCMH 27-33 pg 1,68-2,05 fmol
CCMH 32-36 g/dl 19,9-22,4 mmol/l

IDR-SD 37-46 fl (largeur à 20% de la hauteur du pic)


IDR-CV 11-16 % (calculé à partir de la largeur à 60 % de la hauteur du pic)
58