BIOLOGÍA MOLECULAR

TAREA INDIVIDUAL
Nombre del alumno: Maldonado Alvarez Edgar Fernando
Grupo: COMPETENCIA
Fecha: 18/octubre/2019
Cuatrimestre: SEPTIEMBRE - DICIEMBRE 2019 03
Docente: Dr. Emiliano Villordo Pineda

Introducción
Un anticuerpo se define como una inmunoglobulina (Ig) capaz de una combinación
especifica con el antígeno que ha causado su producción en un animal susceptible. Ellos
son producidos en respuesta a la invasión de moléculas foráneas en el cuerpo. Los
anticuerpos existen como una o más unidades en forma de Y, compuesta por cuatro cadenas
polipeptidicas. Son glicoproteínas séricas producidas por unas células denominadas
linfocitos B. Cada Y contiene dos copias idénticas de una cadena pesada (HC, heavy
chain), y dos copias idénticas entre si de una cadena ligera (LC, light chain), (Figura 1.)
llamadas así por sus pesos moleculares relativos que son de aproximadamente 50 kDa la
cadena pesada y 25kDa la cadena ligera.

En esta estructura podemos diferenciar y separar fácilmente sus funciones: por un lado, la
región por la que interacciona con el antígeno (los brazos de la Y o fragmento Fab), y por el
otro, la región que le confiere capacidad efectora (la base de la Y o fragmento Fc). En el
fragmento Fab se encuentran los dominios variable de las cadenas pesadas (HC) y ligeras

Página 1 de 10
(LC), los cuales establecen el contacto directo con el antígeno (Figura 2). Se denominan así
porque en ellos se encuentran la mayoría de las diferencias de secuencia entre los distintos
anticuerpos.

PRODUCCIÓN DE ANTICUERPOS POLICLONALES Y

MONOCLONALES
a) OBTENCIÓN, PURIFICACIÓN Y DETECCIÓN DE
ANTICUERPOS POLICLONALES Y
MONOCLONALES.
Además de servir como modelo de investigación para estudios de función celular, las
células cultivadas se pueden convertir en “fabricas” para la producción de proteínas
especificas. Los anticuerpos son proteínas secretadas por los glóbulos blancos que se unen
con gran afinidad a sus antígenos. Cada linfocito B normal productor de anticuerpo en un
mamífero es capaz de producir un único tipo de anticuerpo que se puede unir a un
determinante o epítopo particular en una molécula de antígeno. Un epítopo es en general
una región pequeña del antígeno, por ejemplo que consiste en solo unos pocos
aminoácidos. Si el animal es inyectado con un antígeno, los linfocitos B que sintetizan
anticuerpos que reconocen al antígeno son estimulados para proliferar y secretar los
anticuerpos. Cada linfocito B activado por antígeno forma un clon de células en el bazo o
en los nodos linfáticos, donde cada célula del clon produce anticuerpos idénticos, es decir

Página 2 de 10
un anticuerpo monoclonal. Debido a que la mayoría de los antígenos naturales
contienen múltiples epítopos, la exposición de un animal a un antígeno suele estimular la
formación de múltiples clones de linfocitos B diferentes, cada uno de los cuales produce un
anticuerpo especifico diferente. La mezcla resultante de anticuerpos a partir de los muchos
clones de linfocitos B que reconocen diferentes epítopos en el mismo antígeno se dice que
es un anticuerpo policlonal. Tales anticuerpos policlonales circulan en la sangre y
pueden aislarse como un grupo.
 Obtención de anticuerpos policlonales:
1. Preparar el antígeno para que induzca una buena respuesta inmune. El antígeno
puede ser de cualquier tipo (proteína, azucares, lisados celulares, de algas, de larvas,
etc.), pero si es de pequeño tamaño debe conjugarse a una proteína para inducir
respuesta. Debe emplearse una dosis adecuada de antígeno, evitándose al máximo la
presencia de impurezas que estimulen la producción de anticuerpos no deseados,
haciéndose necesaria una purificación exhaustiva del antígeno. Por otra parte,
suelen añadirse sustancias adyuvantes que potencian dicha inmunidad, entre los que
se encuentran sales de aluminio, aceites o escualeno.
2. Seleccionar el animal a inmunizar. Suelen emplearse cabras, conejos, caballos, por
su gran tamaño y facilidad de manejo.
3. Utilizar una vía de inmunización adecuada. Subcutánea o intramuscular son las más
utilizadas dado que inducen una mejor respuesta.

Se inmuniza al animal varias veces (con intervalos de 3-4 semanas) con el fin de inducir
memoria inmunológica y una buena producción de anticuerpos específicos, y se
recogen muestras de sangre de forma periódica. Tras la formación del coagulo, se
centrifuga la sangre y se obtiene el suero que contiene los anticuerpos policlonales. Los
sueros pueden conservarse congelados durante largos periodos de tiempo con
preservantes para evitar su contaminación.

Página 3 de 10
  Obtención de anticuerpos monoclonales:

En 1975 los doctores César Milstein y George Köhler desarrollaron una técnica
biotecnológica capaz de generar una célula inmortal con alta capacidad secretora de un
único anticuerpo específico o anticuerpo monoclonal.
De manera similar a la obtención de anticuerpos policlonales, si se desea desarrollar
anticuerpos monoclonales debemos preparar el antígeno para que induzca una buena
respuesta inmune, seleccionar el animal a utilizar e inmunizar a través de una vía adecuada,
generalmente la intraperitoneal, y unos días antes del sacrificio del animal se inmuniza vía
intravenosa.
Durante la obtención de anticuerpos monoclonales se llevan a cabo los siguientes pasos:
1. Inmunización repetida del animal con intervalos de 3-4 semanas. Las
inmunizaciones repetidas permitirán una correcta activación del sistema
inmunitario, y que puedan conseguirse anticuerpos que reconozcan con mayor
fuerza (afinidad) al antígeno inmunizante.
2. Obtener bazo u otro órgano linfoide. El segundo paso es muy distinto al de los
anticuerpos policlonales. A diferencia de estos en los que se recogía el suero
inmune, aquí se emplean las propias células B activadas presentes en órganos
linfoides. Por lo tanto hay que sacrificar al animal y extraer el órgano linfoide de
interés (suele ser el bazo), donde se encuentran las células B activadas.
3. Generación de Hibridomas. Las células B se fusionan con células plasmáticas
tumorales (micloma) en presencia de polietilenglicol (PEG).

Página 4 de 10
4. Selección de los Hibridomas en un medio selectivo con hipoxantina, aminopterina y
timidina que permitirá solo la supervivencia de las células hibridas. El hibridoma
posee las características de sus células parentales: producen un anticuerpo
específico y son inmortales.
5. Posteriormente, se lleva a cabo el estudio de los Hibridomas que secretan el
anticuerpo con la especificidad deseada. para ello, el sobrenadante se analiza frente
a la diana específica mediante técnicas como inmufluorescencia.
6. Cada célula hibrida secretora debe individualizarse en un pocillo, con el fin de
asegurar la monoclonalidad del anticuerpo. Esta célula dará lugar a células hijas
idénticas secretoras (clon), que se pueden mantener en cultivo de forma indefinida o
congelada en presencia de un crioprotector.
7. El anticuerpo monoclonal puede obtenerse directamente del sobrenadante de los
Hibridomas.

Página 5 de 10
 Purificación de anticuerpos monoclonales:
Esta se consigue en el paso 4 anteriormente descrito, el cual consiste en separar, o
seleccionar, las células de hibridoma de las células progenitoras no fusionadas y las
células auto fusionadas generadas por la reacción de fusión. Esta selección suele
realizarse mediante incubación de la mezcla de células en un medio de cultivo
especial llamado “medio de selección”, que permite el crecimiento solo de las
células de hibridoma.

 Detección de anticuerpos monoclonales y policlonales:

Para conocer el nivel de anticuerpos generados se pueden realizar técnicas de

inmunodetección como la inmunofluorescencia, particularmente es ampliamente usada
la microscopia de inmunofluorescencia, ya que puede detectar proteínas específicas en
células fijadas.
La microscopia de inmunofluorescencia se usa para detectar proteínas específicas con
un anticuerpo al cual se ha unido covalentemente un colorante fluorescente. Para
realizar esto, primero se necesita generar anticuerpos contra la proteína específica.
Como parte de la repuesta a la infección del sistema inmunitario de vertebrados se
generan los anticuerpos que como ya se ha dicho, se unen específicamente al agente
infeccioso.
Para usar cualquier tipo de anticuerpo para localizar la proteína, las células o los tejidos
primero se deben fijar para asegurar que todos los componentes permanezcan en el
lugar y la célula permeabilizada le permita la entrada al anticuerpo, por lo general se
realiza mediante incubación de células con un detergente no iónico o extrayendo los
lípidos con un solvente orgánico.
En esta técnica se hace uso de fluorocromos. El fluorocromos se trata de un colorante
fluorescente. Se dice que un químico es fluorescente si absorbe luz a una longitud de
onda y emite luz a una longitud de onda específica y más larga (menor energía).
En general los fluorocromos que se utilizan incluyen rodamina y rojo Texas, que emite
luz roja; Cy3, que emite luz anaranjada y fluoresceína, que emite luz verde (Figura 5.).

Página 6 de 10
Entonces el anticuerpo se une covalentemente al fluorocromo. Cuando un fluorocromo-
anticuerpo se añade a una célula permeabilizada o sección de tejido, el complejo se
unirá al antígeno correspondiente, luego se hará visible cuando sea iluminado por la
longitud de onda exitatoria que corresponde al fluorocromo. La tinción de una muestra
con diferentes colorantes que fluorescen a diferentes longitudes de onda permite
múltiples proteínas, como también al DNA, ser localizados dentro de la misma célula.

b) HIBRIDOMAS Y PRODUCCIÓN DE
ANTICUERPOS MONOCLONALES.

Aunque los anticuerpos policlonales son muy utiles, los anticuerpos monoclonales son
adecuados para muchos tipos de experimentos y aplicaciones médicas cuando se
necesita un reactivo que se una solo a un sitio de una proteina, por ejemplo, uno que
compita con un ligando sobre un receptor de superficie celular.
Para producir anticuerpos monoclonales, primero se necesita ser capaz de cultivar el
clon de linfocito B apropiado. Sin embargo, los cultivos primarios de linfocitos B
normales tienen utilidad limitada para la producción de anticuerpos monoclonales
Página 7 de 10
debido a que poseen una vida media limitada. Por lo tanto el primer paso para producir
un anticuerpo monoclonal es generar células productoras de anticuerpo, inmortales.
Esta inmortalidad se logra al fusionar los linfositos B normales obtenidos de un animal
inmunizado con linfocitos inmortalizados, transformados, llamados celulas de mieloma
que por si solos no sintetizan ni los polipéptidos ligeros ni los pesados que constituyen
todos los anticuerpos.
El tratamiento con ciertas glucoproteinas virales o con polietilenglicol estimula las
membranas plasmáticas de dos celulas para fusionarse, lo que permite que sus citosoles
y orgánulos se entremezclen. Algunas de las celulas fusionadas sufren división y sus
núcleos suelen coalescer, lo que produce células híbridas con un único núcleo que
contiene cromosomas de ambos “progenitores”. La fusión de dos celulas que son
genéticamente diferentes puede producir una célula hibrida con características nuevas.
Por ejemplo, la fusión de una célula de mieloma con una célula normal productora de
anticuerpos del bazo de una rata produce un hibrido que prolifera para dar un clon que
se denomina hibridoma. Al igual que las celulas de mieloma, las celulas de
hibridoma proliferan rápidamente y son inmortales. Cada hibridoma produce el
anticuerpo monoclonal codificado por su linfocito B progenitor.
Los anticuerpos monoclonales se han tornado unos reactivos valiosos como
herramientas de investigación específica. Comúnmente se los utiliza en cromatografía
de afinidad para aislar y purificar proteínas a partir de mezclas complejas.

Página 8 de 10
BIBLIOGRAFÍA:

 Harvey Lodish, Arnold Berk, Chris A. Kaiser, Monty Krieger, Anthony Bretscher,
Hidde Ploegh, Angelika Amon, Matthew Scott, (2013), Biologia Celular y
Molecular, 7ªma edición:pp 104-110.
 Thomas J. Kindt, Richard A. Goldsby, Barbara A. Osbourne, (2007), Inmunología
de Kuby, 6ªta edición: pp-76-86.
 Rocio Vanessa Calderón Pascasio, Inmunoquimica, UNAM, instituto de
biotecnología,
 Lucinda Villaescusa Castillo, Producción de Anticuerpos Monoclonales.
 Nicolás Salcedo Cuevas, Inmunoquimica, Anticuerpos, Fundación Universitaria de
Ciencias de la Salud, catedra de biología.
 Susana magadán, Elina Garet, Leonardo Mantilla, África González Fernández,
Desarrollo de Herramientas Para Inmunodetección: Generación de Anticuerpos
Policlonales y Monoclonales.
 Eduardo Gonzales Dávalos, Anticuerpos Monoclonales.

Página 9 de 10
 LISTA DE COTEJO PARA TAREAS

DATOS GENERALES DEL PROCESO DE EVALUACIÓN

Nombre(s) del alumno(s) y/o Equipo: Firma del alumno(s):
Edgar Fernando Maldonado Alvarez

Producto: Nombre o tema de la Tarea: Fecha:

tarea 1 anticuerpos 18/10/2019
Asignatura: Grupo: Periodo cuatrimestral:
Biología molecular competencia Septiembre-diciembre

Nombre del Docente: Firma del Docente:

Dr. Emiliano Villordo Pineda

INSTRUCCIONES

Revisar las características que se solicitan y califique en la columna “Valor Obtenido” el valor
asignado con respecto al “Valor del Reactivo”. En la columna “OBSERVACIONES” haga las
indicaciones que puedan ayudar al alumno a saber cuáles son las condiciones no cumplidas.
Valor
del Valor OBSERVACIONE
Característica a cumplir (Reactivo)
reactiv Obtenido S
o
Es entregado puntualmente. Hora y fecha solicitada
5%
(indispensable)

5% Presentación (Portada, etc.), Limpieza del trabajo y Ortografía

Desarrollo

5% Claridad de objetivo y Planteamiento del problema

60% Procedimiento y lógica de la solución.

20% Solución correcta

5% Entrega en tiempo y forma

100% CALIFICACIÓN:

Página 10 de 10