UNIVERSIDAD NACIONAL “JORGE BASADRE GROHMANN - TACNA”

FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS

ESCUELA ACADEMICO PROFESIONAL EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

DETECCIÓN DE SALMONELLA
PRACTICA N° 06

MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS II

DOCENTE : Ing. Amelia Castro Gamero

ALUMNO(A) : Lady Cindy Vilcapaza H.

CÓDIGO : 2014-111036

HORARIO : Lunes 8:00 – 10:00 am

TACNA – PERÚ
2016
 INTRODUCCIÓN
Se refiere a un género de la familia Enterobacteriaceae Salmonella. Las bacterias son en forma de
barra, Gram-negativa, asporógeno, principalmente móvil. En todo el mundo Salmonella es uno de
los agentes causales más comunes de intoxicación alimentaria, infectando a la mayoría de los tipos
de alimentos crudos como carne, huevos, productos vegetales. La resistencia bacteriana a un secado
combinado con su alta estabilidad térmica hace que el problema de la protección de los productos
sea incierta.

Para los productos que necesitan una implementación rápida, lo que significa un retraso
significativo. Para cumplir los requisitos de los fabricantes de alimentos realización relativamente
rápida de los productos terminados y reducir el costo de almacenamiento es necesario el uso de
métodos rápidos de detección innovadora de la salmonela. Por lo tanto, los métodos rápidos de
análisis de Salmonella es cada vez de mayor interés. Las pruebas rápidas previstas para este
propósito tienen que ser específica, sensible, conveniente y rentable.
La detección de salmonella es sumamente importante por lo cual es necesario conocer los
principios, métodos y procedimientos para su detección, que serán detalladas en el presente
trabajo.

I. OBJETIVOS
 Investigar la presencia de Salmonella en muestras de alimentos.
 Diferenciar Salmonella y Shigella del género Proteus.
 Estudiar las enterobacterias lactosa negativas, mediante la utilización de medios de cultivo
apropiados y pruebas bioquímicas.

II. FUNDAMENTO TEÓRICO

El género Salmonella pertenece a la familia de las enterobacterias y constituye un grupo muy
complejo de microorganismos patógenos para el hombre, pudiendo afectar a diversos animales.

La Salmonella es un bacilo en forma de bastoncillo, negativa a la tinción de Gram, que puede

causar enfermedades diarreicas en los humanos.

Los miembros del genero salmonella son bacilos gran negativos, de 0.7 – 1.5 x 2- 5um no
fermentadores de lactosa, anaerobios facultativos, no esporulados generalmente móviles por
flagelos peritricos.

Las salmonellas se multiplican bien en medios ordinarios, las salmonellas crecen en un amplio
rango de temperatura de 1 -28ºC y su pH ideal para su crecimiento es entre 6.6-8.2, son incapaces
de tolerar altas concentraciones de sal, y sobreviven en agua congelada durante periodos
prolongados.
2.1 Aspectos generales
2.1.1 Taxonomía
Parte de la familia de las Enterobacteriaceae. De acuerdo con la clasificación moderna
basada en el análisis del ADN, el género Salmonella comprende patógenos para los seres
humanos y de sangre caliente especies animales S. entérica. Esta especie se divide en 6
subespecies. Una subespecie de S. entérica subsp. Enteritidis - el agente causante de la
intoxicación alimentaria. Subespecie entérica subsp S. Typhi, S. entérica subsp. Paratyphi A, B -
patógenos en humanos de fiebre tifoidea, paratifoidea A y B.

2.1.2 Morfología
Células de Salmonella – Es móvil
(gracias flagelos) asporógenos varillas
Gram-negativas rectas (0,5-1h1-3 micras)
con extremos redondeados. También hay
muestras fijadas y cepas. La cápsula no
forma, facultativa oxidativa anaerobia
hemoorganotrofy y el metabolismo
fermentativo. Crece bien en entornos de
nutrientes. En medios densos pueden
formar colonias en la forma R (en bruto) y
en forma de S (liso) de líquido rendimiento
opacidad difusa. Las colonias en la S-forma
de una de tamaño medio, brillante, transparente, con un tinte azulado. Cuando medio rico
hemocultivos mejor líquido es caldo de bilis, con biomateriales de siembra (heces, bilis, orina)
que contienen un caldo adicional flora selenitovy. En medios diferenciales lactosa bacterias
forman colonias incoloras sobre agar de sulfito de bismuto - colonia de color negro.

2.2 Caracterización bioquímica

Salmonella poseen una característica pronunciada de la clase de actividad bioquímica.
Para su identificación es importante tener en cuenta las siguientes propiedades bioquímicas:
1) La fermentación de la glucosa y otros carbohidratos (manitol, maltosa) a gas ácido
(subespecies St yphi asigna sólo el ácido).
2) Ausencia de la fermentación de la lactosa, sacarosa y urea, salicina.
3) Reaccionan con rojo de metilo, producir sulfuro de hidrógeno, Indol (por lo general)
no forma - oxidasa negativa, catalasa, reacción positiva de Voges-Proskauer negativo.
4) La temperatura óptima para el crecimiento - 35 a 37 ° C, el crecimiento se detiene por
completo en 5 ° C; pH óptimo = 07/02 a 07/04.
 Según la clasificación serológica de la gran mayoría de serovares patógenos humanos
(serotipos) de Salmonella se refiere a A, B, C, D y E grupos. Salmonella tipiruyut esquema de
Kauffman-White en la reacción de aglutinación. Formulación se utiliza por su suero hiperinmune o
anticuerpos monoclonales para Salmonella. En el diagnóstico basado serotipificación salmonelosis
y el análisis epidemiológico de agentes patógenos.

2.3 Fuentes y factores de transmisión

La salmonelosis (fiebre tifoidea, paratifoidea,
la gastroenteritis, septicemia, etc.) es
ampliamente transmitida por alimentos
comunes de los animales y los seres
humanos con mecanismo fecal-oral de
transmisión. En los seres humanos, las
enfermedades transmitidas por los
alimentos se acompañan de lesiones del
tracto gastrointestinal y la deshidratación.
Infectar a dosis de 1.000 a 10 mil.

2.3.1 Hábitat Permanente

Los intestinos de los seres humanos y animales de sangre caliente, que son un reservorio
de la infección. Los alimentos contaminados y materias primas, y el agua - la principal fuente de
transmisión y factores. El patógeno pasa el alimento desde los materiales contaminados. El suelo
está implicado en la trayectoria de contacto de la transmisión. La presencia de Salmonella en el
suelo o el agua es siempre evidencia de contaminación de las heces de personas infectadas medio
ambiente o animales - los pájaros, vacas, cerdos, gatos, perros, palomas. Su infección por Salmonella
oscila 6-7 a 80%.

2.3.2 Las principales fuentes de infección

Productos contaminados de aves de corral, carne y productos cárnicos, leche, queso,
mantequilla, frutas y verduras, productos semielaborados, y condimentos (mayonesa, huevo en
polvo, cremas, etc.).
 2.3.3 Las principales fuentes de salmonella.
Alimentos contaminados por bacterias en el proceso de
cocción, el contacto con los medios de comunicación, equipos
industriales, los animales, los vectores (moscas, roedores, animales
domésticos son). La duración de Salmonella viabilidad depende del
tipo de producto y las condiciones ambientales. Por lo tanto, en la
superficie de frutas y verduras bacterias sobreviven 5-10 días en
leche - 20 días, en la cerveza y el kéfir - hasta 2 meses, salchichas,
carne (incluyendo sal), mantequilla - de 2 a 6 meses en el queso - hasta 1 año, la carne congelada -
hasta 2-3 años.

2.4 Patogenia
Es distinta naturaleza de la enfermedad para explicar la multiplicidad de factores de
patogenicidad (endo, exotoxinas, etc.), que no han sido estudiados adecuadamente. Todo virulenta
endotoxina Salmonella productos, induce la fiebre en las personas infectadas (como la temperatura
se eleva a aproximadamente 39 a 40°C). Después de la infección oral, una vez en el intestino
delgado, la Salmonella mucosa intestinal invade y se multiplica en los macrófagos, forman la
principal fuente de infección. Al final del periodo de incubación (10-14 días después de la infección)
una vez en la sangre, Salmonella causa bacteriemia. Los agentes causantes de la fiebre tifoidea y
paratifoidea de sangre extienden por todo el cuerpo, estableciéndose en las células del hígado,
bazo, pulmones, médula ósea, y la vesícula biliar. Al final de la segunda semana del inicio del agente
causal se libera del cuerpo de la paciente con orina, heces, leche materna, saliva. La inmunidad a la
enfermedad no se forma.

2.5 Métodos de detección

Un papel importante lo juega la prevención de la salmonela específica, que consiste en la
realización de la salud animal, medidas higiénicas-sanitarias y anti-epidémicas. Prevención
acompañada de un control permanente del patógeno en los alimentos, piensos, materias primas y
agua.
A. Los medios nutritivos para el aislamiento de Salmonella:

- Agua de peptona tamponada

- Caldo de Tetrationatny
- Agar xilosa-lisina-dezoksiholatny
- Agar verde brillante
- Bismuto-sulfito agar

Los estudios clásicos técnica que utiliza los medios de cultivo de Salmonella. Sin embargo,
debido a que la duración del procedimiento de ensayo para determinar el método clásico de un
patógeno insuficiente.
 B. Alternativas (acelerado)
Métodos para acelerar la detección de Salmonella, una reducción significativa de los
costes laborales y ahorrar recursos, desarrollado, probado y utilizado ampliamente para identificar
el agente causal. Muchas de estas técnicas en la RF oficialmente recomendada y ampliamente
usada.
1) Modificados medios nutrientes
- Agar MSRV
- Salmosyst
- Agar Rambam
- Agar XLT4

2) pruebas rápidas Inmunocromatográfico

- Singlepath ® -Salmonella.

3) el análisis de PCR en tiempo real

- Foodproof de Salmonella

4) patógeno molecular sistema de detección

- 3M Molecular del Sistema de Detección ( MDS).

5) para la detección de Salmonella petrifilm

- 3M ™ Petrifilm de Salmonella expreso del Sistema (3M ™ Petrifilm ™ SALX)

Los métodos rápidos pueden significativamente (durante 24-48 horas) reducir la duración
de los estudios. Con alta sensibilidad, que proporcionan una detección fiable de Salmonella en el
material analizado.

III. EQUIPOS Y MATERIALES

 Frasco con 225ml de caldo peptonado bufferado o caldo lactosado.
 Tubos con 10ml de caldo de enriquecimiento selenito-cistina
 Tubos con 10ml de caldo de enriquecimiento tetrationato seg. MULLER-KAUFFMANN
 Placas con Agar SS (salmonella shigella), o agar bismuto – sulfito seg. WILSON BLAIR.
 Placas con agar BPL (agar verde brillante - rojo fenol- lactosa seg. KAUFFMANN).
 Tubos con agar hierro tres azucares TSI.
 Tubos de solución salina (0.85% NaCl).
 Antisuero polivalente 0 (somático)
 Pipetas de 10ml
 Portaobjetos para la prueba serológica.
  Asas y agujas de inoculación.
 Baño de agua caliente regulada a 43 (+/- 0.1°C) o incubadora regulada a 35-37°C.

IV. PROCEDIMIENTO
Los métodos para el aislamiento de salmonella se consideran en los siguientes pasos.

1. Enriquecimiento no selectivo:
Pesar 25g de muestra, sembrar 225ml de caldo de enriquecimiento caldo peptonado
bufferado o alternativamente en 225ml de caldo lactosado. Incubar a 35-37ºC por 16-24 horas. Este
paso es indispensable para alimentos desecados y liofilizados.

2. Enriquecimiento selectivo:
Llevar 1ml del cultivo anterior a 10ml de caldo de enriquecimiento selenito y a 10ml de caldo
de enriquecimiento de tetrationato seg. MULLER y KAUFFMANN. Incubar a 43ºC por 24horas. O
suspender directamente en 100ml de caldo tetrationato unos 10g del material objeto de
investigación, incubar a 43ºC durante 18-24horas a 37ºC durante 48horas.

3. Aislamiento de placas de agar selectivo:

Partir de los cultivos de incubados realizar siembras por estrías sobre agar BPL y sobre agar
SS. Incubar a 35-37ºC el agar BPL durante 24horas y el agar SS 18-24horas a 37ºC.
 Examinar las placas:

El agar BPL las colonias sospechosas

de salmonella son incoloras de un color
intermedio entre rosa y el fucsia o entre
traslucidos y opacas y el medio que los
rodea varía entre rosáceo a rojo.

En el agar SS son incoloras y

transparentes o transparentes con centro
negro. En el agar bismuto sulfito son pardas,
grises y negras y presentan a veces un brillo
metálico, el medio que las rodea es por lo
general oscuro al principio volviéndose más
tarde negro a medida que aumenta el
periodo de incubación.

a. Pruebas bioquímicas:
Elegir dos o más colonias sospechosas de cada placa. Si se trabaja con agar BPL y agar
bismuto sulfito, purificar en placas con agar MAC MONKEY. Sembrar en agar nutritivo inclinado.
Incubar a 35- 37ºC por 24horas. Comprobar la dureza de los cultivos mediante la coloración
gran, realizar prueba TSI. Si se trabaja con el agar BPL y SS, realizar directamente la prueba TSI
y demás pruebas bioquímicas.

Prueba TSI:
Degradación lactosa, sacarosa, glucosa, producción de gas y H2S; en el medio de
cultivo en tubos de agar inclinado de hierro de tres azucares, el cual se inocula por
puntura y estría se incuba a 35-37ºC por 24horas.

Prueba lía:
Agar hierro lisina, si es morado es salmonella.

Prueba ureasa:
Si sale positivo es Proteus, ya que es el único capaz de consumir urea.
 Reacciones positivas para TSI:
 Parte inclinada: reacción alcalina (color rojo), lactosa y sacarosa negativa.
 Parte columnar: reacción acida (color amarillo), glucosa positivo con o sin producción
de H2S.

b. Prueba serológica:
Técnicas para la reacción con el antisuero polivalente o somático en portaobjetos.

1. Ensayar primero el antisuero con cultivos testigos a fin de comprobar su eficacia.

2. Usando un marcador de vidrio dividir la lámina portaobjetos en dos secciones de
1x2cm.
3. Depositar una pequeña cantidad de cultivo joven en agar nutritivo en la parte
superior de cada una de las secciones marcadas.
4. Depositar una gota de una de una solución de cloruro de sodio al 0.85% estéril en la
parte inferior de cada sección marcada. Con una aguja de inoculación estéril
emulsificar el cultivo con la solución salina en cada una de las secciones.
5. Añadir una gota de antisuero Salmonella polivalente 0 a uno de los cultivos
emulsificados y mezclar con un asa o aguja estéril.
6. Imprimir al portaobjetos movimientos de balance adecuados durante 1 minuto hasta
conseguir la mezcla completa.
7. Observar la reacción sobre un fondo oscuro.

a. Si se produce una aglutinación en la mezcla cultivo-solución salina-suero y

en la mezcla cultivo solución salina se considerara como prueba positiva.
b. Se considerara como prueba negativa si se produce aglutinación en la
mezcla cultivo – solución salina. Estos cultivos deberán probarse con
antisuero polivalente H (flagelar).
c. Se considerara no especifico sino produce aglutinación n ambas mezclas. En
este caso será necesario recurrir a las pruebas adicionales descritas por
EDWARDS y EWING 1972.

V. RESULTADOS
1.-En Caldo Tetrationato.
2.-En Agar BPLS

3.- En Agar SS

4.-Pruebas bioquímicas:
TSI LIA Caldo úrea

Prueba TSI:
Es muy importante, en agar hierro 3 azucares, si adopta los colores como se muestra en la
imagen es casi seguro que es salmonella.

Prueba lía:
Agar hierro lisina, si es morado es salmonella.

Prueba ureasa:
Si sale positivo es Proteus, ya que es el único capaz de consumir urea.
 VI. CONCLUSIONES
La detección de salmonella es muy importante en la industria de alimentos, ya que es uno de los
agentes causales más comunes de intoxicación alimentaria, por lo cual el análisis microbiológico en
el proceso de alimentos es necesario, reduciendo así la contaminación por agentes patógenos como
lo es la salmonella.

Muchos alimentos, sobre todo los de origen animal o contaminados con aguas residuales, han
servido como vehículos en brotes de salmonelosis. Uno de los principales reservorios de Salmonella
es la carne de aves de corral. La contaminación de las pieles de pollo y otra a veces procede del
tracto intestinal o del material fecal de los animales que manchan sus patas y plumas. Las etapas
críticas de la contaminación de las pieles aviares están en el desplumado y la evisceración
principalmente. Es muy corriente la contaminación cruzada a través de las manos de los operarios,
equipo y utensilios utilizados en la preparación y troceado de las pieles.
La mayoría de los brotes de salmonella se deben a la ingestión de carnes poco o mal cocinadas o
contaminadas posteriormente a su preparación como lo pudimos observar en el pollo asado, tal vez
su cocción no fue la adecuada o se contamino por contaminación cruzada, al contacto con pollos
que no habían sido cocinados aun.

Para ello el método permite aislar en placas en medio como SS y BPLS incubados a 37°C por 24hrs,
luego poder identificar si existe presencia de salmonella. Luego las colonias sospechosas se someten
a pruebas bioquímicas, como TSI, LIA, Ureasa, necesarias para poder distinguir Proteus de
salmonella. Cabe indicar que Salmonella es lactosa negativa, sacarosa positiva y glucosa positiva.

Para diferentes tipos de alimentos, existen distintas formas para el aislamiento de Salmonella, todos
ellos son esencialmente similares en principio y emplean las etapas de preenriquecimiento,
enriquecimiento selectivo, aislamiento en medios de cultivos selectivos y diferenciales,
identificación bioquímica y confirmación serológica de los microorganismos.

VII. RECOMENDACIONES
 Necesario hacer las pruebas bioquímicas si es que existe sospecha de salmonella.
 El tiempo y temperatura debe ser bien controlado para obtener resultados confiables.
 El procedimiento debe ser realizado cuidadosamente evitando derrames, salpicaduras.

VIII. CUESTIONARIO
¿Cuáles son los principales géneros de enterobacterias lactosa negativas que se desarrollan en
los alimentos y en cuáles?

 Salmonella
 Shigella
 Proteus

Se les puede encontrar en los siguientes alimentos:

- carne (vacuno, cerdo, pollo),
- productos cárneos (jamón, salame, vienesas),
- ensaladas (papas, porotos verdes, jamón, pollo),
- productos de pastelería (cremas) y
- productos lácteos (queso, queso de cabra, etc.).

¿Mediante qué pruebas bioquímicas se pueden diferenciar Proteus de Salmonella y Shigella en el

agar SS?
En pruebas bioquímicas de agar TSI LIA y ureasa.

¿Qué enfermedades puede causar Salmonella en el ser humano?

Puede causar salmonelosis, es una enfermedad diarreica causada por la bacteria salmonella. La
bacteria vive en el intestino humano o animal y se transmite a otras personas por el contacto con
heces contaminadas. Los casos más comunes de salmonelosis se dan por comer alimentos de origen
animal contaminado: pollo, huevos, carne vacuna, leche. Pero también las verduras pueden estar
contaminadas con esta bacteria. Las mascotas también pueden estar infectadas y transmitir la
infección al entrar en contacto con ellas. Son especialmente portadores los reptiles (tortugas,
lagartos, serpientes) y los pájaros.

Otra de las enfermedades es la fiebre tifoidea, es una infección que causa diarrea y una erupción
cutánea. Es causada más comúnmente por un tipo de bacteria llamada Salmonella typhi, esta
bacteria se propaga a través de alimentos, agua o bebidas contaminadas. Si se come o bebe algo
que esté contaminado, las bacterias ingresan al cuerpo. Viajan hacia el intestino y luego hacia el
torrente sanguíneo. En la sangre, viajan a los nódulos linfáticos, la vesícula, el hígado, el bazo y otras
partes del cuerpo. La fiebre tifoidea y paratifoidea de sangre extienden por todo el cuerpo,
estableciéndose en las células del hígado, bazo, pulmones, médula ósea, y la vesícula biliar. Algunas
personas pueden convertirse en portadores de la bacteria Salmonella typhi y continuar expulsando
la bacteria en sus heces por años, diseminando la enfermedad.

¿Qué características poseen las colonias de Salmonella en el agar SS?

En el agar SS son incoloras y transparentes o transparentes con centro negro.

¿Qué otros agares se utilizan para el reconocimiento de Salmonella?

El BPLS, aquí las colonias sospechosas de salmonella son incoloras de un color intermedio entre rosa
y el fucsia o entre traslucidos y opacas y el medio que los rodea varía entre rosáceo a rojo. Entre
otros tenemos, Agar Campy con sangre, Agar HE, Agar desoxicolato-citrato (ADC)

¿Qué indican las normas sobre la presencia de Salmonella para un producto alimenticio
terminado?
De acuerdo con las normas internacionales y al Reglamento Sanitario de los alimentos la sola
presencia de Salmonella en un alimento es considerada como causa de rechazo.
 Si detectamos salmonella en un producto acabado nos indica que este alimento ha tenido contacto
con heces fecales durante el proceso de este alimento o en la cosecha y cultivo de algunos de sus
ingredientes.

IX. BIBLIOGRAFÍA
 Bourgeois C.M. Microbiología Alimentaria. Editorial Continental S.A.1995.
 Frazier, W.C. Microbiología de los alimentos .Ed. Acribia. España 2000.
 Mossel.D.Microbiología de los alimentos. Ed. Acribia. España 2000.
 DIFCO Manual de medios de cultivo. Ed. Difco.
 MERCK. Manual de medios de cultivo Ed. Merck, Alemania.
 Ministerio de Salud DIGESA. Manual de Análisis Microbiológico de Alimentos.
 FAO-ONU- Manuales para el control de calidad de Alimentos para la agricultura y la
Alimentación. Roma